Vista regulatory t cell mediator protein, vista binding agents and use thereof

PROTEÍNA MEDIADORA DE CÉLULA T REGULATORIA VISTA, AGENTES DE ENLACE DE VISTA Y USO DE LOS MISMOS

Introducción

Esta solicitud reivindica prioridad al núm. de serie de Estados Unidos 12/732,371 presentada el 26 de marzo de 2010, núm. provisional de Estados Unidos 61/390,434 presentada el 6 de octubre de 2010; núm. provisional de Estados Unidos 61/436,379 presentada el 26 de enero de 2011 y núm. provisional de Estados Unidos 61/449,882 presentada el 7 de marzo de 2011. Todas estas solicitudes se incorporan como referencia en su totalidad.

Esta solicitud se relaciona con que descubrimos, caracterizamos y definimos funcionalmente un nuevo ligando, inhibidor de la superfamilia-lg, estructuralmente distinto, hematopoyéticamente restringido designado como Supresor de la Activación de células T que contiene la región V de la Inmunoglobulina (VISTA, por sus siglas en inglés) o PD- L3. El dominio extracelular tiene homología con el ligando PD-L1 de la familia B7, y VISTA como PD-L1, tienen un profundo impacto sobre la inmunidad. Sin embargo, a diferencia de PD-L1, la expresión de VISTA es exclusivamente dentro del compartimiento hematopoyético. La expresión es más prominente en las células mieloides presentadoras de antígeno (APC), aunque la expresión también es de gran interés en células T CD4+ y en un subconjunto de células T reguladoras de Foxp3+ (Treg). Una expresión de VISTA o una proteína soluble de fusión VISTA-lg en las APC, inhibe potentemente la proliferación in vitro de células T, producción de citoquinas e induce la expresión de Foxp3 en células T. Por el contrario, un anticuerpo monoclonal anti-VISTA recién desarrollado interfirió con la supresión inmune inducida por VISTA de las respuestas in vitro de células T en las APC VISTA+. Además, el anti-VISTA intensificó in vivo el desarrollo de la encefalomielitis alérgica experimental enfermedad autoinmune mediada por células T (EAE), y facilitó el desarrollo de una respuesta inmune de protección, tumorespecífica con la posterior remisión del tumor. Los estudios iniciales de ratones VISTA-/- revelan los primeros indicios de la enfermedad inflamatoria espontánea, y

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U1 determinarán su destino patológico final. A diferencia de todas las otras moléculas asociadas al ligando-PD (por ejemplo,

B7-H3, H4, H6), la restricción hematopoyética de VISTA junto con sus actividades represivas profundas y características estructurales únicas, ilustran que VISTA es un regulador negativo central de la inmunidad, nuevo, funcionalmente no redundante restringe principalmente a mieloide.

cuya expresión se

Antecedentes de la invención

La inducción de una respuesta inmune requiere la expansión, diferenciación, contracción de células T, y el establecimiento de células T de memoria. Las células T deben encontrar las células presentadoras de antígenos (APCs) y comunicarse a través de las interacciones con el receptor de células T (TCR)/complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) en las APC. Una vez que se establece la interacción TCR/MHC, se requieren otros conjuntos de contactos de receptor-ligando entre las células T y el APC, es decir, la co-estimutación a través de CD154/CD40 y CD28/B7.1-B7.2. La sinergia entre estos contactos se sugiere para dar lugar, in vivo, a una respuesta inmune productiva capaz de depurar los agentes patógenos y tumores, y en algunos casos capaces de inducir autoinmunidad.

Se identificó otro nivel de control, es decir, las células T reguladoras (Treg). Este subconjunto específico de células T se genera en el timo, libera en la periferia, y es capaz de un control constante e inducible de las respuestas in vitro e in vivo de células T (Sakaguchi (2000) Cell 101(5):455-8; Shevach (2000) Annu.

Rev.

Immunol. 18:423-49; Bluestone y Abbas (2003) Nat. Rev. Immunol. 3(3):253-7). Las Treg se representan por un fenotipo CD4+CD25+ y expresan también altos niveles de linfocitos T citotóxicos asociados al antígeno-4 (CTLA-4), OX-40, 4-1BB y la proteína asociada al receptor TNF inducible por glucocorticoides (GITR) (McHugh otros (2002) Immunity 16(2):311-23; Shimizu, y otros (2002) Nat. Immun. 3(2): 13542). La eliminación de las células Treg al 5 día de la timectomía neonatal o el agotamiento de anticuerpos usando anti-CD25, resultan en la inducción de la patología autoinmune y exacerbación de las respuestas de las células T para antígenos foráneos y auto-antígenos, incluyendo las respuestas antitumorales

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en aumentadas (Sakaguchi, y otros (1985) J. Exp. Med. 161(1 ):72-87; Sakaguchi, y otros (1995) J. Immunol. 155(3): 1151-64; Jones, y otros (2002) Cáncer Immun. 2:1). Además, las Treg se involucraron también en la inducción y conservación de la tolerancia del trasplante (Hara y otros (2001) J. Immunol. 166 (6): 3789 - 3796; Wood y Sakaguchi (2003) Nat. Rev. Immunol. 3: 199-210), ya que el agotamiento de las Treg con los anticuerpos monoclonales anti-CD25 resultaron en la ablación de la tolerancia del trasplante y rápido rechazo del injerto (Jarvinen, y otros (2003) Transplantation 76: 1375-9). Entre los receptores expresados por las Treg, el GITR parece ser un componente importante ya que la ligación in vitro o in vivo de GITR en la superficie de las Treg con un anticuerpo monoclonal agonista resulta en la terminación rápida de la actividad de Treg (McHugh, y otros (2002) arriba; Shimizu, y otros (2002) arriba), resultando también en patología autoinmune (Shimizu, y otros (2002) arriba) y ablación de la tolerancia del trasplante.

Los ligandos y receptores co-estlmuladores y co-inhibidores no sólo proporcionan una “2da señal” para la activación de células T, sino también una red equilibrada de la señal positiva y negativa para maximizar las respuestas inmunes contra la infección al limitar la autoinmunidad. Los ligandos co-estimuladores *

mejores caracterizados son B7.1 y B7.2, que se expresan por las APC profesionales, y cuyos receptores son CD28 y CTLA-4 (Greenwald, R. J., Freeman

G. J., y Sharpe, A. H. (2005). Annu Rev Immunol 23,515-548; Sharpe, A.H

Freeman, G. J. (2002) Nat Rev Immunol 2, 116-126). La CD28 se expresa por células T vírgenes y activadas y es crítica para la activación óptima de células T. A diferencia, CTLA-4 se induce después de la activación de células T e inhibe la activación de células T mediante la unión a B7.1/B7.2, afectando así la coestimulación mediada por CD28. La CTLA-4 también transduce ia señalización negativa a través de su motivo citoplasmático ITIM (Teft, W. A., Kirchhof, M. G.

Madreñas, J. (2006). Annu Rev Immunol 24,65-97; Teft, W. A., Kirchhof, M. G.

Madreñas, J. (2006).Annu Rev Immunol 24,65-97. Los ratones KO los B7.1/B7.2 se afectan en la respuesta inmune adaptativa, Borriello, F., Sethna, Μ. P, Boyd, S. D

Schweitzer, A. Ν.,ΤίνοΙ, E. A., Jacoby, D., Strom, T. B., Simpson, E. M., Freeman

G. J., and Sharpe, A. H.(1997)) Immunity 6, 303-313; Freeman, G. J., Borriello, F„

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Hodes, R. J„ Reiser, H.,Hathcock, K. S., Laszlo„G„ McKnight, A. J„ Kim, J„ Du, L„ Lombard, D. B., y otros (1993). Science 262,907-909), mientras que los ratones KO CTLA-4 no pueden controlar adecuadamente la inflamación y el desarrollo de las * enfermedades autoinmunes sistémicas (Chambers, C. A., Sullivan, T. J., y Alllson, I.

P. (1997) Immunity 7, 885-895; Tivol, E. A., Borriello, F., Schweitzer, A. N., Lynch

W. P„ Bluestone, J, A., y Sharpe, A. H. (1995) Immunity 3, 541-547; Waterhouse,

P., Penninger, J. M., Timms, E., Wakeham, A., Shahinian, A.

Lee, K. P.

Thompson, C B., Griesser, H., y Mak ,T. W. (1995). Science 270,985-988.

Los ligandos de la familia B7 se ampliaron para incluir a los co-estimuladores B7-H2 (ligando ICOS) y B7-H3, así como los co-inhibidores B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H4 (B7S1 o B7x) y B7-H6 Brandt, C. S„ Baratin, M„ Yi, E. C„ Kennedy, J„ Gao, Z„ Fox, B., Haldeman, B., Osuander, C. D„ Kaifu, T„

Chabannon, C„ y otros (2009) J Exp Med 206, 1495-1503; Greenwald, R. J.

Freeman, G. J„ y Sharpe, A. H. (2005) Annu Rev Immunol 23, 515-548.

La molécula co-estimuladora inducible (ICOS) se expresa en células T activadas y se une a B7-H2 Yoshinaga, S. K„ Whoriskey, J. S„ Khare, S. D., Sarmiento, U„ Guo, J., Horan, T„ Shih, G., Zhang, M„ Coccia, M. A., Kohno, T., y otros (1999). Nature 402, 827-832. ICOS es importante para la activación diferenciación y función de células T, así como esencial para la activación de células B inducidas por las células T-auxiliadoras, intercambio de clases de Ig, y formación del centro germinal (GC) Dong, C„ Juedes, A.E., Temann, U. A., Shresta, S., Allison, J. P„ Ruddle, N. H., y Flavell, R. A. (2001) Nature 409, 97-101;

Tafuri, A, Shahinian, A., Bladt, F., Yoshinaga, S. K., Jordana, M., Wakeham, A.

Boucher, L. M„ Bouchard, D„ Chan, V. S„ Duncan, G„ y otros (2001) Natura 409, 105-109; Yoshinaga, S. K., Whoriskey, J. S„ Khare, S. D., Sarmiento, U„ Guo, J., Horan, T., Shih, G., Zhang, M„ Coccia, M. A., Kohno, T., y otros (1999) Natura 402,827-832. Por otra parte, la muerte programada 1 (PD-1), regula negativamente las respuestas de células T. Los ratones KO PD-1 desarrollan la enfermedad autoinmune similar a lupus, o miocardiopatía dilatada autoinmune en función de los antecedentes genéticos Nishimura, H„ Nose, M., Hiai, H., Minato, N., y Honjo, T. (1999) Immunity 11, 141-151. Nishimura, H„ Okazaki, T„ Tanaka, Y., Nakatani, K.,

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en

Hara, M., Matsumori, A., Sasayama, S., Mizoguchi, A., Híai, H., Minato, N., y Honjo, T. (2001) Science 291, 319-322. La autoinmunidad resulta más probablemente de la pérdida de señalización tanto del ligando PD-L1 como PD-L2. Recientemente, el CD80 se identificó como un segundo receptor para PD-L1 que transduce las señales inhibidoras en las células T Butte, M. J., Keir, Μ. E., Phamduy, T. B., Sharpe, A. H., y Freeman, G. J. (2007) Immunity 27,111 -122. El receptor para B7H3 y B7-H4 se desconoce aún.

Los ligandos co-estimuladores mejores caracterizados son B7.1 y B7.2 y pertenecen a la superfamilia de Ig que se compone de muchos reguladores inmunes críticos, tales como los ligandos y receptores de la familia B7. Los miembros de la superfamilia de ig se expresan en las células presentadoras de antígeno profesionales (APC), y sus receptores son CD28 y CTLA-4. El CD28 se expresa por las células T vírgenes y activadas y es crítico para la activación óptima de células T. A diferencia, el CTLA-4 se induce después de la activación de células T e inhibe la activación de células T mediante la unión a B7.1/B7.2, afectando la co-estimulación mediada por CD28. Los ratones knockout (KO) B7.1 y B7.2 se afectan en la respuesta inmune adaptativa, mientras que los ratones KO CTLA-4 no pueden controlar adecuadamente la inflamación y desarrollo de las enfermedades autoinmunes sistémicas. Con el tiempo los ligandos de la familia B7 se ampliaron para incluir ligandos co-estimuladores tales como B7-H2 (ligando ICOS) y B7-H3, y ligandos co-inhibidores tales como B7-H1 (PD-L1), B7DC (PD-L2), B7-H4 (B7S1 o B7x), y B7-H6. Como consecuencia, se identificaron receptores adicionales de la familia CD28. ICOS se expresa en células T activadas y se une a B7-H2. ICOS es un co-regulador positivo, importante para la activación, diferenciación y función de células T. Por otra parte, la muerte programada 1 (PD-1) regula negativamente las respuestas de células T. Los ratones KO PD-1 desarrollaron enfermedad autoinmune similar a lupus, o con cardiomiopatía dilatada. A diferencia de VISTA (la molécula inmunosupresora que es el foco de la presente invención), los dos ligandos inhibidores de la familia B7, PD-L1 y PD-L2, tienen distintos patrones de expresión. PD-L2 se expresa por inducción en DCs y macrófagos, mientras que PD-L1 se expresa ampliamente tanto en células £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL hematopoyéticas como tipos celulares no hematopoyéticos. Consistente con el papel inmunosupresor del receptor PD-1, los estudios que usan ratones PD-L1 -/- y PD-L2 -/- mostraron que ambos ligandos han superpuesto funciones en la inhibición de la proliferación de células T y producción de citoquinas. La deficiencia de PD-L1 mejora la progresión de la enfermedad tanto en el modelo de diabético no obeso (NOD) de la diabetes autoinmune como el modelo murino de esclerosis múltiple (encefalomielitis autoinmune experimental; EAE). Las células PD-L1 -/- producen niveles elevados de citoquinas proinflamatorias en ambos modelos de la enfermedad. Además, los estudios en ratones NOD demostraron que la expresión tisular de PD-L1 (es decir, dentro de páncreas) contribuye excepcionalmente a su capacidad de controlar regionalmente la inflamación. El PD-L1 se expresa altamente también en los sincitiotrofoblastos de la placenta, que controlan críticamente las respuestas inmunes maternas al feto alogénico.

Teniendo en cuenta el fuerte impacto de esta familia de moléculas en la regulación de la inmunidad, esfuerzos sustanciales en los modelos de cáncer en murinos mostraron que seleccionando esta familia de moléculas se puede inducir la inmunidad antitumoral protectora. Los estudios que involucran a anti-CTLA-4 documentaron el beneficio terapéutico mejorado en modelos murinos y ensayos clínicos de melanoma. Los ratones vacunados con B 16-GM-CSF (Gvax) promueven el rechazo de melanomas B 16 cuando se combina con anticuerpos bloqueados de CTLA-4.

Los anticuerpos contra PD-1, así como PD-L1 documentaron también inmunidad anti-tumoral y supervivencia del huésped mejorada en una amplia variedad de modelos de tumores murinos. Finalmente, aunque CTLA-4 y PD-1 pertenecen a la misma familia de moléculas co-inhibidoras, la evidencia sugiere que usan distintos mecanismos no repetitivos para inhibir la activación de células T, y cuando se usan en combinación existe sinergia en la capacidad de anti-CTLA-4 y anti-PD-1/L1 para mejorar la supervivencia del huésped en el melanoma murino.

Basado en lo anterior, la elucidación de otro nuevo miembro de la familia tipo B7 y ligandos y moduladores de éstos sería útil teniendo en cuenta el Importante o

en

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en papel de estos miembros de la familia en la regulación de la inmunidad especialmente la inmunidad de células T.

Sumario de la invención

La presente invención se relaciona con los métodos terapéuticos que modulan la actividad y/o que se unen o bloquean específicamente la unión de una proteína específica de células T reguladoras a su contrarreceptor. Esta proteína, denominada PD-L3 o VISTA, es un ligando inhibidor de la superfamilia-lg, nuevo y estructuralmente diferente, cuyo dominio extracelular tiene homología con el ligando PD-L1 de la familia B7. Esta molécula se refiere indistintamente en la presente descripción como PD-L3 o VISTA o como supresor de la activación de células T con dominio-V de inmunoglobulina (VISTA). VISTA se expresa principalmente dentro del compartimento hematopoyético y está muy regulada en las APC mieloides y células T. La intervención terapéutica de la vía inhibitoria

VISTA representa un nuevo enfoque para modular la inmunidad mediada células T en el tratamiento de una amplia variedad de cánceres.

por

La presente invención se relaciona en particular con el uso de anticuerpos específicos a VISTA o PD-L3 para tratar cánceres específicos incluyendo cáncer de vejiga, cáncer de ovario, y melanoma.

Además, la presente invención se relaciona en particular con el uso de las proteínas de PD-L3 o VISTA, especialmente proteínas multiméricas VISTA vectores virales (por ejemplo, adenovirus) que se expresan para tratar las mismas afecciones en donde la inmunosupresión es terapéuticamente deseada, tales como alergia, autoinmunidad y afecciones inflamatorias.

Como se describe más abajo, la expresión de VISTA parece ser exclusiva del compartimiento hematopoyético y esta proteína es altamente expresada en células mieloides maduras (CD11b^bri9ht), con niveles de expresión inferiores en células T CD4 , T^reg y células T CD8⁺. Las proteínas VISTA solubles, por ejemplo la proteína de fusión VISTA-lg soluble, o la expresión de VISTA en las APC, suprime la proliferación in vitro de células T CD4⁺ y CD8⁺ y la producción de £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL citoquinas. También se observó que anticuerpos anti-VISTA, por ejemplo, un AcM antí-VISTA (13F3) bloqueó in vitro la supresión de las respuestas de células T inducida por VISTA en las APC VISTA*. Además, se descubrió que un AcM antiVISTA exacerbó EAE y aumentó in vivo ta frecuencia de Th17s encefalitogénicas. Aún más, como se describe en detalle más abajo, se encontró que un AcM antiVISTA induce la remisión del tumor en múltiples (4) modelos de tumores murinos. La expresión de VISTA en células supresoras derivadas de mieloides (MDSC) en estos modelos es extremadamente alta, lo que sugiere que MDSC VISTA* suprime la inmunidad específica del tumor. Como se muestra en la presente descripción

VISTA ejerce actividades inmunosupresoras en las células T tanto in vitro como in vivo en ratón y en seres humanos (sólo in vitro) y es un mediador importante en el control del desarrollo de la autoinmunidad y la respuesta inmune al cáncer.

Específicamente, los datos muestran que:

(1) VISTA es un nuevo miembro de la superfamilia de Ig y contiene un dominio Ig-V con similitud de secuencia distante a PD-L1. Describimos en la presente invención que cuando se produce como una proteína de fusión de Ig o cuando se sobreexpresa en las APC artificiales, VISTA inhibe tanto la proliferación de células T CD4* y CD8* de ratón y humano como la producción de citoquinas.

(2) La expresión de VISTA en las APC mieloides es inhibidora in vitro para las respuestas de células T.

(3) La expresión de VISTA en MDSC en el microambiente del tumor es extremadamente alta. El análisis fenotípico y funcional de muchas moléculas de superficie celular sugieren previamente que participan en la supresión de células T mediada por MDSC: CD115, CD124, CD80, PD-L1, y PD-L2 se expresaron por MDSC pero no se encontraron diferencias en los niveles de su expresión o proporción de células positivas entre MDSC y células a partir de ratones libres de tumor que carecen de actividad inmunosupresora. Por lo tanto, podemos predecir que VISTA será el principal regulador negativo de B7 en las MDSC.

(4) El bloqueo de VISTA mediado por anticuerpos induce inmunidad protectora frente al tumor autólogo.

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Basado en esto, VISTA parece ser una molécula inmunoreguladora negativa, dominante en las MDSC que interfiere con el desarrollo de la inmunidad protectora antitumoral. Por lo tanto, el bloqueo de la actividad de esta molécula con anticuerpos anti-VISTA permitirá el desarrollo de la inmunidad protectora antitumoral en los seres humanos y otros mamíferos.

Por lo tanto, la invención se relaciona con los métodos de uso de proteínas VISTA solubles, por ejemplo, proteínas de fusión y proteínas multiméricas VISTA que comprenden múltiples copias del dominio extracelular VISTA o un fragmento de éste, y agentes de unión a VISTA, por ejemplo moléculas pequeñas y anticuerpos, o fragmentos de éstos, que se unen o modulan (agonizan o antagonizan) la actividad de VISTA como moduladores inmunes y para el tratamiento de diferentes cánceres, por ejemplo, vejiga ovario y linfoma, enfermedad autoinmune, alergia, infección y afecciones inflamatorias, por ejemplo, esclerosis múltiple y artritis.

Como se describe en detalle más abajo, esta proteína es un nuevo ligando inhibidor, cuyo dominio Ig-V extracelular tiene homología con los dos ligandos conocidos de la familia B7, Ligandos de Muerte Programada 1 y 2 (PD-L1 y PD-L2) y presenta características de secuencia única y distintos patrones de expresión in vitro e in vivo en los subconjuntos de las APC y células T, (que distingue PD-L3 O VISTA de otros ligandos de la familia B7). Esta proteína: se demostró tiene un impacto funcional en la proliferación y diferenciación de células T CD4⁺ y CD8* (suprime la proliferación de células T CD4* y CD8⁺, así como la producción de citoquinas). En función de su patrón de expresión e impacto inhibidor sobre las células T, PD-L3 O VISTA funciona aparentemente como un ligando regulador que regula negativamente las respuestas de células T durante las interacciones análogas entre células T y las APC derivadas del mieloide.

Mientras que PD-L3 o VISTA parece ser un miembro de la familia de ligandos B7, a diferencia de otros ligandos de la familia B7, esta molécula contiene un sólo dominio Ig-V sin un dominio Ig-C, y está filogenéticamente más cerca del receptor de Muerte Programada 1 (PD-1) de la familia B7. En función de esto, PDL3 o VISTA, y agonistas o antagonistas específicos a él se pueden usar para o

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL o

U1 regular la activación y diferenciación de células T, y modular más ampliamente la red de regulación que controla las respuestas inmunes. En particular, las proteínas PD-L3 o VISTA y agonistas o antagonistas de PD-L3 o VISTA, preferentemente anticuerpos específicos a PD-L3 o VISTA son útiles en la modulación de las respuestas inmunes en la autoinmunidad, respuestas y enfermedades inflamatorias, alergia, cáncer, enfermedad infecciosa y trasplante.

Por lo tanto, la presente invención en parte se relaciona con las composiciones por ejemplo, para uso terapéutico, diagnóstico o inmunomodulador que contiene una proteína o proteína de fusión aislada soluble PD-L3 o VISTA, por ejemplo, una proteína de fusión soluble VISTA-lg o una proteína multimérica VISTA, que comprende una secuencia de aminoácidos que es preferentemente al menos 70-90% idéntica al polipéptido PD-L3 o VISTA humano o murino que se exponen en las sec. con núms. de ident.: 2, 4 ó 5 o un ortólogo, o fragmento de éste codificada por un gen que específicamente se híbrida a las sec. con núms. de ident.: 1 ó 3 que modula in vivo a VISTA y un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunas modalidades, la proteína VISTA soluble o multimérica se puede enlazar directa o indirectamente con una proteína heteróloga (no-VISTA) o se puede expresar por un vector viral o una célula que contiene, por ejemplo, una célula inmune transfectada tal como una célula T.

La presente invención proporciona también los vectores de expresión que comprenden un ácido nucleico aislado que codifica una proteína VISTA que es al menos 70-90% idéntica a la secuencia de aminoácidos VISTA humana o murina que se expone en las sec. con núms. de ident.: 2, 4 ó 5 o un fragmento u ortólogo de ésta, que opcionalmente se fusiona a una secuencia que codifica otra proteína tal como un polipéptido de Ig, por ejemplo, una región Fe o una molécula reportera, y células huéspedes que contienen dichos vectores.

La presente invención se refiere específicamente también a un agente de unión aislado, preferentemente un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une específicamente a una proteína PD-L3 o VISTA que comprende la secuencia de aminoácidos que se expone en las sec. con núms. de ident: 2, 4 ó 5 o un fragmento u ortólogo variante de ésta. En una modalidad preferida, el agente de 10

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U1 unión modula in vitro o in vivo (agoniza o antagoniza) la actividad de VISTA. En modalidades de mayor preferencia, el agente de unión es un anticuerpo agonista o antagonista.

La presente invención proporciona además métodos para modular una respuesta inmune celular contactando in vitro o in vivo una célula inmune con una proteína VISTA, o agente de unión específica a ella, en la presencia de una señal primaria tal que se modula una respuesta de la célula inmunitaria. (La interacción de VISTA o un modulador de ésta trasmiten una señal a las células inmunes, que regula las respuestas inmunes. La proteína PD-L3 o VISTA se expresa en altos niveles en las células mieloides presentadoras de antígenos, incluyendo las células dendríticas mieloides (DC) y macrófagos, y en densidades inferiores en células T CD4+ y CD8+.Después de la activación inmune, la expresión de PD-L3 o VISTA se regula positivamente en las APC mieloides, pero se regula negativamente en células T CD4+). Por lo tanto, los ácidos nucleicos y polipéptidos de PD-L3 o VISTA de la presente invención, y agonistas o antagonistas de éstos son útiles, por ejemplo, en la modulación de la respuesta inmune.

En otro aspecto, esta invención proporciona moléculas aisladas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de VISTA, preferentemente que codifican las proteínas de fusión solubles y las proteínas multiméricas VISTA, así como fragmentos de ácido nucleico adecuados como cebadores o sondas de hibridación para la detección de ácidos nucleicos que codifican a PD-L3 o VISTA. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA de la invención es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica o más a la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos) que codifica para PD-L3 o VISTA en las sec. con núms. de ident: 1 ó 3 que se muestran en la presente descripción o un complemento de ésta.

En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de PDL3 o VISTA incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene un porcentaje de identidad específico a la secuencia de aminoácidos de las sec. con núms. de ident.: 2, 4 ó 5. En una modalidad preferida, 11 £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL una molécula de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 71 %, 75% 80%, 85%, 90%, 95% 96%, 97%, 98%, 99% idéntica o más a la longitud completa de la secuencia de aminoácidos de las sec. con núms. de ident.: 2, 4 ó 5 o al dominio extracelular de éstas.

En otra modalidad preferida, una molécula aislada de ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos de humano o murino o VISTA o una región conservada o dominio funcional en ella. En aún otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico incluye una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las sec. con núms. de ident.: 2, 4 ó 5. En aún otra modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico es al menos aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550

600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 o más nucleótidos de longitud. En una modalidad preferida adicional, la molécula de ácido nucleico es al menos aproximadamente 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 o más nucleótidos de longitud y codifica un polipéptido que tiene una actividad de PD-L3 o VISTA o modula la función de PD-L3 o VISTA (como se describe en la presente descripción).

Otra modalidad de la invención cuenta con moléculas de ácido nucleico, preferentemente moléculas de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA, que detectan específicamente moléculas de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA con relación a moléculas de ácido nucleico que no codifican polipéptidos de PD-L3 o VISTA. Por ejemplo, en una modalidad, dicha molécula de ácido nucleico es al menos aproximadamente 880, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150 o más nucleótidos de longitud y se híbrida bajo condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico que codifica el polipéptido que se muestra en las sec. con núms. de ident.: 2, 4 ó 5 o un complemento de éste. En otra modalidad, dicha molécula de ácido nucleico al menos 20, 30, 40, 50,100,150, 200, 250, 300 o más nucleótidos de longitud y es se híbrida bajo condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico que codifica un fragmento de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, que comprende al menos 20, 30, 40 o

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50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 o más nucleótidos de longitud, incluye al menos 15 nucleótidos (es decir, 15 contiguos) de la secuencia de ácido nucleico descrita en las sec. con núms. de ident: 1 y 3 que codifican los polipéptidos de PD-L3 o VISTA en las sec. con núms. de ident.: 2, 4 ó 5, o un complemento de éstas, y se híbrida bajo condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en las sec. con núms. de ident.: 1 ó 3 o un complemento de ésta.

En aún otras modalidades preferidas, la molécula de ácido nucleico que codifica una variante alélica de origen natural de un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de las sec. con núms. de ident.: 2 ó 4 ó 5, en donde la molécula de ácido nucleico se híbrida bajo condiciones rigurosas a un complemento de una molécula de ácido nucleico que comprende las sec. con núms. de ident.: 1 ó 3, o un complemento de éstas.

Otra modalidad de la invención proporciona una molécula de ácido nucleico aislada que es antisentido a una molécula de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, es antisentido a la cadena de codificación de una molécula de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA como se muestra en la sec. con núm. de ident.: 1 ó 3.

Otro aspecto de la invención proporciona un vector que comprende una molécula de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA. En determinadas modalidades, el vector es un vector de expresión recombinante.

En otra modalidad, la invención proporciona una célula huésped que contiene un vector de la invención. En aún otra modalidad, la invención proporciona una célula huésped que contiene una molécula de ácido nucleico de la invención. La invención proporciona también un método para producir un polipéptido, preferentemente un polipéptido PD-L3 o VISTA, cultivando en un medio adecuado, una célula huésped, por ejemplo, una célula huésped de mamífero tal como una célula de mamífero no humano, de la invención que contienen un vector de expresión recombinante, tal que se produce el polipéptido.

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

Otro aspecto de esta invención cuenta con polipéptidos aislados o recombinantes de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, proteínas, polipéptidos, péptidos, o fragmentos o partes de éstos). En una modalidad, un polipéptido PD-L3 o VISTA o proteína de fusión PD-L3 o VISTA aislados incluye ai menos uno o más de los siguientes dominios: un dominio de péptido señal, un dominio IgV, un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático.

En una modalidad preferida, un polipéptido PD-L3 o VISTA incluye al menos uno o más de los siguientes dominios: un dominio de péptido señal, un dominio IgV, un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático, y tiene una secuencia de aminoácidos de al menos aproximadamente 71%, 75%

80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%. 94%, 95% 96% 97%, 98%, 99% idéntica o más a la secuencia de aminoácidos de las sec. con núms. de ident.: 2 ó 4 ó 5. En otra modalidad preferida, un polipéptido PD-L3 o VISTA incluye al menos uno o más de los siguientes dominios: un dominio de péptido señal, un dominio IgV, un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático, y tiene una actividad de PD-L3 o VISTA (como se describe en la presente descripción).

En aún otra modalidad preferida, un polipéptido PD-L3 incluye al menos uno o más de los siguientes dominios: un dominio de péptido señal, un dominio IgV, un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático, y se codifica por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación a un complemento de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de las sec. con núms. de ident.: 1 ó 3.

En otra modalidad, la invención cuenta con fragmentos o partes del polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de las sec. con núms. de ident.: 2 ó 4 ó 5, en donde el fragmento comprende al menos 15 aminoácidos (es decir, aminoácidos contiguos) de la secuencia de aminoácidos de las sec. con núms. de ident.: 2 ó 4. En otra modalidad, un polipéptido PD-L3 o VISTA comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de las sec. con núms. de ident.: 2, 4 ó 5.

En otra modalidad, la invención cuenta con un polipéptido PD-L3 o VISTA que se codifica por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de 14 o

U1 κ

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL nucleótidos de al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica o más a una secuencia de nucleótidos de las sec. con núms. de ident.: 1 ó 3, o un complemento de ésta. Esta invención cuenta también con un polipéptido PD-L3 o VISTA que se codifica por una molécula de ácido nucleico que consiste de una secuencia de nucleótidos que se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación a un complemento de una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos de las sec. con núms. de ident.: 1 ó 3.

Los polipéptidos de la presente invención o partes de éstos, por ejemplo, las partes biológicamente activas de éstas, se pueden enlazar operativamente a un polipéptido no-PD-L3 o VISTA (por ejemplo, secuencias de aminoácido heterólogo) para formar polipéptidos de fusión. La invención cuenta además con anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales o policlonales, que se unen específicamente a polipéptidos de la invención, preferentemente polipéptidos PD-L3 o VISTA humanos.

La invención se relaciona también con los métodos para seleccionar anticuerpos de anti-PD-L3 o VISTA que tienen propiedades funcionales a partir de paneles de anticuerpos monoclonales producidos contra esta proteína o una proteína de fusión PDL-3 o VISTA-lg en función de las propiedades funcionales deseadas, por ejemplo que modulan los efectos específicos de PD-L3 o VISTA en la inmunidad, tales como el efecto supresor de la proteína en la activación de TCR, el efecto supresor de la proteína en las respuestas proliferativas de células T CD4 para anti-CD3, la supresión de respuestas proliferativas específicas de antígeno de células T CD4 análogas, los efectos supresores de PD-L3 o VISTA en la expresión de citoquinas específicas tal como IL-2 e interferón gamma, y otros. En una modalidad particularmente preferida los anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA para el uso como agentes terapéuticos serán seleccionados aquellos in vitro, en la presencia de proteínas solubles de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, PD-L3 o proteína de fusión VISTA-lg para mejorar los efectos supresores de PDL3 o VISTA-lg en las funciones inmunes relacionadas a PD-L3 o VISTA. Se prefiere como muy inesperado (se muestra más abajo) que éstos anticuerpos in vivo se comportan o

U1 κ

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL contrarío a lo que se podría esperar a partir de su efecto in vitro sobre la inmunidad, es decir, estos anticuerpos monoclonales anti-o VISTA son inmunosupresores.

Además, los polipéptidos de PD-L3 o VISTA (o partes biológicamente activas de éstos) o moduladores de las moléculas PD-L3 o VISTA, es decir, anticuerpos, tales como los seleccionados usando los métodos anteriores se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas, que incluyen opcionalmente vehículos farmacéuticamente aceptables.

En otra modalidad, una proteína PD-L3 o VISTA se usa como una señal inhibidora para inhibir o disminuir la activación celular inmune. En esta modalidad, la señal inhibidora se une a un receptor inhibidor (por ejemplo, CTLA-4 o PD-1) en una célula inmune antagonizando de ese modo la señal primaria que se une a un receptor de activación (por ejemplo, a través de un TCR, CD3, BCR, o polipéptido Fe). La inhibición incluye, por ejemplo, inhibición de la generación del segundo mensajero; una inhibición de la proliferación; una inhibición de la función efectora en la célula inmune, por ejemplo, fagocitosis reducida, producción reducida de anticuerpos, citotoxicidad celular reducida, el fracaso de la célula inmune para producir mediadores, (tales como citoquinas (por ejemplo, IL-2) y/o mediadores de las respuestas alérgicas); o el desarrollo de anergia.

En modalidades particulares, la señal primaria es un ligando (por ejemplo, CD3 o anti-CD3) que une a TCR e inicia una señal de estimulación primaria. Dichos ligandos de TCR están disponibles fácilmente de fuentes comerciales y ejemplos específicos incluyen el anticuerpo anti-CD3 OKT3, preparado a partir de células de hibridoma obtenidas de la Colección Americana de Cultivos Tipo, y el anticuerpo monoclonal anti-CD3 G19-4. En una modalidad alternativa, una señal primaria se entrega a una célula T a través de otros mecanismos, que incluyen un activador de proteína quinasa C, tales como un éster de forbol (por ejemplo, acetato de forbol miristato), y un ionóforo de calcio (por ejemplo, ionomicina, que eleva las concentraciones citoplasmáticas de calcio), o similares. El uso de dichos agentes desvían el complejo TCR/CD3 pero entregan una señal estimuladora a las células T. Otros agentes que actúan como señales primarias pueden incluir ligandos naturales y sintéticos. Un ligando natural puede incluir MHC con o sin un péptido 16 o

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL presentado. Otros ligandos pueden incluir, pero no se limitan a, un péptido, polipéptido, factor de crecimiento, citoquina, quimioquina, glicopéptido, receptor soluble, esferoide, hormona, mitógeno, tales como PHA, u otro superantígeno tetrámeros péptido-MHC (Altman, y otros (1996) Science 274(5284):94-6) y dímeros MHC solubles (Dal Porto, y otros (1993) Proc Nati Acad Sel USA. 90:66715).

Las células inmunes activadas de acuerdo con el método de la presente invención se pueden ampliar posteriormente ex vivo y se usan en el tratamiento y prevención de una variedad de enfermedades; por ejemplo, células T humanas que se clonaron y expandieron in vitro para conservar su actividad reguladora (Groux, y otros (1997) Nature 389(6652):737-42). Antes de la expansión, una fuente de células T se obtiene de un individuo (por ejemplo, unos mamíferos tales como un humano, perro, gato, ratón, rata, o especies transgénicas de éstos). Las células T se pueden obtener de un número de fuentes, que incluyen las células mononucleares de sangre periférica, médula ósea, tejido de nódulo linfático, sangre del cordón, tejido del timo, tejido de un sitio de infección, tejido del bazo, tumores o líneas de células T. Las células T se pueden obtener a partir de una unidad de sangre recogida de un individuo usando cualquier número de las técnicas conocidas por el técnico con experiencia, tales como la separación porficoll™.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia de una molécula de ácido nucleico, proteína o polipéptido PD-L3

VISTA en una muestra biológica contactando la muestra biológica con un agente capaz de detectar una molécula de ácido nucleico, proteína o polipéptido PD-L3

VISTA, tal que la presencia de una molécula de ácido nucleico, proteína polipéptido PD-L3 o VISTA, se detecta en la muestra biológica. Esta expresión de PD-L3 o VISTA se puede usar para detectar determinados sitios de enfermedad tales como sitios inflamatorios.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un método para detectar la presencia de actividad de PD-L3 o VISTA en una muestra biológica contactando la muestra biológica con un agente capaz de detectar un indicador de la actividad o

U1 £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL o

U1 de PD-L3 o VISTA, tal que la presencia de actividad de PD-L3 o VISTA se detecta en la muestra biológica.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para modular la actividad de PD-L3 o VISTA, que comprende contactar una célula capaz de expresar PD-L3 o VISTA con un agente que modula la actividad de PDL3 o VISTA, preferentemente un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA tal que se modula en la célula la actividad de PD-L3 o VISTA. En una modalidad, el agente inhibe la actividad de PD-L3 o VISTA. En otra modalidad, el agente estimula la actividad de PD-L3 o VISTA. En una modalidad adicional, el agente interfiere con o mejora la interacción entre un polipéptido PD-L3 o VISTA y su pareja(s) de unión natural. En una modalidad, el agente es un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido

PD-L3 o VISTA. En otra modalidad, el agente es un péptido, péptido mimético otra molécula pequeña que se une a un polipéptido PD-L3 o VISTA.

En aún otra modalidad, el agente modula la expresión de PD-L3 o VISTA modulando la transcripción de una traducción de un gen de PD-L3 o VISTA, traducción de un ARNm de PD-L3 o VISTA, o modificación post-traduccional de un polipéptido PD-L3 o VISTA. En otra modalidad, el agente es una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que es antisentido a la cadena de codificación de un ARNm de PD-L3 o VISTA o un gen de PD-L3 o VISTA.

En una modalidad, los métodos de la presente invención se usan para tratar un individuo que tiene un trastorno o afección que se caracteriza por la expresión o actividad del ácido nucleico o polipéptido aberrante, insuficiente o no deseado de PD-L3 o VISTA administrando al individuo un agente que es un modulador de PDL3 o VISTA. En una modalidad preferida, el modulador de PD-L3 o VISTA es polipéptido PD-L3 o VISTA preferentemente una proteína de fusión soluble un proteína multimérica VISTA o anticuerpo anti VISTA como se describe más abajo. En otra modalidad, el modulador de PD-L3 o VISTA es una molécula de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA, por ejemplo un vector de adenovirus. En otra modalidad, la invención además proporciona tratar al individuo con un agente adicional que modula una respuesta inmune.

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o en

En aún otra modalidad, la invención proporciona una vacuna que comprende un antígeno y un agente que modula (mejora o inhibe) la actividad de PD-L3 o

VISTA. E^una modalidad preferida, la vacuna inhibe la interacción entre PD-L3 o /

VISTA y su(s) pareja(s) de unión natural.

La presente invención proporciona también los ensayos de diagnóstico para identificar la presencia o ausencia de una alteración genética caracterizada por al menos uno de (i) modificación aberrante o mutación de un gen que codifica un t polipéptido PD-L3 o VISTA, (ii) regulación defectuosa del gen, y (iii) modificación post-traduccional aberrante de un polipéptido PD-L3 o VISTA, en donde una forma de tipo salvaje del gen codifica un polipéptido con actividad de PD-L3 o VISTA.

En otro aspecto, la invención proporciona los métodos para identificar un compuesto que se une a o modula la actividad de un polipéptido PD-L3 o VISTA, proporcionando una composición indicadora que comprende un polipéptido PD-L3 o VISTA que tiene actividad de PD-L3 o VISTA, contactando la composición indicadora con un compuesto de prueba, y determinando el efecto del compuesto de prueba en la actividad de PD-L3 o VISTA en la composición indicadora para identificar un compuesto que modula la actividad de un polipéptido PD-L3 o VISTA.

En un aspecto, la invención caracteriza un método para modular la interacción de PD-L3 o VISTA con su pareja (s) de unión natural en una célula inmune que comprende contactar una célula presentadora de antígeno que expresa PD-L3 o VISTA con un agente seleccionado del grupo que consiste de: una forma de PD-L3 o VISTA, o un agente que modula la interacción de PD-L3 o VISTA y su(s) pareja (s) de unión natural tal que se modula la interacción de PD-L3 o VISTA con la(s) pareja(s) asociada(s) de unión natural en una célula inmune. En una modalidad preferida, un agente que modula la interacción de PD-L3 o VISTA y su(s) pareja(s) de unión natural es un anticuerpo que se une específicamente a PDL3 o VISTA. En una modalidad, la interacción de PD-L3 o VISTA con su pareja (s) de unión natural se regula positivamente. En otra modalidad, la interacción de PDL3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural se regula negativamente. En una modalidad, el método comprende además contactar la célula inmune o la

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U1 célula presentadora de antígeno con un agente adicional que modula respuesta inmune.

una

En una modalidad, la etapa de contacto se realiza in vitro. En otra modalidad, la etapa de contactar se realiza in vivo. En una modalidad, la célula inmune se selecciona del grupo que consiste de: una célula T, un monocito, un macrófago, una célula dendrítica, una célula B, y una célula mieloide.

En otro aspecto, la invención corresponde a un método para inhibir aumentar la activación en una célula inmune que comprende aumentar o inhibir la actividad o la expresión de PD-L3 o VISTA en una célula tal que se inhibe o aumenta la activación de la célula inmune.

En aún otro aspecto, la invención corresponde a una vacuna que comprende un antígeno y un agente que inhibe la interacción entre PD-L3 o VISTA y su(s) pareja(s) de unión natural.

En aún otro aspecto, la invención corresponde a una vacuna que comprende un antígeno y un agente que promueve la interacción entre PD-L3 o VISTA y su(s) pareja(s) de unión natural.

En otro aspecto, la invención se corresponde con un método para tratar un individuo que tiene una afección que se beneficiaría de la regulación positiva de una respuesta inmune que comprende administrar un agente que inhibe la interacción entre PD-L3 o VISTA y su(s) pareja(s) de unión natural en células inmunes del individuo tal que una afección que se trata se beneficiaría de la regulación positiva de una respuesta inmune. En una modalidad preferida, el agente comprende un anticuerpo de bloqueo o una molécula pequeña que se une a

PD-L3 o VISTA e inhibe la interacción entre PD-L3 o VISTA y su pareja (s) de unión natural. En otra modalidad, el método comprende además administrar un segundo agente que regula positivamente una respuesta inmune al individuo. En otro aspecto, la invención corresponde con un método para tratar un individuo que tiene una afección que se beneficiaría de la regulación negativa de una respuesta inmune que comprende administrar un agente que estimula la interacción entre PDL3 O VISTA y su(s) pareja(s) de unión natural en las células del individuo tal que

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o

U1 una afección que se trata se beneficiaría de la regulación negativa de una respuesta inmune.

Por ejemplo, la afección tratada con la proteína PD-L3 o VISTA o agentes de unión se selecciona dei grupo que consiste de: un tumor, una infección patogénica, una afección o respuesta inmune inflamatoria, preferentemente afecciones inflamatorias menos pronunciadas, o una enfermedad inmunosupresora. Los ejemplos específicos incluyen esclerosis múltiple, tiroiditis, artritis reumatoide, diabetes tipo II y tipo I y cánceres, tanto formas avanzadas como tempranas, incluyendo cánceres metastásicos, tales como el cáncer de vejiga, cáncer de ovario, melanoma, cáncer de pulmón y otros cánceres en donde VISTA suprime una respuesta antitumoral eficaz. En algunos ejemplos se puede administrar al individuo células o un vector viral que expresa un ácido nucleico que codifica un anticuerpo anti-VISTA o proteína de fusión VISTA.

En una modalidad, el agente comprende un anticuerpo o una molécula pequeña que estimula la interacción entre PD-L3 o VISTA y su(s) páreja(s) de unión natural. En otra modalidad, el método comprende además administrar un segundo agente que regula negativamente una respuesta inmune al individuo tal como un PD-L1, PD-L2 o proteína de fusión CTLA-4 o anticuerpo específico a él.

Las afecciones tratables ilustrativas usando proteínas PD-L3 o VISTA, agentes de unión o antagonistas o agonistas de PD-L3 o VISTA de acuerdo con la invención incluyen a modo de ejemplo trasplante, una alergia, enfermedad infecciosa, cáncer y trastornos inflamatorios o autoinmunes, por ejemplo, un trastorno inmune inflamatorio. Ejemplos específicos de los anteriores incluyen la diabetes tipo 1, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, artritis psoriática, lupus eritematoso sistémico, enfermedades reumáticas, trastornos alérgicos, asma, rinitis alérgica, trastornos de la piel, trastornos gastrointestinales tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, rechazo de trasplantes, insuficiencia renal postestreptocóccica y autoinmune, choque séptico, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SIRS), síndrome de dificultad respiratoria del adulto (ARDS) y envenenamiento; enfermedades autoinflamatorias así como degenerativas de los huesos y enfermedades de las articulaciones incluyendo osteoartritis, artritis por 21 £

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σι cristal y capsulitis y otras artropatías. Además, los métodos y composiciones se pueden usar para tratar la tendinitis ligamentitis, y lesión articular traumática.

En otro aspecto, la invención corresponde con un ensayo basado en células para tamizar compuestos que modulan la actividad de PD-L3 o VISTA que comprende contactar una célula que expresa una molécula objetivo de PD-L3

VISTA con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de la molécula objetivo de PD-L3 o VISTA.

En aún otro aspecto, la invención corresponde con un ensayo de células libres para tamizar compuestos que modulan la unión de PD-L3 o VÍSTA a una molécula objetivo, que comprende contactar un polipéptido PD-L3 o VISTA o la parte biológicamente activa de éste con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para unirse al polipéptido PD-L3 o VISTA o la parte biológicamente activa de éste.

En otra modalidad, la invención corresponde con un método de identificar un compuesto, por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA que modula el efecto de PD-L3 o VISTA en la activación de células T o la producción de citoquinas en una primera y segunda concentración de antígeno que comprende contactar una célula T que expresa una molécula objetivo de PD-L3 o VISTA con un compuesto de prueba a una primera concentración de antígeno, determinar la capacidad del compuesto prueba para modular la proliferación de células T o la producción de citoquinas a la primera concentración de antígeno, contactar una célula T que expresa una molécula objetivo de PD-L3 o VISTA con el compuesto de prueba una segunda concentración de antígeno, y determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular la proliferación de células T o la producción de citoquinas la segunda concentración de antígeno, identificando de ese modo un compuesto que modula la activación de células T o la producción de citoquina en una primera y segunda concentración de antígeno.

En otras modalidades específicas se tamizan paneles de anticuerpos antiPD-L3 o VISTA y proteínas PD-L3 o VISTA para seleccionar aquellos que inhiben promueven los efectos de PD-L3 o VISTA en la diferenciación de células T CD4+ CD8+, proliferación y/o producción de citoquinas in vitro o in vivo.

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en

En modalidades preferidas, las proteínas del individuo PD-L3 o VISTA, ácidos núcleos, y ligandos específicos a PD-L3 o VISTA, preferentemente los anticuerpos que tienen efectos deseados sobre las funciones de PD-L3 o VISTA se usan para tratar afecciones como el cáncer, enfermedades autoinmunes, alergia, trastornos inflamatorios o infección y más específicamente trastornos del sistema inmune, tales como inmunodeficiencia combinada severa, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus tipo I, síndrome linfoproliferativo, enfermedad intestinal inflamatoria, alergias, asma, enfermedad del injerto contra el huésped, y rechazo de trasplante; las respuestas inmunes a agentes patógenos infecciosos tales como bacterias y virus; y cánceres del sistema inmune, tales como linfomas y leucemias).

Descripción Detallada de los Dibujos

Figura 1. Análisis de secuencias. A. La secuencia de aminoácidos completa de PD-L3 o VISTA murina. B. Alineación de secuencias de aminoácidos de dominios de Ig extracelulares entre PD-L3 o VISTA murina y ligandos seleccionados de la familia B7, incluyendo B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H3 y B7-H4. C. Alineación del dominio Ig de PD-L3 o VISTA con receptores de la familia B7, incluyendo PD-1, CTLA-4, CD28, BTLA e ICOS. Dominio Ig-V, dominio Ig-C, . La alineación se realizó usando el algoritmo MUSCLE (Comparación de Secuencias Múltiples por expectativas de Logaritmo). D. La identidad de secuencia (%) de los dominios Ig-V entre PD-L3 o VISTA y otros ligandos de la familia B7 y los receptores se calcula usando el programa ClustalW2. E. Homología de secuencia entre PD-L3 o VISTA humano y murino. Los residuos idénticos se sombrean en negro. Los residuos altamente conservados y semiconservados se sombrean en tono oscuro y claro de gris, respectivamente.

Figura 2. El análisis filogenético de PD-L3 o VISTA de ratón con otros miembros de la superfamilia de inmunoglobulina (Ig). Secuencia completa de PDL3 O VISTA de ratón y otros miembros de la superfamilia de Ig, incluyendo CD28, CTLA-4, ICOS, BTLA, PD-1. B7-H1 (PD-L1), B7-DC (PD-L2), B7-H2, B7-H3, B7-H4, B7-1, B7-2, BTNL2, BTN3A3. BTN2A2 y BTN1A1, se analizaron usando el 23

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U1 algoritmo PhyML (Probabilidad Máxima Filogenética). Las distancias de ramificación se mostraron en las uniones de las ramas del árbol.

Figura 3. Patrones de expresión en tejido y células hematopoyéticas de PDL3 o VISTA A. RT-PCR de PD-L3 o VISTA completa a partir de tejidos de ratón. Carriles: (1) músculo (2) corazón (3) ojo (4) timo (5) bazo (6) intestino delgado (7) riñón (8) hígado (9) cerebro (10) glándula mamaria (11) pulmón (12) ovario (13) médula ósea. B. RT-PCR de PD-L3 o VISTA completa a partir de tipos de células hematopoyéticas purificadas. Los carriles (1) macrófagos peritoneales (2) monocitos esplénicos CD11b+ (3) DC esplénicos CD11c+ (4) células T esplénicas CD4+ (5) células T esplénicas CD8+ (6) células B esplénicas. C-E. Análisis de citometría de flujo de la expresión PD-L3 o VISTA en células T esplénicas CD4+ y CD8+ de timo y bazo (C), en monocitos CD11b+ (D), y en subconjuntos DC CD11c+ a partir de bazo y cavidad peritoneal (E). F. Células B esplénicas, células NK y granulocitos se analizan también. G. La expresión diferencial de PD-L3 o VISTA en células hematopoyéticas de sitios de tejidos diferentes, incluyen LN me sen té rico, LN periférico, bazo, sangre y cavidad peritoneal. Los datos representativos de al menos 3 experimentos independientes se muestran.

Figura 4. Los datos de los arreglos de genes de PD-L3 o VISTA a partir de las base de datos de arreglos de genes de GNF (Instituto de Genómica de la Fundación Novartis de Investigación), así como la base de datos GEO (gene expression ómnibus, por sus siglas en inglés) de NCBI.

Figura 5. Especificidad de PD-L3 o VISTA a anticuerpos monoclonales de hámster. Las líneas celulares EL4 de ratón que sobre-expresan ya sea PD-L1 o PD-L3 o VISTA fusionadas a RFP se tiñeron usando sobrenadantes de cultivos de hibridoma y se analizaron por citometría de flujo. Se muestran dos clones positivos representativos.

Figura 6. Comparación de la expresión de PD-L3 o VISTA con otros ligandos de la familia B7 en células de bazo cultivadas in vitro. La expresión de PD-L3 o VISTA y otros ligandos de la familia B7 (es decir, PD-L1, PD-L2, B7-H3, y B7-H4) en tipos de células hematopoyéticas, incluyendo células T CD4+, monocitos CD11

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL bhi, y las DC CD11c+ se compararon. Las células se aislaron ya sea recién, o cultivadas in vitro durante 24 horas, con y sin activación.

Las células T CD4+ se activaron con CCD3 unido a placa (5pg/ml), monocitos CD 11 bhi y las DC CD11c+ se activaron con IFN alfa (20 ng/ml) y LPS (200 ng/ml).

Los resultados representativos de tres experimentos independientes se muestran.

Figura 7. Comparación de los patrones de expresión in vivo de PD-L3 o VISTA y otros ligandos de la familia B7 durante la inmunización. Los ratones transgénicos DO11.10 TCR se inmunizaron en el costado con ovoalbúmina de pollo (OVA) emulsificada en adyuvante completo de Freund (CFA). Las células de los ganglios linfáticos que drenan y que no drenan se recogieron 24 horas después de la inmunización, y analizaron por citometría de flujo para la expresión de PD-L3 o VISTA, PD-L1 y PD-L2. Los resultados representativos se muestran de al menos cuatro experimentos independientes. A. Una población de células CD11 b+ que expresan un alto nivel de PD-L3 o VISTA se indujo dentro del ganglio linfático que drena a las 24 horas después de la inmunización con CFA/OVA, pero no solo con CFA. Estas células son de fenotipo mixto de macrófagos F4/80+ y CD11 C+células dendríticas. B. La expresión de PD-L3 o VISTA, PD-L1 y PD-L2 en monocitos CD11 bhi, las DC CD 11c+ y células T CD4+ se analizaron 24 horas después de la inmunización.

Figura 8 Pérdida de la expresión de PD-L3 o VISTA en las células T CD4+ activadas en respuesta a la inmunización. Ratones DO11.10 se inmunizaron en el costado con ovoalbúmina de pollo (OVA) emulsificada en adyuvante completo de Freund (CFA). Las células de ganglios linfáticos que drenan y que no drenan se recogieron 48 horas después de la inmunización, y analizaron para la expresión de PD-L3 o VISTA por citometría de flujo. Se muestran los resultados representativos de 2 experimentos independientes.

Figura 9 La proteína de fusión PD-L3 o VISTA-lg inmovilizada inhibió la proliferación de células T CD4+ y CD8+. A. Células T CD4+ y CD8+ marcadas con CFSE se estimularon por OCD3 unidos a placa con o sin PD-L3 o VISTA-lg coabsorbido. El porcentaje de células con bajo CFSE se cuantificó y se muestra en B.

o en

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C Las células T CD4 + de ratones PD-1 KO se suprimieron también por PD-L3 O VISTA-lg. D. La supresión mediada por PD-L3 o VISTA-lg es persistente y puede actuar tarde. Las células T CD4+ se activaron en presencia de PD-L3 o VISTA-lg o IgControl, ya sea 72 horas (i), o durante 24 horas (ii, iii y iv). Las células preactivadas 24 horas se cosecharon y re-estimularon bajo condiciones específicas para otras 48 horas. La proliferación celular se analizó al final del cultivo de 72 horas, (¡i) Pre-activación con PD-L3 o VISTA-lg y re-estimulación con antiCD3; (iii) Pre-activación con antiCD3 y re-estimulación con PD-L3 o VISTA-lg. (iv) Preactivación con PD-L3 o VISTA-lg y re-estimulación con PD-L3 o VISTA-lg. Los pocilios duplicados se analizaron para todas las condiciones. Se muestran los resultados representativos de al menos cuatro experimentos.

Figura 10. Efecto inhibitorio similar de proteínas de fusión PD-L1-lg y PD-L3 O VISTA-lg en la proliferación celular de las células T CD4+. Las células T CD4+ purificadas a granel se marcaron con CFSE y estimularon con OCD3 unida a placa junto con la cantidad titulada de proteínas de fusión PD-L1 -Ig o PD-L3 o VISTA-lg. La dilución de CFSE se analizó a las 72 horas y se cuantificó el porcentaje de células con bajo CFSE. Los pocilios duplicados se analizaron para todas las condiciones. Se muestran los resultados representativos de 2 experimentos independientes.

Figura 11. Impacto supresor de PD-L3 o VISTA-lg sobre la proliferación de las células T CD4+ vírgenes y de memoria. A. Subconjuntos de células T CD4 + vírgenes (CD25-CD44lowCD62Lhi) y de memoria (CD25-CD44hiCD62Llow) se clasificaron, marcaron con CFSE, y estimularon con anti-CD3 unido a la placa (2.5 pg/ml) junto con PD-L3 o VISTA-lg o IgControl en las relaciones indicadas. La proliferación celular se analizó a las 72 horas examinando el perfil de división de CFSE. El porcentaje de células proliferadas, como se determinó por el porcentaje de células con bajo CFSE, se calcula y se muestra en B. Los pocilios duplicados se analizaron para todas las condiciones. Se muestran los resultados representativos de dos experimentos independientes.

Figura 12 La proteína de fusión PD-L3 o VISTA-lg suprimió la activación y proliferación celular temprana de TCR, pero indirectamente induce la apoptosis.

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Las células T CD4+ purificadas a granel se estimularon con anti-CD3 unido a la placa junto con PD-L3 o VISTA-lg o IgControl en la relación de 1-2 (2.5 pg/ml y 5 pg/ml, respectivamente). Las células se analizaron por citometría de flujo a las 24 horas y 48 horas para la expresión de CD69, CD62L y CD44. Las células se tiñeron también por anexina-V el marcador de la apoptosis temprana, y el marcador de la muerte celular 7-Aminoactinomicina D (7-AAD). Se muestran los resultados representativos de dos experimentos independientes.

Figura 13. La PD-L3 o VISTA-lg inhibió la producción de citoquinas por las células T CD4+ y CD8+. A-B. Células T CD4 + purificadas a granel se estimularon con anti-CD3 unido a la placa, y PD-L3 o VISTA-lg o IgControl en las relaciones indicadas. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron después de 24 horas y 48 horas. Los niveles de IL-2 e IFN se analizaron por ELISA. C-D. Células T CD4+ se clasificaron en poblaciones celulares vírgenes (CD25-CD44lowCD62Lh¡) y de memoria (CD25-CD44h¡CD62Llow). Las células se estimularon con OCD3 unido a la placa y PD-L3 o VISTA-lg o IgControl en una relación de 1:2. Los sobrenadantes de cultivo se recogieron a las 48 horas y analizaron por ELISA para el nivel de IL-2 e IFN □. E. Las células T CD8+ purificadas a granel se estimularon con DCD3 unido a la placa y PD-L3 o VISTA-lg o IgControl en las relaciones indicadas. El

IFN en el sobrenadante del cultivo se analizó por ELISA. Para todas las condiciones, sobrenadantes de seis pocilios duplicados se mezclaron para el análisis de ELISA. Se muestran los resultados representativos de al menos tres experimentos.

Figura 14. La supresión mediada por PD-L3 o VISTA-lg puede superar un nivel moderado de co-estlmulación proporcionada por CD28, pero se invirtió completamente por un alto nivel de co-estimulación así como se rescató parcialmente por IL-2 exógena. A-B. Las células T CD4+ se activaron por CCD3 unido a la placa junto ya sea con PD-L3 o VISTA-lg o IgControl en relación 1-1 y relaciones 1-2. Para el rescate de citoquinas, solubles se añadieron al cultivo celular mlL-2, mlL-7, mlL-15 y mlL-23 (todos a 40ng/ml) (A). Para examinar los efectos de la co-estimulación CCD28 (1 pg/ml) se inmovilizó junto con las proteínas □CD3 e Ig a las relaciones indicadas (B). La proliferación celular se analizó a las

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en horas examinando los perfiles de división de CFSE. C-D. Para examinar la actividad supresora de PD-L3 o VISTA en presencia de niveles inferiores de coestimuiación, cantidades tituladas de CCD28 se recubrieron junto con anti-CD3 (2.5 pg/ml) y proteínas de fusión PD-L3 o VISTA-lg o proteínas de fusión IgControl (10 pg/ml) para estimular la proliferación de células T CD4+. La proliferación celular se analizó a las 72 horas. Los porcentajes de células proliferadas con bajo CFSE se cuantificaron y se muestran en D.

Los pocilios duplicados se analizaron para todas las condiciones. Se muestran los perfiles CFSE representativos de tres experimentos independientes.

Figura 15. La PD-L3 o VISTA expresada en células presentadoras de antígeno suprimió la proliferación de células T CD4. A-C La línea celular CHO que expresa de forma estable la molécula l-Ad de MHCII y molécula B7-2 de coestimulación se usó como la línea celular progenitora. Las células se transdujeron con retrovirus que expresan ya sea PD-L3 o VISTA-RFP o moléculas de control RFP. Las células transducidas se clasificaron para alcanzar el nivel de expresión homogéneo. Para probar su capacidad como células presentadoras de antígeno, las células CHO-PD-L3 o VISTA o células CHO-RFP se trataron con mitomicina C y mezclaron con células T CD4+ D011.10 transgénicas específicas OVA, en presencia de la cantidad titulada de péptido OVA. La proliferación de células DO11 se analizó a las 72 horas, ya sea por los perfiles de división de CFSE (A-B), o por incorporación de tritio (C). D. Las células dendríticas derivadas de la médula ósea se transdujeron con retrovirus RFP o B7B-H5-RFP durante el período de cultivo de días.

Las DC CD11c+ RFP+ transducidas y las DC CD11 c + RFP- no transducidas se clasificaron y usaron para estimular células T CD4 +OTII transgénicas específicas OVA en presencia de una cantidad titulada de péptido OVA. La proliferación celular se analizó en el día 3 examinando la división de CFSE. Para todos los experimentos, los pocilios duplicados se analizaron para todas las condiciones, y se muestran los resultados representativos de tres experimentos independientes.

Figura 16. Nivel de expresión superficial de PD-L3 o VISTA en las DC derivadas de la médula ósea retroviralmente transducida. Las DC derivadas de 28

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en médula ósea (BMDC) se cultivaron en presencia de GM-CSF (20ng/ml) y transdujeron ya sea con retrovirus RFP o PD-L3 o VISTA-RFP como se describe en Métodos. En el día 10, el nivel de expresión en la superficie de PD-L3 o VISTA se analizó en las BMDC cultivadas, y comparó con los macrófagos perifonéales recién aislados.

La Figura 17 muestra que el AcM anti-PDL3 presenta eficacia en un modelo EAE de transferencia pasiva. En este modelo EAE de transferencia adoptiva, ratones SJL donantes se inmunizaron con CFA y el péptido PLP. En el día 10, los linfocitos totales de LN que drenan se aislaron y cultivaron in vitro con péptido PLP, IL-23 (20 ng/ml) y anti-IFNg (10 pg/ml) durante 4 días. Las células T CD4 expandidas se purificaron después y transfirieron adoptivamente en ratones receptores vírgenes. La progresión de la enfermedad se controló y anotó con: 0, sin enfermedad, 0.5 pérdida del tono de la cola, 1: Cola floja; 2: cola floja + paresia en extremidad posterior, 2.5:1 parálisis en extremidad posterior; 3: parálisis en ambas extremidades posteriores; 3.5: debilidad de extremidad anterior; 4: parálisis en extremidad posterior + parálisis unilateral de la extremidad anterior. Los ratones se sacrificaron cuando la puntuación de la enfermedad alcanzó 4. *, se sacrificaron los ratones.

La Figura 18 muestra que los anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA presentan eficacia (reducen ios síntomas de la artritis) en un modelo animal de artritis inducida por colágeno.

La Figura 19 muestra que VISTA expresada en las células presentadoras de antígeno suprime la proliferación de células T CD4+.

La Figura 20 muestra que un anticuerpo anti-VISTA inhibió el crecimiento tumoral en ratones trasplantados con células tumorales MB49.

La Figura 21 muestra el efecto antitumoral de los AcM VISTA en cuatro modelos antitumorales diferentes de ratón.

La Figura 22 muestra el efecto de potenciación de los AcM VISTA en la eficacia de una vacuna agonista CD40/TLR.

La Figura 23 muestra la expresión de VISTA en células del CNS.

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La Figura 24 muestra el impacto de VISTA en el destino y la función de células T en un modelo EAE.

Descripción detallada de la invención *Definiciones

Antes de describir la invención en más detalle se proporcionan las siguientes definiciones.

Como se usa en la presente descripción el término célula inmune incluye las células que son de origen hematopoyético y que juegan un papel en la respuesta inmune. Las células inmunes incluyen los linfocitos, tales como las células B y células T; células agresoras naturales; y células mieloides, tales como monocitos, macrófagos, eosinófilos, células mastoides, basófilos, y granulocitos.

Como se usa en la presente descripción, el término “célula T” incluye las células T CD4+ y células T CD8+. El término célula T incluye también tanto células T auxiliadora de tipo 1, como células T auxiliadora de tipo 2. *1.

El término “célula presentadora de antígeno incluye células profesionales presentadoras de antígenos (por ejemplo, linfocitos B, monocitos, células dendríticas, y células de Langerhans) así como otras células presentadoras de antígenos (por ejemplo, queratinocitos, células endoteliales, astrocitos, fibroblastos y oligodendrocitos).

El término antígeno en la presente descripción se refiere al antígeno donde la modulación de su respuesta en inmune puede ser deseada terapéuticamente. En el caso de una respuesta inmune mejorada deseada a los antígenos particulares de interés, son ilustrativos dichos antígenos que incluyen pero no se limitan a, antígenos de enfermedades infecciosas para los que se puede inducir una respuesta inmune protectora. Por ejemplo, los antígenos de VIH bajo consideración son las proteínas gag, env, pol, tat, rev, nef, transcriptasa inversa, y otros componentes de VIH. Las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano también están bajo consideración. Además, el antígeno EBNA 1 del virus de herpes

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en simple está también bajo consideración. Otros antígenos virales a considerar son los antígenos virales de la hepatitis tales como las proteínas S, M y L del virus de la hepatitis B, el antígeno pre-S del virus de la hepatitis B, y otras hepatitis, por ejemplo, hepatitis A, B, y C, componentes virales tales como el ARN viral de la hepatitis C; antígenos virales de influenza, tales como la hemaglutinina, neuraminidasa, nucleoproteína, M2, y otros componentes virales de la influenza; antígenos virales del sarampión, tales como proteína de fusión del virus del sarampión y otros componentes del virus del sarampión; antígenos virales de la rubéola tales como proteínas E1 y E2 y otros componentes del virus de la rubéola; antígenos de rotavirus, tales como VP7sc y otros componentes de rotavirus; antígenos de citomegalovirus como glicoproteína B de la envoltura y otros componentes de antígenos de citomegalovirus; antígenos virales sincitial respiratorio tales como la proteína de fusión de RSV, la proteína M2 y otros componentes del antígeno viral sincitial respiratorio; antígenos virales del herpes simple tales como proteínas tempranas inmediatas, glicoproteína D, y otros componentes del antígeno viral del herpes simple, antígenos virales de varicela zoster tales como gpl, gpll, y otros componentes del antígeno viral de la varicela zoster; antígenos virales de la encefalitis Japonesa tales como las proteínas E, ΜΕ, M-E-NS1, NS 1, NS 1-NS2A, 80% E, y otros componentes del antígeno viral de la encefalitis japonesa; antígenos virales de la rabia tales como glicoproteína de la rabia, y la nucleoproteína de la rabia y otros componentes del antígeno viral de la rabia; las proteínas prM y E del virus del Nilo Occidental y proteína de la envoltura del Ébola. Ver Fundamental Virology, Segunda edición, editores. Knipe, D.M y Howley P.M. (Lippincott Williams & Wilkins, Nueva York, 2001) para ejemplos adicionales de antígenos virales. Además, se describen también los antígenos bacterianos. Los antígenos bacterianos que se pueden usar en las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, antígenos bacterianos de pertussis tales como toxina de pertussis, hemaglutinina filamentosa, pertactina, FIM2, FIM3, adenilato ciclasa y otros componentes del antígeno bacteriano de pertussis; antígenos bacterianos de difteria tales como toxina o toxoide de la difteria y otros componentes de antígenos bacterianos de la difteria; antígenos bacterianos de tétanos, tales como la toxina o toxoide del tétanos y otros componentes del 31

IMPI antígeno bacteriano de tétanos; antígenos bacterianos de estreptococos tales como las proteínas M y otros componentes del antígeno bacteriano estreptococos; antígenos bacterianos de Estafilococos tales como IsdA, IsdB, SdrD, y SdrE; antígenos bacterianos de bacilos gram-negativos tales como lipopolisacáridos, flagelina, y otros componentes antigénicos bacterianos de gram-negativas; antígenos bacterianos de Mycobacterium tuberculosis tales como ácido micólico, la proteína 65 de choque térmico (HSP65) la proteína secretada principal de 30 kDa, antígeno 85A, ESAT-6, y otros componentes del antígeno micobacteriano; componentes del antígeno bacteriano de Helicobacter pylori; antígenos bacterianos neumococo tales como neumolisina, polisacáridos capsulares de neumococo y otros componentes del antígeno bacteriano neumococo; antígenos bacterianos de Haemophilus influenzae tales como polisacáridos capsulares y otros componentes del antígeno bacteriano de Haemophilus influenzae; antígenos bacterianos ántrax tales como antígeno protector de ántrax, factor letal de ántrax, y otros componentes del antígeno bacteriano ántrax; proteínas F1 y V de Yersinia pestis; antígenos bacterianos de rickettsias tales como rOmps y otros componentes del antígeno bacteriano rickettsias. Se incluyen también con los antígenos bacterianos descritos en la presente descripción cualquiera de otras bacterias, antígenos de micobacterias, micoplasma, rickettsia, o chlamydia. Los ejemplos de protozoos y otros antígenos parasitarios incluyen, pero no se limitan a antígenos de Plasmodium falciparum tales como antígenos de superficie de merozoitos, antígenos de superficie de esporozoitos, antígenos de circumsporozoitos, antígenos de superficie de gametocito/gameto, antígeno pf 1 55/RESA de estadio sanguíneo y otros componentes de antígeno de plasmodio; antígenos de toxoplasma tales como SAG-1, p30 y otros componentes del antígeno de Toxoplasma; antígenos de Schistosoma tales como glutatión-S-transferasa, paramiosina, y otros componentes de antígeno de Schistosoma; antígenos de Leishmania major y otras leishmanias tales como gp63, lipofosfoglicano y su proteína asociada y otros componentes del antígeno de Leishmania; y antígenos de Trypanosoma cruzi tales como el antígeno de 75-77 kDa, el antígeno de 56 kDa y otros componentes del antígeno de Trypanosoma. Los ejemplos de antígenos fúngicos incluyen, pero no se limitan a, antígenos de especies de Candida, 32 o

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL especies de Aspergillus, especies de Blastomyces, especies de Histoplasma, especies de Coccidiodomicosis, Malassezia furfur y otras especies, Exophiala wemeckii y otras especies, Piedraia hortai y otras especies, Trichosporum beigelii y otras especies, especies de Microsporum, especies de Trichophyton, especies de Epidermophyton, Sporothrix schenckii y otras especies, Fonsecaea pedrosoi y otras especies, Wangiella dermatitidis y otras especies, Pseudallescheria bóydii y otras especies, Madurella grísea y otras especies, especies de Rhizopus, especies de Absidia, y especies de Mucor. Los ejemplos de antígenos de la enfermedad del prion incluyen PrP, beta-amiloide, y otras proteínas asociadas a prion.

Además de los agentes infecciosos y parasitarios mencionados anteriormente, otra área de inmunogenicidad mejorada deseable a un agente no infeccioso está en el área de enfermedades no proliferativas, incluyendo pero no se limitan a cáncer, en el que se eliminan deseablemente del cuerpo las células que expresan antígenos del cáncer. Los antígenos tumorales que se pueden usar en las composiciones y métodos de la invención incluyen, pero no se limitan a, antígeno específico de la próstata (PSA), mama, vejiga, ovario, testículo, melanoma, telomerasa; proteínas de multldroga resistencia, tales como la glicoproteína P, MAGE-1, alfa fetoproteína, antígeno carcinoembrionario, muíante p53, antígenos de papilofnavirus, gangliósidos u otros componentes de melanoma que contienen carbohidratos u otras células tumorales. Se contempla por la invención que los antígenos de cualquier tipo de célula tumoral se pueden usar en las composiciones y métodos descritos en la presente descripción. El antígeno puede ser una célula cancerígena, o materiales inmunogénicos aislados de una célula cancerígena tales como proteínas de membrana. Se incluyen los antígenos universales sumivin y telomerasa y la familia MAGE de antígenos del cáncer de testículo. Los antígenos que demostraron estar involucrados en la autoinmunidad y se podrán usar en los métodos de la presente invención para inducir tolerancia incluyen, pero no se limitan a, proteína básica de mielina, glicoproteína de la míelina de oligodendrocitos y proteína proteolipídica de la esclerosis múltiple y la proteína colágeno CU de la artritis reumatoide.

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El antígeno puede ser una parte de un agente infeccioso tal como HZV-1

EBV, HBV, virus de la influenza, virus SARS, poxvirus, malaria, o HSV, a modo de ejemplos no limitativos, para los que se necesitan vacunas que movilizan fuerte la inmunidad mediada por células T (a través de las células dendríticas).

El término tumor denota al menos una célula o masa celular en la forma de una neoformación del tejido, en particular en la forma de un exceso de crecimiento espontáneo, autónomo e irreversible, que es más o menos desinhibido, de tejido endógeno, cuyo crecimiento como regla se asocia con la pérdida más o menos pronunciada de las funciones específicas de las células y los tejidos. Esta masa celular o célula no se inhibe eficazmente, en io que se refiere a su crecimiento, por sí misma o por los mecanismos de regulación del organismo huésped, por ejemplo, melanoma o carcinoma. Los antígenos tumorales no sólo incluyen antígenos presentes en o sobre las propias células malignas, sino también incluyen antígenos presentes en el tejido de apoyo del estroma de tumores incluyendo células endoteliales y otros componentes de los vasos sanguíneos.

Como se usa en ia presente descripción, el término “respuesta inmune incluye respuestas inmunes mediadas por células T y/o mediada por células B que se influencian por la modulación de la co-estimulación de células T. Las respuestas inmunes ilustrativas incluyen respuestas de células B (por ejemplo, producción de anticuerpo) respuestas de células T (por ejemplo, producción de citoquinas, y citotoxicidad celular) y activación de las células de respuesta de citoquinas, por ejemplo macrófagos.

Como se usa en la presente descripción, el término “modulación negativa” con referencia a la respuesta inmune incluye una disminución en alguna o más respuestas inmunes, mientras que el término “modulación positiva” con referencia a la respuesta inmune incluye un aumento en alguna o más respuestas inmunes. Se entenderá que la modulación positiva de un tipo de respuesta inmune puede conducir a la correspondiente modulación negativa en otro tipo de respuesta inmune. Por ejemplo, la modulación positiva de la producción de determinadas citoquinas (por ejemplo, IL-10) puede conducir a la modulación negativa de la respuesta inmune celular.

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Como se usa en la presente descripción, el término “receptor co-estimulador incluye los receptores que transmiten una señal co-estimuladora a una célula inmune, por ejemplo, CD28 o ICOS. Como se usa en la presente descripción, el término receptores inhibidores” incluye receptores que transmiten una señal negativa a una célula inmune.

Como se usa en la presente descripción, el término co-estimular, con referencia a las células inmune activadas, incluye la capacidad de una molécula coestimuladora para proporcionar una segunda señal sin activación mediada por el receptor (una señal co-estimuladora”) que induce la proliferación o función efectora. Por ejemplo, una señal co-estimuladora puede resultar en la secreción de citoquinas, por ejemplo, en una célula T que recibió una señal mediada por el receptor de la célula T. Las células inmunes que recibieron una señal mediada por el receptor de la célula, por ejemplo, a través de un receptor de activación, se refieren en la presente descripción como células inmunes activadas.

Una señal inhibidora que se transduce por un receptor inhibitorio puede ocurrir aún si un receptor co-estimulador (tal como CD28 o ICOS) no está presente en la célula inmune y, así, no es simplemente una función de competición entre los receptores inhibitorios y los receptores co-estimulatorios para la unión de las moléculas co-estimuladoras (Fallarino y otros (1998) J. Exp. Med. 188:205). La transmisión de una señal inhibitoria a una célula inmune puede resultar en falta de respuesta, anergia o muerte celular programada en la célula inmune. Preferentemente, la transmisión de una señal inhibitoria opera a través de un mecanismo que no involucra la apoptosis.

Como se usa en la presente descripción el término “apoptosis” incluye la muerte programada celular que se puede caracterizar usando procedimientos que son conocidos en la técnica. La muerte celular apoptótica se puede caracterizar por ei encogimiento celular, formación de ampollas en la membrana, y condensación de la cromatina que culmina en la fragmentación celular. Las células que sufren apoptosis despliegan también un patrón característico de la escisión del ADN internucleosomal.

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El término autoinmunidad o “enfermedad o afección autoinmune” en la presente descripción es una enfermedad o trastorno que surge de y dirigido contra los tejidos del propio individuo o una co-segregación o manifestación de éstas o afección que resulta posteriormente. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunes incluyen, pero no se limitan a artritis (artritis reumatoide tales como 4 artritis aguda, artritis reumatoide crónica, artritis gotosa, artritis gotosa aguda, artritis inflamatoria crónica, artritis degenerativa, artritis infecciosa, artritis de Lyme, artritis proliferativa, artritis psoriática, artritis vertebral, y artritis reumatoide juvenil osteoartritis, artritis crónica progrediente, artritis deformante, poliartritis crónica primaria, artritis reactiva, espondilitis anquilosante), enfermedades hiperproliferativas inflamatorias de la piel, psoriasis tales como psoriasis de placas, psoriasis en gotas, psoriasis pustulosa y psoriasis de las uñas, dermatitis que incluye dermatitis de contacto, dermatitis de contacto crónica, dermatitis alérgica dermatitis alérgica de contacto, dermatitis herpetiformis, y dermatitis atópica, síndrome hiper IgM ligado al cromosoma x, urticaria tales como urticaria crónica alérgica y urticaria idiopática crónica, que incluyen urticaria crónica autoinmune polimiositis/dermatomiositis, dermatomiositis juvenil, necrólisis tóxica epidérmica, esclerodermia (que incluye esclerodermia sistémica), esclerosis tal como esclerosis sistémica, esclerosis múltiple (MS), tales como MS espino óptica, MS progresiva primaria (PPMS), y MS recurrente remitente (RRMS), esclerosis sistémica progresiva, aterosclerosis, arteriesclerosis, esclerosis diseminada, y esclerosis atóxica, enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) (por ejemplo, enfermedad de Crohn, enfermedades gastrointestinales mediadas autoinmunes, colitis tales como la colitis ulcerativa, colitis ulcerosa, colitis microscópica, colitis colágena, colitis poliposa, enterocolitis necrotizante, y colitis transmural, y enfermedad autoinmune inflamatoria del intestino, pioderma gangrenoso, eritema nudoso, colangitis esclerosante primaria, epiescleritis), síndrome de dificultad respiratoria, incluyendo el síndrome de dificultad respiratoria aguda o del adulto (ARDS), meningitis inflamación de toda o parte de la úvea coroiditis, iritis, un trastorno autoinmune hematológico, espondilitis reumatoide, pérdida repentina de la audición enfermedades mediadas por IgE tales como anafilaxia y la rinitis alérgica y atópica encefalitis tales como la encefalitis de Rasmussen y encefalitis límbica y/o

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U1 encefalitis del tronco cerebral, uveítis, tales como uveítis anterior, uveítis anterior aguda, uveítis granulomatosa, uveítis no granulomatosa, uveítis facoantigénica, uveítis posterior, o uveítis autoinmune, glomerulonefritis (GN) con y sin síndrome nefrótico tal como glomerulonefritis crónica o aguda, tal como GN primaria, GN mediada inmune, GN membranosa (nefropatía membranosa), GN membranosa idiopática o nefropatía membranosa idiopática, GN proliferativa membrano-o membranosa (MPGN), que incluye Tipo I y Tipo II, y GN rápidamente progresiva, afecciones alérgicas, reacción alérgica, eczema incluyendo eczema alérgico o atópico, asma, tales como asma de bronquiolo, asma bronquial, y asma auto10 inmune, afecciones que involucran la infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas, enfermedad inflamatoria pulmonar crónica, miocarditis autoinmune, deficiencia de la adhesión de leucocitos, lupus eritematoso sistémico (SLE) o lupus eritematoso sistémico, tales como SLE cutáneo, lupus eritematoso cutáneo subagudo, síndrome de lupus neonatal (NLE), lupus eritematoso diseminado, lupus (que incluye nefritis, cerebritis pediátrica, no renal, extra-renal discoide, alopecia), diabetes mellitus (Tipo i) de inicio juvenil, incluyendo diabetes mellitus pediátrica dependiente de insulina (IDDM), diabetes mellitus de inicio en adulto (diabetes Tipo II), diabetes autoinmune, diabetes insípida idiopática, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad aguda y retardada mediada por citoquinas y linfocitos T, tuberculosis, sarcoidosis, granulomatosis incluyendo granulomatosis linfomatoide, granulomatosis de Wegener, agranulocitosis, vasculitis, incluyendo vasculitis (incluyendo vasculitis de vasos grandes (incluyendo polimialgia reumática y arteritis de (Takayasu) células gigantes)), vasculitis de vasos medianos (incluyendo enfermedad de Kawasaki y poliarteritis nudosa), poliarterltis microscópica, vasculitis del CNS, vasculitis necrotizante cutánea, o por hipersensibilidad, vasculitis necrotizante sistémica, y vasculitis asociada a ANCA tal como la vasculitis o síndrome de Churg-Strass (CSS)), arteritis temporal, anemia aplásica, anemia aplásica autoinmune, anemia positiva de Coombs, anemia

Diamond Blackfan, anemia hemolítica o anemia hemolítica inmune incluyendo anemia hemolítica autoinmune (AIHA), anemia perniciosa (anemia perniciosa) enfermedad de Addison, anemia pura de glóbulos rojos o aplasia (PRCA) deficiencia de factor VIII, hemofilia A, neutropenia autoinmune, pancitopenia,

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U1 leucopenia, enfermedades que involucran diapedesis de leucocito, trastornos inflamatorios del CNS, síndrome de lesión múltiple de órganos tales como aquellos secundarios a septicemia, trauma, o hemorragia, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de la membrana del basamento antl glomerular, síndrome de anticuerpo anti-fosfolípido, neuritis alérgica, enfermedad de Bechet o Behcet, síndrome de Castleman, síndrome de Goodpasture, síndrome de Reynaud, síndrome de Sjogren, síndrome de Stevens-Johnson, penfigoide tales como penfigoide ampollar y penfigoide de piel, pénfigo (incluyendo pénfigo vulgar, pénfigo foliáceo, pénfigo penfigoide de la membrana mucosa, y pénfigo eritematoso), poliendocrinopatías autoinmunes, enfermedad o síndrome de Reiter, nefritis compleja inmune, nefritis mediada por anticuerpos, neuromielitis óptica polineuropatías, neuropatía crónica como la polineuropatías IgM o neuropatía mediada por IgM, trombocitopenia (como el desarrollado por ejemplo por pacientes con infarto de miocardio), incluyendo púrpura trombocitopénica trombótica (TTP) y trombocitopenia autoinmune o mediada por inmunidad, tales como púrpura trombocitopénica idiopática (ITP) incluyendo ITP crónica o aguda, enfermedades autoinmune de los testículos y ovario incluyendo orquitis y ooforitis autoinmune hipotiroidismo primario, hipoparatiroidismo, enfermedades endocrinas autoinmunes incluyendo tiroiditis tales como tiroiditis autoinmune, enfermedad de Hashimoto, tiroiditis crónica (Tiroiditis de Hashimoto); o tiroiditis subaguda, enfermedad tiroidea autoinmune, hipotiroidismo idiopático, enfermedad de Graves, síndromes poliglandular tales como síndromes poliglandulares autoinmune (o síndromes de endocrinopatía poliglandular) síndromes paraneoplásicos, incluyendo los síndromes paraneoplásicos neurológicos tales como síndrome miasténico Lambert25

Eaton o síndrome de Eaton-Lambert, síndrome del hombre rígido o persona tiesa encefalomielitis tal como encefalomielitis alérgica o encefalomielitis alérgica y encefalomielitis alérgica experimental (EAE), miastenia gravis, tal como rniastenia gravis asociada timoma, degeneración del cerebelo, neuromiotonía, síndrome opsoclonus o opsoclonus mioclono (OMS), y neuropatía sensorial, neuropatía motora multifocal, síndrome de Sheehan, hepatitis autoinmune, hepatitis crónica, hepatitis lupoide, hepatitis de células gigantes, hepatitis activa crónica autoinmune o hepatitis activa crónica, neumonitis intersticial linfoide, bronquiolitis obliterante 38 £

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U1 (no-trasplante) versus NSIP, síndrome de Guillain-Barré, enfermedad de Berger (nefropatía por IgA), nefropatía idiopática por IgA, dermatosis lineal por IgA, cirrosis biliar primaría, pneumonocirrosis, síndrome de enteropatía autoinmune, enfermedad celíaca, enfermedad coelíaca, esprue celíaco (enteropatía por gluten), esprue refractario, sprue idiopático, crioglobulinemia, esclerosis lateral amiolotrófica (ALS, enfermedad de Lou Gehrig), enfermedad arterial coronaria, enfermedad autoinmune del oído como la enfermedad autoinmune del oído interno (AGED), pérdida autoinmune de la audición, síndrome opsoclonus mioclono (OMS), policondritis, tales como policondritis refractaria o recidivante, proteinosis alveolar pulmonar, amiloidosis, escleritis, una linfocitosis no-cancerosa, una linfocitosis primaria, que incluye linfocitosis monoclonales de células B (por ejemplo, gammapatía monoclonal benigna y gammapatía monoclonal de significado incierto, MGUS), neuropatía periférica, síndrome paraneoplásico, canalopatías tales como la epilepsia, migraña, arritmia, trastornos musculares, sordera, ceguera, parálisis periódica, y canalopatías del CNS autismo, miopatía inflamatoria, glomeruloesclerosis focal y segmentaria (FSGS), oftalmopatía endocrina, uveorretinitis, coriorretinitis, trastorno autoinmune hepatológico, fibromialgia, insuficiencia endocrina múltiple, síndrome de Schmidt, adrenalitis, atrofia gástrica, demencia presenil, enfermedades desmielinizantes tales como las enfermedades autoinmunitarias desmielinizantes, nefropatía diabética, síndrome de Dressler, alopecia Greata, síndrome CREST (calcinosis, Fenómeno de Raynaud, dismotilidad esofágica, esclerodactil y telangiectasia), infertilidad autoinmune de macho y hembra, enfermedad mixta del tejido conectivo, enfermedad de Chagas, fiebre reumática, aborto recurrente, pulmón del granjero, eritema multiforme, síndrome de post-cardiotomía, Síndrome de Cushing, pulmón del cuidador de palomas, vasculitis granulomatosa alérgica, Angeitis linfocítica benigna, síndrome de Alport alveolitis tal como alveolitis alérgica y alveolitis fibrosante, enfermedad pulmonar intersticial, reacción a la transfusión, lepra, malaria, leishmaniasis, kypanosomiasis, esquistosomiasis, ascariasis, aspergilosis, síndrome de Sampter, síndrome de Caplan, dengue, endocarditis, fibrosis endomiocárdica, fibrosis pulmonar intersticial difusa, fibrosis pulmonar intersticial, fibrosis pulmonar idiopática, fibrosis quística, endoftalmitis, eritema elevado y persistente, eritroblastosis fetal, fascitis eosínofílica, 39 £

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U1 síndrome de Shulman, síndrome de Felty, filariasis, ciclitis, tales como ciclitis crónica, ciclitis heterocrónicas, iridociclitis, o ciclitis de Fuch, púrpura de HenochSchonlein, infección por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), infección por virus ECHO, cardiomiopatía, enfermedad de Alzheimer, infección por parvovirus, infección por virus de la rubéola, síndromes de post-vacunación, infección por rubéola congénita, infección por ei virus de Epstein-Barr, paperas, síndrome de Evan, insuficiencia autoinmune gonadal, corea de Sydenham, nefritis postestreptocóccica, tromboangitis ubiterans, tirotoxicosis, tabes dorsalis, corioiditis, polimialgia de células gigantes, oftamopatía endocrina, neumonitis por hipersensibilidad crónica, queratoconjuntivitis seca, queratoconjuntivitis epidémica, síndrome nefrítico idiopático, nefropatía de cambios mínimos, lesión por isquemiareperfusión y familiar benigna, autoinmunidad retinal, inflamación de la articulación, bronquitis, enfermedad crónica obstructiva de las vías respiratorias, silicosis, aftas, estomatitis aftosa, trastornos arterioscleroticos, aspermiogenesis, hemolisis autoinmune, enfermedad de Boeck, crioglobulinemia, contractura de Dupuytren endoftalmía facoanafiláctica, enteritis alérgica, eritema nudoso leproso, parálisis facial idiopática, síndrome de fatiga crónica, fiebre reumática, enfermedad de

Hamman-RIch, pérdida de la audición sensoneural, hemoglobinuria paroxística hipogonadismo, ileítis regionalis, leucopenia, mononucleosis infecciosa, mielitis transversa, mixedema primario idiopático, nefrosis, oftalmía simpática, orquitis granulomatosa, pancreatitis, polirradiculitis aguda, pioderma gangrenoso, tiroiditis de Quervain, atrofia esplénica adquirida, infertilidad debido a anticuerpos antiespermatozoides, timoma no maligno, vitÍligo, enfermedades asociadas a virus de Epstein-Barr y SCID, síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) enfermedades parasitarias como Leishmania, síndrome de choque tóxico, intoxicación alimentaria, afecciones que involucran la infiltración de células T deficiencia de adhesión de leucocitos, respuestas inmunes asociadas con hipersensibilidad retardada y aguda mediada por citoquinas y linfocitos T, enfermedades que involucran diapedesis de leucocitos, síndrome de lesión de múltiples órganos, enfermedades mediadas por el complejo antígeno-anticuerpo, enfermedad de membrana de basamento antiglomerular neuritis alérgica, poliendocrinopatías autoinmunes, ovaritis, mixedema primario, gastritis atrófica 40 £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL o

U1 autoinmune, oftalmía simpática, enfermedades reumáticas, enfermedad del tejido conectivo mixto, síndrome nefrótico, insulitis, insuficiencia poliendocrina, neuropatía periférica, síndrome tipo I autoinmune poliglandular, hipoparatiroidismo idiopático de inicio en el adulto (AOIH), alopecia totalis, miocardiopatía dilatada, epidermólisis hullosa adquirida (EBA), hemocromatosis, miocarditis, síndrome nefrótico, colangitis esclerosante primaria, sinusitis purulenta o no purulenta, sinusitis aguda o crónica, sinusitis etmoidal, frontal, maxilar o esfenoidal, un trastorno relacionado con eosinófilos, tales como eosinofília, eosinofilia con infiltración pulmonar, síndrome de eosinofilia-mialgia, síndrome de Loffler, neumonía eosinofílica crónica, eosinofilia pulmonar tropical, aspergilosis bronconeumónica, aspergiioma o granulomas que contienen eosinófilos, anafilaxis, espondiloartritis seronegativas, enfermedad autoinmune poliendocrina, colangitis esclerosante, esclerótica, epiesclerótica, candidiasis mucocutánea crónica, síndrome de Bruton, hipogammaglobulinemia transitoria de la infancia, síndrome de Wiskott-Aldrich, ataxia telangiectasias, trastornos autoinmunes asociados con enfermedades del colágeno, reumatismo, enfermedad neurológica, trastorno de reperfusión isquémica, respuesta de reducción en la presión arterial, disfunción vascular, angiectasis, lesión de tejidos, isquemia cardiovascular, hiperalgesia, isquemia cerebral y enfermedad que acompaña la vascularización, trastornos de hipersensibilidad alérgica, glomerulonefritis, lesión por reperfusión, lesión por reperfusión del miocardio u otros tejidos, dermatosis con componentes inflamatorios agudos, meningitis purulenta aguda u otras enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central, trastornos inflamatorios ocular y orbital, síndromes de granulocitos asociados a la transfusión, toxicidad inducida por citoquinas, inflamación aguda grave, inflamación crónica intratable, pielitis, pneumonocirrosis, retinopatía diabética, trastorno diabético de la gran arteria, hiperplasia endoarterial, úlcera péptica, valvulitis y endometriosis.

Los términos “cáncer y “canceroso” se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer de pulmón (incluyendo

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en cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón), cáncer de peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer de páncreas, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma uterino o de endometrio, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B (incluyendo linfoma no Hodgkin folicular de bajo grado (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL); NHL folicular de grado intermedio, NHL difuso de grado intermedio, NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células pequeñas no hendidas de alto grado ; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto, linfoma relacionado con el SIDA, y la macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica, mieloma múltiple y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD).

La frase “enfermedad alérgica” se refiere a una enfermedad que involucra reacciones alérgicas. Más específicamente, una “enfermedad alérgica” se define como una enfermedad para la cual un alérgeno se identifica, donde existe una fuerte correlación entre la exposición a ese alérgeno y el inicio del cambio patológico, y donde ese cambio patológico se demostró tener un mecanismo inmunológico. En la presente descripción, un mecanismo inmunológico significa que los leucocitos muestran una respuesta inmune a la estimulación del alérgeno. Los ejemplos de alérgenos incluyen antígenos de ácaros y antígenos polínicos. Las enfermedades alérgicas representativas incluyen el asma bronquial, rinitis alérgica, dermatitis atópica, y alergias al polen e insectos. La diátesis alérgica es un factor genético que se puede heredar por los hijos de padres alérgicos. Las enfermedades alérgicas familiares se llaman también enfermedades atópicas, y el factor transmitido genéticamente, causante es la diátesis atópica. La “dermatitis atópica” es un término general para una enfermedad atópica, especialmente las

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U1 enfermedades acompañadas por síntomas de dermatitis. Los ejemplos preferidos incluyen la afección alérgica que se selecciona del grupo que consiste de eczema, rinitis alérgica, fiebre del heno, urticaria y alergias alimentarias. Las afecciones alérgicas incluyen eczema, rinitis alérgica o coriza, fiebre del heno, asma bronquial, urticaria (ronchas) y alergias alimentarias y otras afecciones atópicas.

El asma”- se refiere a un trastorno del sistema respiratorio caracterizado por la inflamación, estrechamiento de las vías respiratorias y aumento de la reactividad de las vías respiratorias a agentes inhalados. El asma está frecuentemente, aunque no exclusivamente asociado con síntomas atópicos o alérgicos.

La frase “afecciones inflamatorias o enfermedad inflamatoria” de la presente descripción incluye las enfermedades inflamatorias crónicas o agudas, incluyendo una enfermedad o afección seleccionada del grupo que comprende: enfermedades reumáticas (incluyendo pero no se limitan a artritis reumatoide, osteoartritis, artritis psoriásica) espondiloartropatías (incluyendo, pero no se limitan a la espondilitis anquilosante, artritis reactiva, síndrome de Reiter), artropatías por cristal (incluyendo pero no se limitan a gota, pseudogota, enfermedad de deposición de pirofosfato calcio), enfermedad de Lyme, polimialgia reumática; enfermedades del tejido conectivo (incluyendo pero no se limitan a lupus eritematoso sistémico esclerosis sistémica, polimiositis, dermatomiositis, síndrome de Sjogren); vasculitis (incluyendo, pero no se limitan a la poliarteritis nudosa, granulomatosis de Wegener, síndrome de Churg-Strauss); afecciones inflamatorias que incluyen consecuencias de, trauma o isquemia sarcoidosis; enfermedades vasculares, que incluyen enfermedad aterosclerótica vascular, aterosclerosis y enfermedad vascular oclusiva ( que incluyen pero no se limitan a aterosclerosis, enfermedad cardiaca isquémica, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, enfermedad vascular periférica), y reestenosis del stent vascular; enfermedades oculares, incluyendo uveítis, enfermedad de la córnea, iritis, iridociclitis, y cataratas;

El término cáncer susceptible de tratamiento en la presente invención incluye, pero no se limitan a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia o tumores malignos linfoides. Los ejemplos más particulares de dichos cánceres incluyen cáncer de vejiga, ovario, melanoma, células escamosas, cáncer de pulmón 43

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en (incluyendo cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón), cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o de estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal), cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o uterino carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñón o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y varios tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B (incluyendo linfoma no-Hodgkin folicular/de bajo grado (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL), NHL de grado intermedio/folicular, NHL difuso de grado intermedio y NHL inmunoblástico de alto grado, NHL linfoblástico de alto grado, NHL de células pequeñas no hendidas de alto grado; NHL de enfermedad voluminosa; linfoma de células del manto, linfoma relacionado con el SIDA, y la Macroglobulinemia de Waldenstrom); leucemia linfocítica crónica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (ALL); leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crónica y trastorno linfoproliferativo post-trasplante (PTLD), así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores del cerebro) y síndrome de Meigs. Preferentemente, el cáncer se selecciona del grupo que consiste de cáncer de mama, cáncer colorrectal, cáncer de recto, cáncer de pulmón de células no pequeñas, linfoma no-Hodgkins (NHL), cáncer de células renales, cáncer de próstata, cáncer de hígado cáncer de páncreas, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, cáncer de cabeza y cuello, melanoma, cáncer de ovario, mesotelioma, y mieloma múltiple. En una modalidad ilustrativa (ver ejemplos de trabajo), el cáncer es uno avanzado temprano (incluyendo metástasis) de vejiga, ovario o melanoma. En otra modalidad, el cáncer es el cáncer colorrectal. Las afecciones cancerosas susceptibles al tratamiento de la invención incluyen cánceres metastásicos en donde la expresión de VISTA por las células supresoras derivadas mieloides suprime las respuestas antitumorales y respuestas inmunes anti-invasivas. El método de la presente invención es particularmente adecuado para el tratamiento de tumores vascularizados.

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La invención es adecuada también para tratar los cánceres en combinación con quimioterapia o radioterapia u otros productos biológicos y para mejorar la actividad de éstos, es decir, en individuos en donde la expresión de VISTA por las células supresoras derivadas mieloides suprime las respuestas antitumorales y la eficacia de la quimioterapia o radioterapia o eficacia biológica. Cualquier agente quimioterapéutico que presenta actividad contra el cáncer se puede usar de acuerdo con la presente invención. Preferentemente, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de agentes alquilantes, antimetabolitos, análogos de ácido fólico, análogos de pirimidina, análogos de purina e inhibidores relacionados, alcaloides de la vinca epipodopilotoxinas, antibióticos, asparaginasa, inhibidores de la topoisomerasa, interferones, complejos de coordinación de platino, urea sustituida con antracenodiona, derivados de metil hidracina, supresorés adrenocorticales, adrenocorticosteroides, progestinas, estrógenos, antiestrógenos, andrógenos, antiandrógenos y análogo de la hormona liberadora de gonadotropina. Con mayor preferencia, el agente quimioterapéutico se selecciona del grupo que consiste de 5-fluorouracilo (5-FU), leucovorina (LV), irenotecano, oxaliplatino, capecitabina, paclitaxel y doxetaxel. Dos o más agentes quimioterapéuticos se pueden usar en un cóctel que se administra en combinación con la administración del anticuerpo anti-VEGF. Una combinación de quimioterapia preferida se basa en fluorouracilo, que comprende 5-FU y uno o más de otro agente(s) quimioterapéutico. Los regímenes de dosificación adecuados de quimioterapias de combinación se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo Saltz y otros (1999) Proc ASCO 18:233a y Douillard y otros (2000) Lancet 355: 1041-7. El producto biológico puede ser otros potenciadores inmunes tales como anticuerpos a PD-L1, PD-L2, CTLA-4 y proteínas de fusión PD-L1, PD-L2,

CTLA-4 así como citoquinas, antagonistas del factor de crecimiento y agonistas hormonas y anticuerpos anti-citoquinas.

Dependiendo de la forma de la molécula de PD-L3 o VISTA que se une a un receptor, una señal se puede transmitir (por ejemplo, por una forma multivalente de una molécula de PD-L3 o VISTA que resulta en el entrecruzamiento del receptor por una forma soluble de PDL3 o VISTA que se une a receptores de Fe en las

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U1 células presentadoras de antígeno) o inhibir (por ejemplo, por una forma soluble monovalente de una molécula de PD-L3 O VISTA o una forma soluble de PDL3 o VISTA que se altera usando métodos conocidos en la técnica, tal que no se unen receptores Fe sobre las células presentadoras de antígeno), por ejemplo, compitiendo con formas de activación de moléculas de PDL3 o VISTA para la unión al receptor. Sin embargo, hay casos en que una molécula soluble puede ser estimuladora. Los efectos de diversos agentes moduladores se pueden demostrar fácilmente usando ensayos de tamizaje de rutina, como se describe en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, el término receptor de activación incluye los receptores de células inmunes que se unen al antígeno, antígeno complejo (por ejemplo, en el contexto de moléculas MHC), o anticuerpos. Dichos receptores de activación incluyen receptores de células T (TCR), receptores de células B (BCR), receptores de citoquinas, receptores de LPS, receptores de complemento, y receptores Fe.

Por ejemplo, los receptores de células T están presentes en las células T y se asocian con las moléculas CD3. Los receptores de células T se estimulan por el antígeno en el contexto de las moléculas MHC (así como por reactivos policlonales que activan las células T). La activación de las células T a través de la TCR resulta en numerosos cambios, por ejemplo, fosforilación de proteína, cambios en la membrana lipídica, flujos de iones, alteraciones de nucleótidos cíclicos, cambios de transcripción de ARN, cambios en la síntesis de proteínas, y cambios de volumen celular.

El término receptor de células B (BCR) como se usa en la presente descripción incluye el complejo Ig transmembrana (mlg) y otros polipéptidos transmembrana (por ejemplo, Ig alfa e Ig beta) encontrado en células B. La función de transducción de señal de mlg se desencadena por el entrecruzamiento de las moléculas receptoras con los antígenos oligoméricos o multiméricos. Las células B se pueden activar también por los anticuerpos de anti-inmunoglobulinas. Después de la activación de BCR, numerosos cambios se producen en las células B, incluyendo la fosforilación de ia tirosina.

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o en

El término receptor Fe (FcRs) Incluye los receptores de superficie celular para la parte Fe de moléculas de inmunoglobulinas (Ig). Los receptores Fe se encuentran en muchas células que participan en la respuesta inmune. Entre los FcR humanos que se identificaron hasta ahora están aquellos que reconocen IgG (denominados gamma FcR), IgE (epsilon FcR1), IgA (alfa FcR), y polimerizado IgM/A (mu alfa FcR). Los FcR se encuentran en los siguientes tipos de células: epsilon FcRI (células cebadas), epsilon FcRIl (muchos leucocitos), alfa FcR (neutrófilos), y mu alfa FcR (epitelio glandular, hepatocitos) (Hogg, N. (1988)

Immunol. Today 9: 185-86). Los gamma FcR ampliamente estudiados son primordiales en las defensas inmunes celulares, y son responsables de estimular la liberación de mediadores de la inflamación y enzimas hidrolíticas involucradas en la patogénesis de enfermedades autoinmunes (Unkeless, J. C (1988) Annu. Rev. Immunol. 6:25 1-87). Los gamma FcR proporcionan un vínculo fundamental entre las células efectoras y los linfocitos que secretan Ig, ya que los leucocitos macrófago/monocito, polimorfonucleares y los gamma FcR de la célula agresora natural (NK) confiere un elemento de reconocimiento específico mediado por IgG. Los leucocitos humanos tienen al menos tres receptores diferentes para IgG: gamma FcRI h (que se encuentra en monocitos/macrófagos), gamma FcRIl h (en monocitos, neutrófilos, eosinófilos, plaquetas, posiblemente en células B, y la línea celular K562), y gamma Fclll (en las células NK, neutrófilos, eosinófilos macrófagos).

Con respecto a las células T, la transmisión de una señal co-estimuladora una célula T involucra una vía de señalización que no se inhibe por ia ciciosporina A. Además, una señal co-estimuladora puede inducir la secreción de citoquinas (por ejemplo, IL-2 y/o IL-10) en una célula T y/o pueden prevenir la inducción de la ausencia de respuesta al antígeno, la inducción de anergia, o la inducción de la muerte celular en la célula T.

Como se usa en la presente descripción, el término señal inhibidora se refiere a señal transmitida a través de una molécula receptora inhibidora sobre una célula inmune. Dicha señal antagoniza una señal a través de un receptor de activación (por ejemplo, a través de un TCR, CD3, BCR, o molécula de Fe) y puede £

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U1 resultar, por ejemplo, en la inhibición de: la generación del segundo mensajero; proliferación, o función efectora en la célula inmune, por ejemplo, fagocitosis reducida, producción de anticuerpos, o citotoxicidad celular, o el fracaso de la célula inmune para producir mediadores (tales como citoquinas (por ejemplo, IL-2) y/o mediadores de las respuestas alérgicas); o el desarrollo de anergia.

Como se usa en la presente descripción, el término ausencia de respuesta incluye la refractividad de las células inmunes a la estimulación, por ejemplo, la estimulación a través de un receptor activador o una citoquina.

La ausencia de respuesta puede ocurrir, por ejemplo, debido a la exposición a inmunosupresores o altas dosis de antígeno.

Como se usa en la presente descripción, el término anergia o tolerancia incluye la refractividad a la estimulación mediada por el receptor de activación. Dicha refractividad es generalmente antígeno-específica y persiste después que ha cesado la exposición al antígeno de tolerancia. Por ejemplo, la anergia en las células T (a diferencia de la ausencia de respuesta) se caracteriza por la carencia > j de producción de citoquinas, por ejemplo, IL-2. La anergia de células T se produce hcuando las células T se exponen al antígeno y reciben una primera señal (un receptor de células T o señal mediada por CD-3) en la ausencia de una segunda señal (una señal co-estimuladora). Bajo estas condiciones, la re-exposición de las células al mismo antígeno (incluso si se produce la re-exposición en la presencia de una molécula co-estimuladora) resulta en el fracaso para producir citoquinas y, así, ei fracaso para proliferar. Las células T anérgicas, sin embargo, pueden acumular respuestas a antígenos sin conexión y pueden proliferar si se cultivan con citoquinas (por ejemplo, IL-2). Por ejemplo, la anergia de células T se puede observar también mediante la carencia de producción de IL-2 por los linfocitos T como se mide por ELISA o por un ensayo de proliferación usando una línea celular Indicadora. Como alternativa, se puede usar un gen reportero constructo. Por ejemplo, las células T anérgicas fracasan para iniciar la transcripción génica de IL-2 inducida por un promotor heterólogo bajo el control del potenciador del gen 5 'de IL2 o por un multímero de la secuencia de API que se puede encontrar dentro del potenciador (Kang y otros (1992) Science 257:1134).

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La modulación de una señal co-estimuladora resulta en la modulación de la función efectora de una célula inmune. Así, el término actividad de PD-L3 o VISTA incluye la capacidad de un polipéptido PD-L3 o VISTA para unirse a su pareja(s) de unión natural, la capacidad para modular las señales co-estimuladoras o inhibidoras de células inmunes, y la capacidad para modular la respuesta inmune.

La modulación de una señal inhibidora en una célula inmune resulta en la modulación de la proliferación y/o secreción de citoquinas por una célula inmune.

Como se usa en la presente descripción, una molécula de ácido nucleico de origen natural se refiere a con una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se origina en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína natural).

Como se usa en la presente descripción, una molécula de ácido nucleico antisentido comprende una secuencia de nucleótido que es complementaria a un ácido nucleico sentido que codifica una proteína, por ejemplo, complementaria a la cadena codificante de una molécula de ADNc de doble cadena, complementaria a una secuencia de ARNm o complementaria a la cadena codificante de un gen.

Como consecuencia, una molécula de ácido nucleico antisentido puede enlazar el hidrógeno a una molécula de ácido nucleico sentido.

Como se usa en la presente descripción, el término región codificante se refiere a regiones de una secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos, mientras que el término región no codificante se refiere a regiones de una secuencia de nucleótidos que traducen en aminoácidos (por ejemplo, regiones 5’ y 3’ sin traducir).

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Como se usa en la presente descripción, el término vector se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otra molécula de ácido nucleico que se le unió. Un tipo de vector es un plásmido, que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena dentro del cual se pueden ligar segmentos de ADN adicionales. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales se pueden ligar en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de la replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen

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DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL en (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen una replicación de origen bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se integran en el genoma de una célula huésped después de la introducción en la célula huésped, y de ese modo se replican junto con el genoma huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se unen operativamente. Dichos vectores se denominan en la presente descripción como vectores de expresión recombinantes o simplemente vectores de expresión. En general, los vectores de expresión de utilidad en los técnicas de ADN recombinante frecuentemente están en la forma de plásmidos. En la presente especificación, plásmido y vector, se pueden usar indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector más comúnmente usada. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de dichos vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, virus adenovirus y adeno-asociado), que sirven para funciones equivalentes.

Como se usa en la presente descripción, el término célula huésped, pretende referirse a una célula en la que se introdujo una molécula de ácido nucleico de la invención, tal como un vector de expresión recombinante de la invención. Los términos célula huésped y célula huésped recombinante se usan indistintamente en la presente descripción. Se debe entender que dichos términos no sólo se refieren a la célula del individuo en particular sino a la progenie o progenie potencial de dicha célula. A causa de determinadas modificaciones que se pueden producir en las sucesivas generaciones ya sea debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero todavía se incluye dentro del alcance del término que se usa en la presente descripción.

Como se usa en la presente descripción, un animal transgénico se refiere a un animal no humano, preferentemente un mamífero, con mayor preferencia un ratón, en el que una o más de las células del animal incluyen un transgén. El término transgén se refiere a un ADN exógeno que se integra dentro del genoma de una célula a partir de la que se desarrolla un animal transgénico y que

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o en permanece en el genoma del animal maduro, por ejemplo dirigiendo la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del animal transgénico.

Como se usa en la presente descripción, un animal homólogo recombinante se refiere a un tipo de animal transgénico no humano, preferentemente un mamífero, con mayor preferencia un ratón, en el que se alteró un gen endógeno mediante recombinación homologa entre el gen endógeno y una molécula de ADN exógena introducida en una célula del animal, por ejemplo, una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal.

Como se usa en la presente descripción, una proteína aislada se refiere a una proteína que es sustancialmente libre de otras proteínas, material celular y medio de cultivo cuando se aísla a partir de las células o producida por técnicas de ADN recombinante, o precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Una proteína aislada o purificada o parte biológicamente activa de ésta es sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la * fuente de célula o tejido de la que se deriva la proteína PD-L3 o VISTA, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína PD-L3 o VISTA en la que la proteína se separa de los componentes celulares de las células a partir del cual se aísla o produce de manera recombinante. En una modalidad, la expresión sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína PD-L3 o VISTA que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteína no-PD-L3 o VISTA (referida también en este documento como una proteína contaminante) con mayor preferencia menos de aproximadamente 20% de proteína no-PD-L3 o VISTA, aún con mayor preferencia menos de aproximadamente 10% de proteína no-PD-L3 o VISTA, y con máxima preferencia menos de aproximadamente 5% de proteína no-PD-L3 o VISTA. Cuando la proteína PD-L3 o VISTA o parte biológicamente activa de ésta se produce de manera recombinante, se prefiere también sustancialmente libre de medio de cultivo, es decir, el medio de cultivo

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U1 representa menos de aproximadamente 20%, de mayor preferencia menos de aproximadamente 10%. y con máxima preferencia menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de la proteína PD-L3 o VISTA en la que la proteína se separa de precursores químicos u otros productos químicos que se involucran en la síntesis de la proteína. En una modalidad, la expresión sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye preparaciones de la proteína PD-L3 o VISTA que tiene menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos no-PD-L3 o VISTA, con mayor preferencia menos de aproximadamente 20% de precursores químicos o productos químicos no-PD-L3 o VISTA, aún con mayor preferencia menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos no-PD-L3 o VISTA, y con máxima preferencia menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos no-PD-L3 o VISTA.

El término anticuerpo, como se usa en la presente descripción, incluye una parte de unión al antígeno de un anticuerpo (o simplemente parte de anticuerpo), así como moléculas enteras de anticuerpo. El término parte de unión al antígeno, tal como se usa en la presente descripción, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que, conserva la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (por ejemplo, PD-L3 o VISTA). Se demostró que la función de unión al antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo completo. Los ejemplos de fragmentos de unión que se incluyen dentro del término parte de unión al antígeno de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH1; (¡i) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (iii) un fragmento Fd que consiste en los dominios VH y CH1; (iv) un fragmento Fv que consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; (v) un fragmento dAb (Ward y otros (1989) Nature 341:544-546). que consiste en un dominio VH; y (vi) una región determinante de complementariedad aislada (CDR).

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Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se codifican por genes separados, se pueden unir, usando métodos recombinantes, por un enlazador sintético que les permite prepararse como una cadena proteica sencilla en la que las regiones VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes (conocidos como Fv de cadena sencilla (scFv); ver, por ejemplo, Bird y otros (1988) Science 242:423 -426, y Huston y otros (1988) Proc Nati. Acad. Sci. USA 85:58795883, y Osbourn y otros 1998 Nat. Biotechnol. 16:778). Dichos anticuerpos de cadena sencilla se pretenden también incluir dentro del término parte de unión al antígeno de un anticuerpo. Cualquiera de las secuencias VH y VL de scFv específico se pueden enlazar con el ADNc de la región constante de la inmunoglobulina humana o secuencias genómicas, para generar vectores de expresión que codifican moléculas completas de IgG u otros isotipos. VH y VL se pueden usar también en la generación de Fab, Fv, u otros fragmentos de ínmunoglobulinas ya sea usando química de proteínas o tecnología de ADN recombinante. Otras formas de anticuerpos de cadena sencilla, tales como diacuerpos se incluyen también. Los diacuerpos son anticuerpos bivalentes, biespecíficos en los que los dominios VH y VL se expresan en una única cadena polipeptídica, pero que usan un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de ese modo a los dominios a aparearse con los dominios complementarios de otra cadena creando dos sitios de unión al antígeno (ver, por ejemplo, Holliger, P. y otros (1993) Proc Nati Acad Sci USA 90:6444-6448; Poljak, RJ y otros (1994) Structure 2:11211123).

Más aún, un anticuerpo o parte de éste de unión al antígeno pueden ser parte de moléculas más grandes de inmunoadhesión, formadas por asociación covalente o no covalente del anticuerpo o parte del anticuerpo con una o más de otras proteínas o péptidos. Ejemplos de tales moléculas inmunoadhesión incluyen el uso de la región del núcleo de estreptavidina para generar una molécula tetramérica scFv (Kipriyanov, SM y otros (1995) Hum. Antibodies Hybridomas 6:93101) y el uso de un residuo de cisteína, un péptido marcador y una etiqueta Cterminal de polihistidina para hacer moléculas de scFv bivalentes y biotiniladas £

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σι (Kipriyanov, SM y otros (1994) Mol Immunol. 31: 1047-1058). Las partes del anticuerpo, tales como fragmentos Fab y F (ab') 2, se pueden preparar a partir de anticuerpos enteros usando técnicas convencionales, tales como digestión de los anticuerpos enteros con papaína o pepsina, respectivamente. Además, los anticuerpos, partes del anticuerpo y moléculas de inmunoadhesión se pueden obtener usando técnicas estándares de ADN recombinante, como se describe en la presente invención.

Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales; xenogénicos, alogénicos; o formas modificadas de éstos, por ejemplo, humanizados, quimérico, etc. Preferentemente; los anticuerpos de la invención se unen específicamente o sustancialmente de manera específica a moléculas PD-L3 o VISTA. Los términos anticuerpos monoclonales” y ” composición de anticuerpo monoclonal”, como se usa en la presente descripción, se refieren a una población de moléculas de anticuerpos que contienen una única especie de un sitio de unión al antígeno capaz de inmunoreaccionar con un epítopo en particular de un antígeno, mientras que el término anticuerpos policlonales y composición de anticuerpos policlonales se refieren a una población de moléculas de anticuerpos que contienen múltiples especies de sitios de unión al antígeno capaces de interactuar con un antígeno en particular. Una composición de anticuerpo monoclonal, típicamente muestra una afinidad de unión única por un antígeno en particular con el que inmunoreacciona.

El término anticuerpo humanizado, como se usa en la presente descripción, pretende incluir los anticuerpos generados por una célula no humana que tiene regiones variables y constantes que se alteraron para asemejarse más a los anticuerpos que serían generados por una célula humana. Por ejemplo, alterando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo no humano para incorporar aminoácidos que se encuentran en las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanizados de la invención pueden incluir residuos de aminoácidos no codificados por las secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas al azar o mutagénesis sito especifica in vitro o por mutación somática in vivo), por ejemplo en las COR. El término anticuerpo humanizado, como se usa en la presente £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL descripción, incluye también anticuerpos en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se insertó en las secuencias humanas marco.

Un anticuerpo aislado, como se usa en la presente descripción, pretende referirse a un anticuerpo que está sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferentes especificidades antigénicas (por ejemplo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a PD-L3 o VISTA está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos distintos de PD-L3 o VISTA). Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares y/o productos químicos.

Un dominio de oligomerización en la presente descripción se refiere a un dominio que cuando se une a un dominio extracelular VISTA o fragmento de éste, facilita la oligomerización. Dichos dominios de oligomerización comprenden la autoasociación alfa-hélices, por ejemplo, cremallera de leucina, que se puede estabilizar además por puentes disulfuros adicionales. Los dominios se diseñan para ser compatibles con el plegado vectorial a través de una membrana, un pensamiento en proceso para facilitar el plegamiento in vivo del polipéptido en una proteína de unión funcional. Los ejemplos de éstos se conocen en la técnica e incluyen a modo de ejemplo espirales de GCN4, y COMP.

El espiral enrollado alfa-helicoidal es probablemente el motivo de la subunidad de oligomerización más ampliamente difundido en las proteínas. Como consecuencia, el espiral enrollado cumplen una variedad de diferentes funciones. En varias familias de activadores de la transcripción, por ejemplo, en el ADN las cremalleras cortas de leucina juegan un papel importante en el posicionamiento de las regiones de unión al ADN (Ellenberger y otros, 1992, Cell 71:1223-1237). El espiral enrollado se usa también para formar oligómeros de proteínas de filamentos intermedios. Las proteínas de espiral enrollado, además, parecen desempeñar un papel importante tanto en la fusión viral a vesículas como a membrana (Skehel y Wiley, 1998, Cell 95:871-874). En ambos casos las secuencias hidrófobas, embebidas en las membranas que se fusionan, se encuentran en el mismo extremo del complejo en forma de varilla compuestas de un haz de muchas alfa-hélices.

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Este arreglo molecular se cree que causa aposición al cierre de la membrana ya que los complejos se ensamblan por fusión de membrana. El enrollado en espiral se usa frecuentemente para controlar la oligomerización. Se encuentra en muchos tipos de proteínas, incluyendo factores de transcripción tales como, pero sin limitarse a GCN4, péptidos virales de fusión, complejos SNARE y determinadas ARNt sintetasas, entre otros. El espiral enrollado muy largo se encuentran en proteínas tales como tropomiosina, filamentos intermedios y componentes det cuerpo polar del huso. El espiral enrollado involucra una serie de aifa-hélices que se superenrollan alrededor una de otra de una manera altamente organizada asociándose en una orientación paralela o una antiparalela. Aunque ios dímeros y trímeros son los más comunes. Las hélices pueden ser de la misma o de diferentes proteínas. El enrollado en espiral se forma por hélices de componentes que se reúnen para ocultar sus costuras hidrofóbas. Como las costuras hidrófobas se toreen alrededor de cada hélice, entonces las hélices se toreen también para enrollarse alrededor una de otra, ocultando las costuras hidrófobas y formando un superenrollamiento. Esta es la interdigitación característica de las cadenas laterales entre hélices vecinas, conocida como empaquetamiento de perilla en agujero, que define la estructura como un enrollado en espiral. Las hélices no tienen que correr en la misma dirección para que este tipo de interacción se produzca, aunque es más común la conformación paralela. La conformación antiparalela es muy rara en trímeros y desconocida en pentámeros, pero más común en dímeros intramoleculares, donde las dos hélices se conectan frecuentemente por un corto bucle. En el espacio extracelular, el enrollado en espiral heterotrimérico de la proteína laminina juega un papel importante en la formación de las membranas básales. Otros ejemplos son las trombospondinas y proteína oligomérica de la matriz del cartílago (COMP) en la que se conectan tres (trombospondinas 1 y 2) o cinco cadenas (trombospondinas 3, 4 y COMP). Las moléculas tienen una apariencia similar a ramo de flores, y la razón de su estructura oligomérica probablemente es la interacción multivalente de los dominios C-terminales con los receptores celulares. Ei activador transcripcional de levadura GCN4 es 1 de más de 30 proteínas eucarióticas identificadas que contienen el motivo que se une al ADN de la región básica de la cremallera de leucina (bZIP) (Ellenberger y otros, 1992, 56

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en

Cell 71:1223-1237). El dímero bZIP es un par de alfa hélices continuas que forman un enrollado en espiral paralelo sobre sus 34 residuos carboxi-terminal y divergen gradualmente hacia su amino terminal para pasar a través de la ranura mayor del sitio de unión al ADN. La interfaz en la dimerización del enrollado en espiral se orienta casi perpendicular al eje de las ADN, dando al complejo la apariencia de la letra T. El bZIP contiene una repetición de 4-3 heptad de residuos hidrófobos y no polares que se empaquetan juntos en un enrollado en espiral alfa-helicoidal (Ellenberger y otros, 1992, Cell 71:1223-1237). La estabilidad del dímero resulta del empaquetado de lado a lado de leucinas y residuos no polares en las posiciones y d de la repetición heptad, así como un número limitado de puentes salinos intra15 interhelicoidal, que se muestran en una estructura cristalina del péptido GCN4 de la cremallera de leucina (Ellenberger y otros, 1992, Cell 71:1223-1237). Otro ejemplo es CMP (matrilin-1) aislado del cartílago de la tráquea bovina como un homotrímero de subunidades de masa 52,000 (Paulsson y Heinegard, 1981, Biochem J. 197: *

367-375), donde cada subunidad consta de un módulo vWFA1, un dominio único ΕθΡ» un módulo vWFA2 y un dominio enrollado en espiral que atraviesa cinco heptads (Kiss y otros, 1989, J. Biol. Chem. 264:8126-8134; Hauser y Paulsson, 1994, J. Biol. Chem. 269:25747-25753). La microscopía electrónica de CMP purificada mostró una estructura de trímero similar al ramo de flores en el que cada subunidad forma un elipsoide que emerge desde un punto común correspondiente al enrollado en espiral (Hauser y Paulsson, 1994, J. Biol. Chem. 269:25747-25753); El dominio enrollado en espiral en matrilin-1 se estudió ampliamente. La estructura trimérica se conserva después de la reducción completa de enlaces d¡sulfuro intercatenarios en condiciones no desnaturalizantes (Hauser y Paulsson, 1994, J. Biol. Chem. 269.25747-25753). Aún otro ejemplo es la proteína de matriz oligomérica del cartílago (COMP). Una glícoproteína no colagenosa, COMP, se identificó por primera vez en cartílago (Hedbom y otros, 1992, J. Biol. Chem. 267:6132-6136). La proteína es un homo-pentámero de 524 kDa de cinco subunidades que consta de una región N-terminal de repetición heptad (cc) seguido de cuatro dominios (EF) similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF), siete dominios (T3) que unen al calcio y un dominio globular C-terminal (TC). De acuerdo con esta organización de dominio, COMP pertenece a la familia de las 57

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OI trombospondinas. Heptad repite (abcdefg).sub.n con residuos preferentemente hidrófobos en las posiciones a y d de los dominios espirales enrollados de forma helicoidal (Cohén y Parry, 1994, Science 263:488-489). Recientemente, el dominio recombinante de cinco cadenas espirales enrolladas de COMP (COMPcc) se cristalizó y su estructura se resolvió en 0.2 nm de resolución (Malashkevich y otros, 1996. Science 274:761-765).

El término familia cuando se refiere a las moléculas de polipéptidos y ácido nucleico de la invención pretende significar dos o más moléculas de polipéptido o ácido nucleico que tienen un dominio o motivo estructural común y que tienen suficiente homología de secuencia de aminoácidos o nucleótidos como se define en la presente descripción. Dichos miembros de la familia pueden ser de origen natural o no-natural y pueden ser ya sea de la misma o diferente especie. Por ejemplo, una familia puede contener un primer polipéptido de origen humano, así como otros, polipéptidos distintos de origen humano o como alternativa, pueden contener homólogos de origen no-humano, por ejemplo, polipéptidos de mono. Los miembros de una familia pueden tener también características funcionales comunes.

Por ejemplo, la familia de polipéptidos PD-L3 o VISTA de la presente invención comprende preferentemente al menos un dominio de péptido de señal. Como se usa en la presente descripción, una secuencia señal o péptido señal incluye un péptido que contiene aproximadamente 15 o más aminoácidos que se presentan en el extremo N-terminal de polipéptidos unidos a membrana y de secreción y que contiene un gran número de residuos de aminoácidos hidrófobos. Por ejemplo, una secuencia señal contiene al menos aproximadamente 10-30 residuos de aminoácidos, preferentemente aproximadamente 15-25 residuos de aminoácidos, con mayor preferencia aproximadamente 18-20 residuos de aminoácidos, y con aún mayor preferencia de aproximadamente 19 residuos de aminoácidos, y tiene al menos aproximadamente 35-65%, preferentemente de aproximadamente 38-50%, y con mayor preferencia de aproximadamente 40-45% residuos de aminoácidos hidrófobos (por ejemplo, valina, leucina, isoleucina o fenilalanina). Dicha secuencia señal, también denominada en la técnica como un

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en péptido señal, sirve para dirigir un polipéptido que contiene dicha secuencia a una bicapa lipídica, y se escinde en polipéptidos unidos a membrana y secretados. Como se describe más abajo una secuencia señal se identificó en la secuencia de aminoácido de PD-L3 o VISTA nativo humano y también se identificó en la secuencia de aminoácidos de PD-L3 o VISTA nativo de ratón.

otra modalidad de la invención, un polipéptido PD-L3 o VISTA de la presente invención se identifica en función de la presencia de un dominio transmembrana. Como se usa en la presente descripción el término dominio transmembrana incluye una secuencia de aminoácidos de aproximadamente 15 residuos de aminoácidos de longitud que atraviesa la membrana plasmática. Con mayor preferencia, un dominio transmembrana incluye aproximadamente al menos 20, 25, 30, 35, 40, ó 45 residuos de aminoácidos y atraviesa la membrana plasmática. Los dominios transmembrana son ricos en residuos hidrófobos, y tienen típicamente una estructura de hélice alfa. En una modalidad preferida, al menos 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o más de los aminoácidos de un dominio transmembrana hidrófobo son, por ejemplo, leucinas, ísoleucinas, tirosinas, o triptófanos. Los dominios transmembrana se describen en, por ejemplo, Zagotta, W.N. y otros (1996) Annu. Rev. Neurosci. 19:235-263, cuyos contenidos se incorporan como referencia en la presente descripción. La región de dominio de transmembrana de PDL3 se identifica en la presente descripción (ver, por ejemplo, Figura 1).

En otra modalidad, una molécula PD-L3 o VISTA de la presente invención se identifica en función de la ausencia de un dominio C de Ig y la presencia de un dominio IgV en el polipéptido o molécula de ácido nucleico correspondiente. Como se usa en la presente descripción, los dominios IgV e IgC se reconocen en la técnica como dominios miembros de la superfamilia de Ig. Estos dominios corresponden a las unidades estructurales que tienen diferentes patrones de plegado llamados pliegues de Ig. Los pliegues de Ig se componen de un sándwich de dos láminas beta, cada una que consisten de cadenas beta antiparalelas de 510 aminoácidos con un enlace disulfuro conservado entre tas dos hojas en la mayoría, pero no en todos, los dominios. Los dominios IgC de las moléculas Ig, £

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en

TCR, y MHC comparten ios mismos tipos de patrones de secuencia y se llaman conjunto C1 en la superfarnilia de ig. Otros dominios IgC caen dentro de otros conjuntos. Los dominios IgV comparten también patrones de secuencia y se llaman dominios del conjunto V. Los dominios IgV son más largos que los dominios C y forman un par adicional de cadenas beta. Los residuos de aminoácidos del polipéptido PD-L3 o VISTA nativo humano y murino, que constituyen el dominio IgV se puede ver en la Figura 1. La presencia de un dominio de IgV es probable que sea necesario para la unión de PD-L3 o VISTA a su pareja(s) de unión natural.

En otra modalidad, una molécula PD-L3 o VISTA de la presente invención se identifica en función de la presencia de un dominio extracelular en el polipéptido o molécula de ácido nucleico correspondiente. Como se usa en la presente descripción, el término dominio extracelular representan ios aminoácidos Nterminales que se extienden como una cola desde la superficie de una célula. Un dominio extracelular de la presente invención incluye un dominio IgV y puede incluir un dominio de péptido señal. (Ver Figura 1).

En aún otra modalidad, una molécula PD-L3 o VISTA de la presente invención se identifica en función de la presencia de un dominio citoplasmático en el polipéptido o molécula de ácido nucleico correspondiente. Como se usa en la presente descripción, el término dominio citoplasmático” representa los aminoácidos C-terminales, que se extienden como una cola en el citoplasma de una célula prevista para comprender dominios citoplasmático.

En una modalidad preferida, las moléculas de PD-L3 o VISTA de la invención incluyen al menos uno o más de los siguientes dominios: un dominio de péptido señal, un dominio IgV, un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático.

Los polipéptidos aislados de la presente invención, preferentemente polipéptidos PD-L3 o VISTA, tienen una secuencia de aminoácidos suficientemente idéntica a la secuencia de aminoácidos de las sec. con núms. de ident. 2 ó 4, ó 5 o están codificadas por una secuencia de nucleótidos suficientemente idéntica a las sec. con núms. de ident. 1 ó 3 o un fragmento o complemento de ésta. Como se usa en la presente descripción, el término suficientemente idéntica se refiere a 60

IMPI o

en una primera secuencia de aminoácidos o nucleótidos que contiene un número suficiente o mínimo de residuos de aminoácidos o nucleótidos idénticos o equivalentes (por ejemplo, un residuo de amino ácido que tiene una cadena lateral similar) a una segunda secuencia de aminoácidos o nucleótidos tal que las primeras y segundas secuencias de aminoácidos o nucleótidos comparten los dominios o motivos estructurales comunes y/o una actividad funcional común. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que comparten dominios estructurales comunes tienen al menos 30%, 40%, o 50% de homología preferentemente 60% de homología, con mayor preferencia 70%-80% y aún con mayor preferencia 90-95% de homología a través de las secuencias de aminoácidos de los dominios y contienen al menos uno o preferentemente dos dominios estructurales o motivos, que se definen en la presente descripción como suficientemente idénticos.

Además, las secuencias de aminoácidos o nucleótidos que comparten al menos

30% 40%, o 50% preferentemente 60%, con mayor preferencia 70-80%, ó 90-95% de homología y comparten una actividad funcional común se definen en la presente descripción como suficientemente idénticas.

Como se usa indistintamente en la presente descripción, actividad de PD-L3 o VISTA, actividad biológica de PD-L3 o VISTA o actividad funcional de PD-L3 o VISTA, se refiere a una actividad ejercida por una proteína PD-L3 o VISTA, polipéptido o molécula de ácido nucleico en una célula o tejido sensible a PD-L3 o

VISTA, o en una pareja de unión del polipéptido PD-L3 o VISTA, como se determina in vivo, o in vitro, de acuerdo con las técnicas estándares. Estas actividades incluyen modular la proliferación de células T CD4+ y CD8+ y producción de citoquinas. En otra modalidad, una actividad de PD-L3 o VISTA es una actividad directa, tal como una asociación con una pareja de unión de PD-L3 o VISTA. Como se usa en la presente descripción, una molécula objetivo o pareja de unión es una molécula con la que un polipéptido PD-L3 o VISTA se une o interacciona en la naturaleza, es decir, expresado en una célula T, tal que se logra la función mediada por PD-L3 o VISTA. Como alternativa, una actividad de PD-L3 o

VISTA es una actividad indirecta, tal como una actividad de señalización celular

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL mediada por el polipéptido PD-L3 o VISTA. Las actividades biológicas de PD-L3 o VISTA se describen en la presente descripción. Por ejemplo, los polipéptidos PD-L3 4.

o VISTA y agonistas o antagonistas de PD-L3 o VISTA de la presente invención puede tener una o más de las siguientes actividades: (1) suprimir o promover la proliferación de células T CD4+ y CD8+, (2) suprimir o promover la producción de citoquinas (3) funcionar como un ligando regulador que regula negativamente las respuestas de células T durante las interacciones análogas entre células T y las APC derivadas mieloides (4) regular negativamente las respuestas de células T CD4+ mediante la supresión temprana de la activación de TCR y detención de la división celular, pero con el mínimo impacto directo sobre la apoptosis, (5) suprimir o promover la activación de células T específica al antígeno durante las interacciones análogas entre las APC y células T y/o (6) suprimir o promover las respuestas inmunes mediadas por células T; (7) modular la activación de las células inmunes, por ejemplo, linfocitos T, y (8) modular la respuesta inmune, por ejemplo, respuesta, inflamatoria inmune de un organismo, por ejemplo, un ratón o un organismo humano.

Como consecuencia, otra modalidad de la invención cuenta con las proteínas y polipéptidos aislados de PD-L3 o VISTA que modulan una o más actividades de PD-L3 o VISTA. Estos polipéptidos incluirán polipéptidos de PD-L3 o VISTA que tienen uno o más de los siguientes dominios: un dominio péptido señal, un dominio IgV, un dominio extracelular, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático, y, preferentemente, una actividad de PD-L3 o VISTA.

Los polipéptidos preferidos de PD-L3 o VISTA además pueden tener al menos un dominio extracelular, y uno o más de un dominio de péptido señal, un dominio IgV, un dominio transmembrana, y un dominio citoplasmático, y son, preferentemente, codificados por una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos que se híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación a una molécula de ácido nucleico que comprende en la presente descripción un complemento de la secuencia de nucleótidos de las sec. con núms. de ident.:1 ó 3. La secuencia de nucleótidos y aminoácidos de la secuencia del ADNc aislado y ejemplificado de PD-L3 o VISTA humano y murino y la secuencia de aminoácidos o

en

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en predicha del polipéptido PD-L3 o VISTA humano se incluyen en la lista de secuencias de la presente descripción.

VISTA humano o PD-L3 o VISTA se identificó como una molécula regulada positivamente en un tamizaje del perfil transcripcional de células T. Nuestra caracterización de un producto génico idéntico de 930 pb recuperado de una biblioteca de ADNc de células T CD4⁺ murinas confirmó el tamaño y secuencia. La secuencia in sílico y el análisis estructural predicen una proteína transmembrana de tipo I de 309 aminoácidos después de la maduración. Su dominio extracelular contiene un solo dominio Ig-V extracelular de 136 aminoácidos, que se une a una región del tallo de 23 aminoácidos, un segmento transmembrana de 21 residuos un dominio citoplasmático de 97 aminoácidos. La cola citoplásmica de VISTA , y no contiene ningún dominio de señalización. Una búsqueda de secuencia en BLAST con el dominio Ig-V de VISTA identificó el PD-L1 de la familia B7 como el más cercano evolutivamente de la proteína relacionada con una puntuación límite del valor E significativo. Una alineación de la secuencia basada en la estructura de VISTA con los miembros de la familia B7 PD-L1, PD-L2, B7-H3, y B7-H4 destaca varios aminoácidos que se conservan sistemáticamente en todos los dominios Ig-V de las proteínas.

Diversos aspectos de la invención se describen con más detalle en la siguientes subsecciones:

I. Moléculas aisladas de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA

Un aspecto de la invención corresponde con moléculas aisladas de ácidos nucleicos que codifican polipéptidos de PD-L3 o VISTA o partes biológicamente activas de éstos, así como fragmentos de ácidos nucleicos suficientes para como sondas de hibridación para identificar moléculas de ácido nucleico usar que codifican PD-L3 o VISTA (por ejemplo, ARNm de PD-L3 o VISTA) y fragmentos para usar como cebadores de PCR para la amplificación o mutación de moléculas de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA. Como se usa en la presente descripción, el término molécula de ácido nucleico pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARNm) y análogos del ADN o ARN generados usando análogos de nucleótidos. La molécula 63 £

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U1 de ácido nucleico puede ser de simple cadena o de doble cadena, pero preferentemente es ADN de doble cadena.

El término molécula aislada de ácido nucleico incluye las moléculas de ácido nucleico que se separan de otras moléculas de ácido nucleico que están presentes en la fuente natural del ácido nucleico. Por ejemplo, con respecto al ADN genómico, el término aislado incluye moléculas de ácido nucleico que se separan del cromosoma con el que el ADN genómico se asocia naturalmente. Preferentemente, una molécula de ácido nucleico aislado está libre de secuencias que flanquean naturalmente al ácido nucleico (es decir, secuencias situadas en los extremos 5' y 3' de la molécula de ácido nucleico) en el ADN genómico del ί organismo a partir del que se deriva el ácido nucleico. Por ejemplo, en diversas modalidades la molécula de ácido nucleico aislada de PD-L3 o VISTA puede contener menos de aproximadamente 5 kb, 4kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb o 0.1 kb de secuencias de nucleótidos que flanquean naturalmente la molécula de ácido nucleico en el ADN genómico de la célula a partir de la que se deriva la molécula de ácido nucleico. Además, una molécula de ácido nucleico aislada, tal como una molécula de ADNc, puede estar sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce por técnicas recombinantes, sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Una molécula de ácido nucleico de la presente invención, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que tiene la secuencia de nucleótidos de las sec. con núms. de ident.:1, 3, o una parte de éstas se puede aislar usando técnicas estándares de biología molecular y la información de la secuencia proporcionada en la presente descripción. Usando toda o parte de la secuencia de ácido nucleico de las sec. con núms. de ident.:1 ó 3 como una sonda de hibridación, las moléculas de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA se pueden aislar usando técnicas estándares de hibridación y clonación (por ejemplo, como se describe en

Sambrook, J. y otros Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Segunda, edición.

Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y., 1989).

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Además, una molécula de ácido nucleico incluye toda o una parte de las sec. con núms. de ident.: 1, 3, o un ortólogo o variante se puede aislar por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) usando cebadores de oligonucleótidos sintéticos diseñados basado en la secuencia de las sec. con núms. de ident: 1, 2, 3, 4 ó 5.

Una molécula de ácido nucleico de la invención se puede amplificar usando ADNc, ARÑm o, como alternativa, ADN genómico como un molde y cebadores apropiados de oligonucleótido de acuerdo con técnicas estándares de amplificación por POR. La molécula de ácido nucleico así amplificada se puede clonar en un vector apropiado y caracterizar por análisis de secuencia de ADN. Además, los oligonucleótidos correspondientes a secuencias de nucleótidos de PD-L3 se pueden preparar por técnicas estándares sintéticas, por ejemplo usando un sintetizador automatizado de ADN.

En una modalidad preferida, una molécula de ácido nucleico aislada que codifica PD-L3 o VISTA de la invención comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en las sec. con núms. de ident: 1, ó 3, o un fragmento de ésta. En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico de la invención comprende una molécula de ácido nucleico que es un complemento de la secuencia de nucleótidos que se muestra en las sec. con núms. de ident.:1, ó 3, o una parte de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos. Una molécula de ácido nucleico que es complementaria a la secuencia de nucleótidos que se muestra en las sec. con núms. de ident.:1, ó 3, es una que es suficientemente complementaria a la secuencia de nucleótidos que se muestra en las sec. con núms. de ident.:1, ó 3 tal que puede hibridar con la secuencia de nucleótidos que se muestra en la sec. con núms. de ident.:1, ó 3, respectivamente, formando de ese modo un dúplex estable.

En aún otra modalidad preferida, una molécula aislada de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idénticos o más a la secuencia de nucleótidos completa que se muestra en las sec. con núms. de ident.:1 ó 3, o una parte de cualquiera de estas secuencias de nucleótidos.

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σί

Además, la molécula de ácido nucleico de la invención puede comprender solamente una parte de la secuencia de ácido nucleico de las sec. con núms. de ¡dent.:1, ó 3, por ejemplo, un fragmento que se puede usar como una sonda o cebador o un fragmento que codifica una parte de un polipéptido de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, una parte biológicamente activa de un polipéptido PD-L3 o VISTA. Las secuencias de nucleótidos determinadas a partir de la clonación del gen de PD-L2 humano se permiten para la generación de sondas y cebadores diseñados para uso en la identificación y/o clonación de otros miembros de la familia PD-L2, así como homólogos de PD-L3 o VISTA de otras especies. La sonda/cebador comprende típicamente el oligonucleótido sustancialmente h purificado. El oligonucleótido comprende típicamente una región de secuencia de nucleótidos que híbrida bajo condiciones rigurosas con al menos aproximadamente 12 ó 15, preferentemente aproximadamente 20 ó 25, con mayor preferencia aproximadamente 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, ó 75 nucleótidos consecutivos de una secuencia sentido de las sec. con núms. de ident.:1, ó 3; de una secuencia antisentido de las sec. con núms. de ident.:1, 3, o una variante alélica de origen natural o mutante de las sec. con núms. de ident.:1, ó 3.

En una modalidad, una molécula de ácido nucleico de la presente invención I comprende una secuencia de nucleótidos que es mayor que aproximadamente 50100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750-800, 800-850, 850-900, 900950 o más nucleótidos de longitud e híbrida bajo condiciones rigurosas de hibridación con una molécula de ácido nucleico de las sec. con núms. de ident.:1, ó 3, o el complemento de éstas. En una modalidad adicional, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que es mayor que aproximadamente 880-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1150 o más nucleótidos de longitud e híbrida en condiciones rigurosas de hibridación con una molécula de nucleico ácido de las sec. con núms. de ident:1 ó 3, o el complemento de éstas. En aún otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de nucleótido que es mayor de 50-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300 o más nucleótidos de

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U1 longitud e híbrida en condiciones rigurosas de hibridación con una molécula de ácido nucleico que comprende la región codificante de sec. con núms. de ident. :1 ó 3, o un complemento de éstas. En aún otra modalidad, una molécula de ácido nucleico de la presente invención comprende una secuencia de nucleótidos que es mayor de aproximadamente 50-100,100-150,150-200,200-250, 250-300, 300-350,

350-400, 400-450, 450-500, 500-550, 550-600, 600-650, 650-700, 700-750, 750800, 850-900, 900-950, o más nucleótidos de longitud, incluye al menos aproximadamente 15 nucleótidos (es decir, 15 contiguos) de la secuencia que comprende la región codificante de las sec. con núms. de ident.:1 ó 3, o un complemento de éstas, e híbrida bajo condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos que se muestra en las sec. con núms. de ident.: 1, ó 3 o un complemento de éstas.

Las sondas en función de las secuencias de nucleótidos de PD-L3 o VISTA se pueden usar para tamizar transcriptos o secuencias genómicas que codifican los polipéptidos iguales u homólogos. En modalidades preferidas, la sonda comprende además un grupo marcador unido a ella, por ejemplo, el grupo marcador puede ser un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un cofactor enzimático. Dichas sondas se pueden usar como parte de un estuche de prueba de diagnóstico para identificar células o tejidos que expresan de forma incorrecta un polipéptido PD-L3 o VISTA, tal como por la medición de un nivel de un ácido nucleico que codifica PD-L3 o VISTA en una muestra de células de un individuo por ejemplo, detectando los niveles de ARNm de PD-L3 o VISTA o determinando si mutó o suprimió un gen genómico de PD-L3 o VISTA.

Un fragmento de ácido nucleico que codifica una parte biológicamente activa de un polipéptido PD-L3 o VISTA se puede preparar aislando una parte de la secuencia de nucleótidos de las sec. con núms. de ident.:1, ó 3, que codifica un polipéptido que tiene una actividad biológica de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, la capacidad de unirse a su pareja (s) de unión natural y/o modular la actividad de las células inmunes), expresando la parte codificada del polipéptido PD-L3 o VISTA (por ejemplo, por expresión recombinante in vitro) y evaluando la actividad de la parte codificada del polipéptido PD-L3 o VISTA.

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La invención incluye además las moléculas de ácido nucleico que difieren de la secuencia de nucleótidos que se muestra en las sec. con núms. de ident.: 1, ó 3 debido a la degeneración del código genético y así codifican los mismos polipéptidos de PD-L3 o VISTA como aquellos codificados por la secuencia de nucleótidos que se muestra en las sec. con núms. de ident.:1, ó 3. En otra modalidad, una molécula aislada ds ácido nucleico de la invención tiene una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en las sec. con núms. de ident: 2, 4 ó 5.

Además de las secuencias de nucleótidos de PD-L3 o VISTA que se muestran en la sec. con núms. de ident: 1, y 3, se apreciará por aquellos con experiencia en la técnica que los polimorfismos de la secuencia de ADN que conducen a cambios en las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de PDL3 o VISTA pueden existir dentro de una población (por ejemplo, la población humana). Dicho polimorfismo genético en los genes de PD-L3 o VISTA pueden existir entre individuos dentro de una población debido a la variación alélica natural. Como se usa en la presente descripción, los términos gen y gen recombinante se refieren a moléculas de ácido nucleico que incluyen un marco de lectura abierto que codifica un polipéptido PD-L3 o VISTA, preferentemente un polipéptido PD-L3 o VISTA de mamífero, y puede incluir además secuencias reguladoras codificantes e intrones.

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Las variantes alélicas de PD-L3 o VISTA humano o de ratón incluyen tanto polipéptidos funcionales como no funcionales de PD-L3 o VISTA. Las variantes alélicas funcionales son variantes de la secuencia de aminoácidos de origen natural del polipéptido PD-L3 o VISTA humano o de ratón que conservan la capacidad de unirse a la pareja (s) de unión natural de PD-L3 o VISTA y/o modular la proliferación de células T CD4+ y CD8+ y la producción de citoquinas y la activación de linfocitos. Las variantes alélicas funcionales contendrán típicamente sólo la sustitución conservadora de uno o más aminoácidos de las sec. con núms.

de ident.:2, 4 ó 5, o sustitución, supresión o inserción de los residuos no críticos en regiones no críticas del polipéptido.

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

Las variantes alélicas no funcionales son variantes de secuencia de aminoácidos de origen natural del polipéptido PD-L3 o VISTA humano o de ratón que no tienen la capacidad para unir ya sea las parejas de unión natural de PD-L3 o VISTA, y/o modular cualquiera de las actividades de PD-L3 o VISTA descritas en la presente invención. Las variantes alélicas no funcionales típicamente contendrán una sustitución, supresión o inserción no conservativa o truncamiento prematuro de la secuencia de aminoácidos de las sec. con núms. de ident.:2, 4 ó 5, o una sustitución, inserción o supresión en los residuos críticos o regiones críticas del polipéptido por ejemplo, en un dominio IgV.

La presente invención proporciona, además, ortólogos no humano, ni de ratón del polipéptido PD-L3 o VISTA humano o de ratón. Los ortólogos del polipéptido PD-L3 o VISTA humano o de ratón son polipéptidos que se aíslan a partir de organismos que no son humano, ni ratón y poseen la misma actividad de unión y/o actividad que modula la activación de linfocitos, y la capacidad para modular la proliferación de células T CD4+ y CD8+ y la producción de citoquinas como los polipéptidos de PD-L3 o VISTA humanos y murino descritos en la presente invención. Los ortólogos del polipéptido PD-L3 humano o de ratón se pueden fácilmente identificar como que comprenden una secuencia de aminoácidos que es sustancialmente idéntica a las sec. con núms. de ident.:2, 4 ó 5.

Además, las moléculas de ácido nucleico que codifican otros miembros de la familia de PD-L3 o VISTA y, así, que tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias de PD-L3 o VISTA de las sec. con núms. de ident.:1, ó 3 pretenden estar dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, otro ADNc de PDL3 o VISTA se puede identificar en función de la secuencia de nucleótidos de PDL3 o VISTA de ratón o humano. Además, las moléculas de ácido nucleico que o

en codifican los polipéptidos de PD-L3 o VISTA de diferentes especies, y que, así tienen una secuencia de nucleótidos que difiere de las secuencias de PD-L3 o VISTA de las sec. con núms. de ident.:1, ó 3 pretenden estar dentro del alcance de la invención. Por ejemplo, un ADNc de PD-L3 o VISTA de mono se puede identificar en función de la secuencia de nucleótidos de PD-L3 o VISTA de ratón o humano.

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DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

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Las moléculas de ácido nucleico correspondientes a las variantes alélicas naturales y homologas de los ADNc de PD-L3 o VISTA de la invención se pueden aislar en función de su homología con los ácidos nucleicos de PD-L2 descritos en la presente invención usando los ADNc descritos en la presente invención, o una parte de éstos, como una sonda de hibridación de acuerdo con técnicas estándares de hibridación bajo condiciones rigurosas de hibridación. Las moléculas de ácidos nucleicos correspondientes a las variantes alélicas naturales y homologas de los ADNc de PD-L3 o VISTA de la invención se pueden aislar además mapeando al mismo cromosoma o locus como al gen de PD-L3 o VISTA.

Como consecuencia en otra modalidad una molécula de ácido nucleico aislada de la invención es al menos 15, 20, 25, 30 o más nucleótidos de longitud e híbrida bajo condiciones rigurosas a la molécula de ácido nucleico que comprende la región codificante de la secuencia de nucleótidos de las sec. con núms. de ¡dent.:1 ó 3. En otra modalidad, el ácido nucleico es al menos 700, 750, 800, 850, 880-900, 900-950, 950-1000, 1000-1050,1050-1100, 1100-1150 o más nucleótidos de longitud.

Como se usa en la presente descripción, el término híbrida bajo condiciones rigurosas” pretende describir las condiciones para la hibridación y lavado bajo las cuales las secuencias de nucleótidos que son significativamente idénticas u homologas entre sí permanezcan hibridadas mutuamente. Preferentemente las condiciones son tales que las secuencias de al menos aproximadamente 70%, con mayor preferencia al menos aproximadamente 80% incluso con mayor preferencia al menos aproximadamente 85% ó 90% idénticas entre sí permanezcan hibridadas mutuamente. Dichas condiciones rigurosas se conocen por aquellos con experiencia en la técnica y se pueden encontrar en Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel y otros, Editores., John Wiley & Sons, Inc (1995), secciones 2, 4 y +

6. Las condiciones rigurosas adicionales se pueden encontrar en Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook y otros, Coid Spring Harbor Press, Coid Spring Harbor, N.Y. (1989), capítulos 7, 9 y 11. Un ejemplo no limitante preferido, de condiciones rigurosas de hibridación incluye la hibridación 4 veces o 6 veces en cloruro de sodio/citrato de sodio (SSC), aproximadamente a 65-70 grados C (o

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hibridación en 4 veces en SSC más 50% de formamida aproximadamente a 42-50 grados C) seguido por uno o más lavados en 1 X SSC, aproximadamente a 65-70 grados C. Un ejemplo no limitante preferido adicional, de condiciones rigurosas de hibridación incluye la hibridación 6 veces en SSC a 45 grados C, seguido por uno o más lavados 0.2 veces en SSC, 0.1% de SDS a 65 grados C. Un ejemplo no limitante preferido, de condiciones de hibridación altamente rigurosas incluye la hibridación 1 vez en SSC, aproximadamente a 65-70 grados C (o hibridación 1 vez en SSC más 50% de formamida aproximadamente a 42-50 grados C) seguido por uno o más lavados 0.3 veces en SSC, aproximadamente a 65-70 grados C. Un ejemplo no limitante preferido, de condiciones de hibridación de rigurosidad * reducida incluye la hibridación 4 veces o 6 veces en SSC, aproximadamente a 5060 grados C (o como alternativa la hibridación 6 veces en SSC más 50% de formamida aproximadamente a 40-45 grados C) seguido por uno o más lavados 2 veces en SSC, en aproximadamente 50-60 grados C. Los intervalos intermedios a los valores citados anteriormente, por ejemplo, a 65-70 grados Coa 42-50 grados C se pretenden incluir también mediante la presente invención. SSPE (1 vez en SSPE es 0.15 M de NaCI, 10 mM de NaH₂PO₄, y 1.25 mM de EDTA, pH 7.4) se puede sustituir por SSC (1 vez en SSC es 0.15 M de NaCI y 15 mM de citrato de sodio) en tos tampones de hibridación y lavado; los lavados se realizan durante 15 minutos cada uno después que se completa la hibridación. La temperatura de hibridación para los híbridos anticipados que sean menos de 50 pares de bases de longitud debe ser 5-10 grados C menos que la temperatura de fusión (Tm) del híbrido, donde Tm se determina de acuerdo con las siguientes ecuaciones. Para los híbridos menos de 18 pares de base de longitud, Tm (grados C) -2 (# de bases A+T) +4 (# de bases G+C). Para los híbridos entre 18 y 49 pares de bases de longitud, Tm (grados C) = 81.5 +16.6 (log 10[Na+])+ 0.41 (% G+C) - (600/N), donde N es el número de bases en el híbrido, y [Na +1] es la concentración de iones de sodio en el tampón de hibridación ([Na +] para 1 vez en SSC=0.165M). Se reconocerá también por el profesional con experiencia que los reactivos adicionales se pueden añadir a los tampones de hibridación y/o lavado para disminuir la hibridación no específica de moléculas de ácido nucleico a las membranas, por ejemplo, membranas de nitrocelulosa o nylon, incluyendo pero no se limitan a 71 o

en

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL agentes de bloqueo (por ejemplo, BSA o ADN vehículo de esperma de arenque o salmón), detergentes (por ejemplo, SDS), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), Ficoll, PVP y similares. Cuando se usan membranas de nylon, en particular, un ejemplo no limitante preferido adicional, de las condiciones rigurosas de hibridación es la hibridación en 0.25-0.5 M de NaH₂PO₄, 7% de SDS aproximadamente a 65 grados C, seguido por uno o más lavados en 0.02 M de NaH₂PO4,1% de SDS a 65 grados C, ver, por ejemplo, Church y Gilbert (1984) Proc. Nati. Acad. Sci. USA. 81:1991-1995 (o como alternativa 0.2 veces en SSC, 1% de SDS).

Preferentemente, una molécula aislada de ácido nucleico de la invención se híbrida bajo condiciones rigurosas con la secuencia de las sec. con núms. de ident.:1, ó 3 o se corresponde a una molécula de ácido nucleico de origen natural. Como se usa en la presente descripción, una molécula de ácido nucleico de origen natural se refiere a una molécula de ARN o ADN que tiene una secuencia de nucleótidos que se origina en la naturaleza (es decir, codifica un polipéptido natural).

Además de las variantes alélicas de origen natural de las secuencias de PDL3 o VISTA que pueden existir en la población, el técnico con experiencia apreciará además que se pueden introducir cambios por mutación en las secuencias de nucleótidos de las sec. con núms. de ident.:1 ó 3, conduciendo de ese modo a cambios en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos codificados de PD-L3 o VISTA, sin alterar la capacidad funcional de los polipéptidos de PD-L3 o VISTA. Por ejemplo, las sustituciones de nucleótidos que conducen a sustituciones de aminoácidos en residuos de aminoácidos no esenciales se pueden generar en la secuencia de las sec. con núms. de ident.:1, ó 3. Un residuo de aminoácido no esencial es un residuo que se puede alterar a partir del tipo salvaje de la secuencia de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, la secuencia de las sec. con núms. de ident.:2, 4 ó 5) sin alterar la actividad biológica, mientras que un residuo de aminoácido esencial se requiere para la actividad biológica. Por ejemplo, los residuos de aminoácidos que se conservan entre los polipéptidos de PD-L3 o VISTA de la presente invención, por ejemplo, aquellos presentes en un dominio extracelular, se predicen que no son particularmente susceptibles a la alteración. Además, los o

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U1 residuos de aminoácidos adicionales que se conservan entre los polipéptidos de PD-L3 o VISTA de la presente invención y otros miembros de la familia PD-L3 o VISTA es probable que no sean susceptibles a la alteración.

Como consecuencia, otro aspecto de la invención se corresponde con moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de PD-L3 o VISTA que contienen cambios en los residuos de aminoácidos que no son esenciales para la actividad. Dichos polipéptidos de PD-L3 o VISTA que difieren en la secuencia de aminoácido de sec. con núms de ident.: 2, 4, ó 5 aún conservan la actividad biológica. En una modalidad, la molécula aislada de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido, en donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente 71%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% idéntica o más a las sec. con núms. de ident.: 2, 4 ó 5.

Una molécula aislada de ácido nucleico que codifica un polipéptido PD-L3 o VISTA idéntico al polipéptido de las sec. con núms. de ident.:2, 4 ó 5 se puede crear introduciendo uno o más sustituciones, adiciones o supresiones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de sec. con núms de ident.: 1 ó 3 tal que una o más sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos se introducen en el polipéptido codificado. Las mutaciones se pueden introducir en las sec. con núms. de ident. :1 ó 3 por técnicas estándares, tales como mutagénesis sitio dirigida y mutagénesis mediada por PCR. Preferentemente, las sustituciones conservativas de aminoácidos se preparan en uno o más residuos de aminoácidos no esenciales predichos. Una sustitución conservativa de aminoácidos es una en la que se sustituye el residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales similares se definieron en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL cadenas laterales beta ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un polipéptido PD-L3 o VISTA se sustituye preferentemente con otro residuo de aminoácido de la misma familia de cadena lateral. Como alternativa, en otra modalidad, se pueden introducir mutaciones al azar a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de PD-L3 o VISTA tal como por mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes se pueden tamizar por la actividad biológica de PD-L3 o VISTA para identificar los mutantes que conservan la actividad. A continuación de la mutagénesis de las sec. con núms. de ident.:1, ó 3, el polipéptido codificado se puede expresar recombinantemente y se puede determinar la actividad del polipéptido.

En una modalidad preferida, un polipéptido muíante de PD-L3 o VISTA se puede ensayar para la capacidad de unirse a y/o modular la actividad de una pareja de unión natural de PD-L3 o VISTA, para modular la señalización intra-o intercelular, modular la activación de los linfocitos T, y/o modular la respuesta inmune de un organismo.

Aún otro aspecto de la invención se corresponde con moléculas aisladas de ácidos nucleicos que codifican unas proteínas de fusión PD-L3 o VISTAPD-L3 o VISTA o VISTA. Dichas moléculas de ácido nucleico, que comprende al menos una primera secuencia de nucleótidos que codifica una proteína, polipéptido o péptido PD-L3 o VISTAPD-L3 o VISTA o VISTA, operativamente unido a una segunda secuencia de nucleótidos que codifica una proteína polipéptido o péptido no PD-L3 o VISTA, se pueden preparar por técnicas estándares de ADN recombinante.

Además de las moléculas de ácido nucleico que codifican los polipéptidos de DP-L3 o VISTA descritos anteriormente, otro aspecto de la invención corresponde con moléculas aisladas de ácido nucleico, que son antisentido a él. Un ácido nucleico antisentido comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a un ácido nucleico sentido que codifica un polipéptido, por ejemplo, complementario a la cadena codificante de una molécula ADNc de doble 74 o

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U1 cadena o complementaria a una secuencia de ARNm. Como consecuencia, un ácido nucleico antisentido puede enlazar hidrógeno a un ácido nucleico sentido. El ácido nucleico antisentido puede ser complementario a la cadena codificante completa de PD-L3 o VISTA, o sólo a una parte de ésta. En una modalidad, una molécula de ácido nucleico antisentido es antisentido a una región codificante de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica un PDL3 o VISTA. El término región codificante se refiere a la región de la secuencia de nucleótidos que comprende codones que se traducen en residuos de aminoácidos.

En otra modalidad, la molécula de ácido nucleico es antisentido a una región no codificante de la cadena codificante de una secuencia de nucleótidos que codifica PD-L. El término región no codificante se refiere a las secuencias 5' y 3' que

I flanquean la región codificante que no se traducen en aminoácidos (también referido como regiones 5' y 3' no traducidas). Dadas las secuencias de cadena codificante que codifican PD-L3 o VISTAPD-L3 o VISTA o VISTA de humanos o de ratón descrita en la presente descripción, los ácidos nucleicos antisentido de la invención se pueden diseñar de acuerdo con las reglas de apareamiento de bases de Watson y Crick. La molécula de ácido nucleico antisentido puede ser complementaria a la región codificante completa del ARNm de PD-L3 o VISTA, pero con mayor preferencia es un oligonucleótido que es antisentido a solamente una parte de la región codificante o no codificante del ARNm de PD-L3 o VISTA. Por ejemplo, el oligonucleótido antisentido puede ser complementario a la región que rodea el sitio de inicio de la traducción del ARNm de PD-L3 o VISTA o VISTA. Un oligonucleótido antisentido puede ser por ejemplo, aproximadamente 5, 10, 15, 20, 25,30, 35, 40,45 ó 50 nucleótidos de longitud. Una molécula de la invención de ácido nucleico antisentido se puede construir usando síntesis química y reacciones de ligazón enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo una molécula de ácido nucleico antisentido (por ejemplo, un oligonucleótido antisentido) se puede sintetizar químicamente usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado entre Eos ácidos nucleicos antisentido y sentido, por ejemplo, se pueden usar derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina. Los

IMPI o

en ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar el ácido nucleico antisentido incluyen 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5 clorouracilo, 5yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroxilmetil) uracilo, 5carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-Dgaiactosilqueosina, inosina,

N6-isopenteniladenina, 1 metilguanina, 1metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5met i Icito si na,

N6-adenina,

7-metilguanina,

5-metilaminometiluracilo, metoxiaminometil-2-tiuracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxlcarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracilo-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitocina.

5-metil-2-tiouracilo, 215 tiouracilo, 4 tiouracilo, 5-metiluracilo, ácido uracil-5-oxiacético metiléster, ácido uracllo-5-oxiacético (v), 5-metil-2-tio uracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3) w, y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, el ácido nucleico antisentido se puede producir biológicamente usando un vector de expresión en el que un ácido nucleico se subclonó en una orientación antisentido (es decir, el ARN transcrito a partir del ácido nucleico insertado tendrá una orientación antisentido a un ácido nucleico objetivo de interés descrito adicionalmente en la siguiente subsección).

Las moléculas de ácido nucleico antisentido de la invención se administran típicamente a un individuo o generan in situ tal que se hibridan con o unen a ARNm celular y/o ADN genómico que codifica un polipéptido PD-L3 o VISTAPD-L3 o VISTA o VISTA para inhibir de ese modo la expresión del polipéptido por ejemplo, inhibiendo la transcripción y/o traducción. La hibridación puede ser por complementariedad convencional de nucleótidos para formar un dúplex estable, o, por ejemplo, en el caso de una molécula de ácido nucleico antisentido que se une a dúplex de ADN, a través de interacciones específicas en el surco mayor de la doble hélice. Un ejemplo de una ruta de administración de moléculas de la invención de ácido nucleico antisentido incluye la inyección directa en un sitio del tejido. Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico antisentido se pueden modificar en las células objetivos seleccionados y administrar después de forma sistémica. Por ejemplo, para la administración sistémica, las moléculas antisentido se pueden modificar tal que se unen específicamente a receptores o antígenos expresados

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en sobre una superficie celular seleccionada, por ejemplo enlazando las moléculas de ácido nucleico antisentido a péptidos o anticuerpos que se unen a receptores de la superficie celular o antígenos. Las moléculas de ácido nucleico antisentido se pueden entregar también a las células usando vectores descritos en la presente invención. Para alcanzar concentraciones intracelulares suficientes de moléculas antisentido, se prefieren construcciones de vectores en los que la molécula de ácido nucleico antisentido se coloca bajo el control de un promotor fuerte pol II o pol III.

En aún otra modalidad, la molécula de ácido nucleico antisentido de la invención es una molécula de ácido nucleico alfa anomérico. Una molécula de ácido nucleico alfa anomérico forma híbridos de doble cadena específicos con el ARN complementario en que, al contrario de las usuales unidades beta, las cadenas corren paralelas entre sí (Gaultier y otros (1987) Nucieic Acids Res. 15:6625-6641). La molécula de ácido nucleico antisentido puede comprender también un 2'-o-metilribonucleótido (Inoue y otros (1987) Nucieic Acids Res.15:6 13 1-6148) o un análogo quimérico de ARN-ADN (Inoue y otros (1987) FEBS Lett.2 15:327-330).

En aún otra modalidad, un ácido nucleico antisentido de la invención es una ribozima. Las ribozimas son moléculas catalíticas de ARN con actividad ribonucleasa que son capaces de escindir un ácido nucleico de cadena simple, tal como un ARNm, a la que tienen una región complementaria. Así, las ribozimas (por ejemplo, ribozimas cabeza de martillo (descritas en Haseloff y Geriach (1988) Nature 334:585-591)) se pueden usar para escindir catalíticamente transcriptos de ARNm de PD-L3 o VISTA para inhibir así la traducción del ARNm de PD-L3 o VISTA o VISTA. Una ribozima que tiene especificidad para un ácido nucleico que codifica PDL3 o VISTA se puede diseñar basado en la secuencia de nucleótidos de un ADNc de PD-L3 o VISTA descrito en la presente descripción (es decir, las sec. con núms. de ident: 1 ó 3). Por ejemplo, un derivado de un ARN de Tetrahymena L-19 IVS se puede construir en el que la secuencia de nucleótidos del sitio activo es complementaria a la secuencia de nucleótidos que se escinde en un

ARNm que codifica PD-L3 o VISTAPD-L3 o VISTA o VISTA. Ver, por ejemplo

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o

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Cech y otras, patente de Estados Unidos núm. 4,987,071 y Cech y otros, patente de Estados Unidos núm. 5,116,742. Como alternativa, el ARNm de PD-L3 o VISTA se puede usar para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad específica de ribonucleasa a partir de un grupo de moléculas de ARN. Ver, por ejemplo, Bartel, D. y Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.

Alternativamente, la expresión del gen de PD-L3 o VISTA se puede inhibir dirigiendo las secuencias de nucleótidos complementarias a la región reguladora de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, el promotor y/o potenciadores de PD-L3 o VISTA; para formar estructuras triple helicoidal que impiden la transcripción del gen de PDL3 en las células objetivo. Ver, generalmente, Heleno, C (1991) Anticancer Drug Des. 6 (6):569-84: Helene, C. y otros (1992) Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36, y Maher, L. J. (1992) Bioessays 14 (12):807-15.

En aún otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA de la presente invención se pueden modificar en la porción de la base, porción de azúcar, o esqueleto de fosfato, para mejorar, por ejemplo, la estabilidad, hibridación, o solubilidad de la molécula. Por ejemplo, el esqueleto de fosfato desoxirribosa de las moléculas de ácido nucleico se pueden modificar para generar ácidos nucleicos peptídicos (ver Hyrup, B. y Nielsen, P. E. (1996) Bioorg. Med. Chem. 4 (1):5-23). Como se usa en la presente descripción, los términos ácidos nucleicos peptídicos o los PNA se refieren a ácidos nucleicos miméticos, por ejemplo, ADN miméticos, en que el esqueleto de fosfato desoxirribosa se sustituye por un esqueleto de pseudopéptido y sólo se conservan las cuatro nucleobases naturales. El esqueleto neutro de los PNA demostró tener en cuenta la hibridación específica con ADN y ARN en condiciones de baja fuerza iónica. La síntesis de oligómeros de PNA se puede realizar usando protocolos estándares de síntesis de péptido en fase sólida como se describe en Hyrup y Nielsen (1996) arriba y PerryO'Keefe y otros. (1996) Proc Nati. Acad. Sci. USA. 93:14670-675.

Los PNA de moléculas de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA se pueden usar en aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico. Por ejemplo, los PNA se pueden usar como agentes antigenes o antisentido para la modulación específica de secuencia de ia expresión génica mediante, por ejemplo, induciendo la £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL transcripción o traducción de detención o inhibiendo la replicación. Los PNA de moléculas de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA se pueden usar también en el análisis de mutaciones de bases pareadas únicas en un gen (por ejemplo, por bloqueo de PCR dirigido por PNA); como “enzimas artificiales de restricción” cuando se usan en combinación con otras enzimas (por ejemplo, nucleasas S1 (Hyrup y Nielsen (1996) arriba)); o como sondas o cebadores para la secuenciación o hibridación de ADN (Hyrup y Nielsen (1996) arriba; Perry-O'Keefe y otros (1996) arriba).

En otra modalidad, los PNA de PD-L3 o VISTA se pueden modificar (por ejemplo, para mejorar su estabilidad o absorción celular), fijando grupos lipofílicos u otros auxiliadores a PNA, mediante la formación de quimeras PNA-ADN, o mediante el uso de liposomas u otras técnicas de suministro de fármacos conocidos en la técnica. Por ejemplo, se pueden generar quimeras PNA-ADN de moléculas de ácido nucleico de PDL-3 o VISTA que pueden combinar las propiedades ventajosas de PNA y ADN. Dichas quimeras permiten el reconocimiento de enzimas de ADN (por ejemplo, ARNasa H y ADN polimerasas), para interactuar con la parte de ADN mientras la parte de PNA podría proporcionar alta afinidad de unión y especificidad. Las quimeras PNA-ADN se pueden enlazar usando enlazadores de longitudes apropiadas seleccionados en términos de apilamiento de base, número de enlaces entre las nucleobases, y orientación (Hyrup y Nielsen (1996) arriba). La síntesis de quimeras PNA-ADN se puede realizar como se describe en Hyrup y Nielsen (1996) arriba y Finn P. J. y otros (1996) Nucleic Acids Res. 24(17): 3357-63. Por ejemplo, una cadena de ADN se puede sintetizar sobre un soporte sólido usando química estándar de acoplamiento de fosforamidita y análogos de nucleósidos modificados, por ejemplo, 5-(4metoxitritil) amino-S'-desoxi-timidina fosforamidita, se puede usar como un puente entre el PNA y el extremo 5' del ADN (Mag, M. y otros (1989) Nucleic Acids Res. 17:5973-88). Los monómeros de PNA se acoplan después de manera gradual para producir una molécula quimérica con un segmento 5’ de PNA y un segmento 3’ de ADN (Finn P. J. y otros (1996) arriba). Como alternativa, las moléculas o

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U1 quiméricas se pueden sintetizar con un segmento 5’ de ADN y un segmento 3’ de

PNA (Peterser, K. H. y otros (1975) Bioorganic Med. Chem. Lett 5:1119-11124).

En otras modalidades, el oligonucleótido puede incluir otros grupos anexos tales como péptidos (por ejemplo, para dirigir in vivo los receptores de células huésped), o agentes que facilitan el transporte a través de la membrana celular (ver, por ejemplo, Letsinger y otros (1989) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86:65536556; Lemaitre y otros (1987) Proc Nati. Acad. Sci. USA 84:648-652; Publicación PCT Núm. WO 88/09810) o la barrera hematoencefálica (ver, por ejemplo, Publicación PCT Núm. WO 89/10134). Además, los oligonucleótidos se pueden modificar con agentes de escisión desencadenantes de la hibridación (Ver, por ejemplo, Krol y otros (1988) Biotechniques 6:958-976) o agentes intercalantes (Ver, por ejemplo, Zon (1988) Pharrn. Res. 5:539-549). Para este fin, el oligonucleótido se puede conjugar a otra molécula (por ejemplo, un péptido, agente de reticulación desencadenante de hibridación, agente de transporte, o agente de escisión desencadenante de la hibridación).

Alternativamente, las características de expresión de un gen endógeno de PD-L3 o VISTA dentro de una línea celular o microorganismo se puede modificar insertando un elemento regulador heterólogo de ADN en el genoma de una línea celular estable o microorganismo clonado tal que el elemento regulador insertado se enlaza operativamente con el gen endógeno de PD-L3 o VISTA. Por ejemplo, un gen endógeno de PD-L3 VISTA que normalmente es transcripcionalmente silente, es decir, un gen de PD-L3 o VISTA que no se expresa normalmente, o se expresa sólo a niveles muy bajos en una línea celular o microorganismo, se puede activar insertando un elemento regulador que es capaz de promover la expresión de un producto génico normalmente expresado en esa línea celular o microorganismo. Como alternativa, un gen endógeno de PD-L3 o VISTA transcripcionalmente silente, se puede activar mediante la inserción de un elemento regulador promiscuo que trabaja través de tipos celulares.

Un elemento regulador heterólogo se puede insertar en una línea celular estable o microorganismo clonado, tal que se enlaza operativamente con un gen endógeno de PDL3 o VISTA, usando técnicas, tales como recombinación homologa 80

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DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL en dirigida, que se conocen bien por las personas con experiencia en la técnica, y se J describen, por ejemplo, en Chappel. patente de Estados Unidos núm. 5,272,071;

publicación PCT núm. WO 91/06667, publicada el 16 de mayo 1991.

II. Polipéptidos aislados de PD-L3 o VISTA y anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA

Un aspecto de la invención corresponde con polipéptidos aislados de PD-L3 o VISTA, y partes biológicamente activas de éstos, así como fragmentos de polipéptidos adecuados para su uso como inmunógenos para generar anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA. En una modalidad, polipéptidos nativos de PD-L3 o VISTA se pueden aislar de fuentes de células o tejidos mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas estándares de purificación de proteínas. En otra modalidad, los polipéptidos PD-L3 o VISTA se producen por técnicas de ADN recombinante. Alternativa a la expresión recombinante, una proteína o polipéptido de PD-L3 o VISTA se puede sintetizar químicamente usando técnicas estándares de síntesis de péptidos.

Un polipéptido aislado o purificado o parte biológicamente activa de éste está sustancialmente libre de material celular u otras proteínas contaminantes de la fuente de célula o tejido de la que se deriva el polipéptido de PD-L3 o VISTA, o sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente. La expresión sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de polipéptido de PD-L3 o VISTA en el que el polipéptido se separa de los componentes celulares de las células a partir de que estas se aíslan o producen recombinantemente. En una modalidad, la expresión sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de polipéptido de PD-L3 o VISTA que tienen menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de proteína no PD-L3 o VISTA (referido también en la presente descripción como una proteína contaminante), con mayor preferencia menos de aproximadamente 20% de proteína no PD-L3 o VISTA, aún con mayor preferencia menos de aproximadamente 10% de proteína no PD-L3 o VISTA, y con máxima preferencia menos de aproximadamente 5% de proteína no PD-L3 o VISTA. Cuando el polipéptido de PD-L3 o VISTA o parte biológicamente activa de éste se produce recombinantemente, es preferentemente también sustancialmente libre de medio 81

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o en de cultivo, es decir, el medio de cultivo representa menos de aproximadamente

20%, con mayor preferencia menos de aproximadamente 10 %, y con máxima I preferencia menos de aproximadamente 5% del volumen de la preparación de proteína.

La expresión sustancialmente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye las preparaciones de polipéptido de PD-L3 o VISTA en el que el polipéptido se separa a partir de precursores químicos u otros productos químicos que están involucrados en la síntesis del polipéptido. En una modalidad, la expresión sustanciaimente libre de precursores químicos u otros productos químicos incluye las preparaciones de polipéptido de PD-L3 o VISTA que tiene menos de aproximadamente 30% (en peso seco) de precursores químicos o productos químicos no PD-L3 o VISTA, con mayor preferencia menos de *

aproximadamente 20% de precursores químicos o productos químicos no PD-L3 o VISTA, aún con mayor preferencia menos de aproximadamente 10% de precursores químicos o productos químicos no PD-L3 o VISTA, y con máxima preferencia menos de aproximadamente 5% de precursores químicos o productos químicos no PD-L3 o VISTA.

Como se usa en la presente descripción, una parte biológicamente activa de un polipéptido de PD-L3 o VISTA incluye un fragmento de un polipéptido de PDL3 O VISTA que participa en una interacción entre una molécula de PD-L3 o VISTA y una molécula no PD-L3 o VISTA, por ejemplo, un ligando natural de PD-L3 o VISTA. Las partes biológicamente activas de un polipéptido de PD-L3 o VISTA incluyen péptidos que comprenden secuencias de aminoácidos suficientemente idénticas a, o derivadas a partir de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos que se muestra en la sec con núms. de ident.: 2, 4, ó 5 que incluyen menos aminoácidos que los polipéptidos completos de PD-L3 o VISTA, y presentan al menos una actividad de un polipéptido de PD-L3 o VISTA. Típicamente, las partes biológicamente activas comprenden un dominio o motivo con al menos una actividad del polipéptido de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, modular (suprimir) las respuestas proliferativas de células T CD4 a anti-CD3, supresión de la respuesta proliferativa de las células £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL análogas T CD4 en una manera específica al antígeno, efectos sobre la expresión de citoquinas específicas, y otras. Una parte biológicamente activa de un polipéptido de PD-L3 o VISTA puede ser un polipéptido que es, por ejemplo, 25, 50

75, 100, 125, 150, 175, 200, 225 o más aminoácidos de longitud. Las partes biológicamente activas de un polipéptido de PD-L3 o VISTA se pueden usar como objetivos para desarrollar agentes que modulan una actividad mediada por PD-L3 o VISTA, por ejemplo, la activación de células inmunes.

En una modalidad, una parte biológicamente activa de un polipéptido de PDL3 o VISTA comprende al menos una parte de un dominio extracelular. Debe P entenderse que una parte biológicamente activa preferida de un polipéptido de PDL3 o VISTA de la presente invención puede contener al menos una parte de un dominio extracelular (por ejemplo, que comprende un IgV), y uno o más de los siguientes dominios: un dominio de péptido señal, un dominio transmembrana, y un dominio citoplásmico. Además, otras partes biológicamente activas, en las que otras regiones del polipéptido se suprimen, se pueden preparar por técnicas recombinantes y evaluar para una o más de las actividades funcionales de un polipéptido nativo de PD-L3 o VISTA.

En una modalidad preferida, el polipéptido de PD-L3 o VISTA tiene una secuencia de aminoácidos que se muestra en las sec. con núms. de ident.: 2, 4 ó 5. En otras modalidades, el polipéptido de PD-L3 o VISTA es sustancialmente idéntico a la sec. con núms. de ident: 2, 4 ó 5, y conserva la actividad funcional del polipéptido de sec. con núms. de ident.: 2, 4 ó 5, como se describió anteriormente que difiere aún en la secuencia de aminoácido debido a la variación alélica natural o mutagénesis.

Las secuencias de polipéptidos y ácido nucleico de la presente invención se pueden además usar como una secuencia de consulta para realizar una búsqueda contra bases de datos públicas para, por ejemplo, identificar otros miembros de la familia o secuencias relacionadas. Dichas búsquedas se pueden realizar usando los programas NBLAST y XBLAST (versión 2.0) de Altschul y otros (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Las búsquedas BLAST de nucleótidos se pueden realizar con el Programa NBLAST, puntuación=100, longitud de palabra=12 para 83 o

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DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

U1 obtener secuencias de nucleótidos homologas a moléculas de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA de la invención. Las búsquedas BLAST de proteínas se pueden realizar con el programa XBLAST, puntuación=100, longitud de palabra=3 para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a moléculas de polipéptidos de PDL3 o VISTA de la invención. Para obtener alineaciones con interrupción para propósitos de comparación, Gapped BLAST se puede utilizar como se describe en Altschul y otros (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden usar los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Ver el sitio web de internet del Centro Nacional de Información Biotecnológica.

La invención proporciona también proteínas quiméricas o de fusión de PD-L3 o VISTA. Como se usa en la presente descripción, una proteína quimérica o proteína de fusión de PD-L3 o VISTA comprende un polipéptido de PD-L3 o VISTA enlazado operativamente a un polipéptido no PD-L3 o VISTA. Un polipéptido de PD-L3 o VISTA se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácido correspondiente a una molécula de PD-L3 o VISTA, mientras que un polipéptido no PDL-3 o VISTA se refiere a un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos correspondiente a un polipéptido que no es sustancialmente homologa a la del polipéptido de PDL-3 o VISTA, por ejemplo, un polipéptido que es diferente al polipéptido de PD-L3 o VISTA y que se deriva del mismo o de un organismo diferente. Dentro de una proteína de fusión de PD-L3 o VISTA, el polipéptido de PD-L3 o VISTA puede corresponder a toda o una parte de un polipéptido de PD-L3 o VISTA. En una modalidad preferida, una proteína de fusión de PD-L3 o VISTA comprende al menos una parte biológicamente activa de un polipéptido de PD-L3 o VISTA. En otra modalidad preferida, una proteína de fusión de PD-L3 o VISTA comprende al menos dos dominios de un polipéptido de PD-L3 o VISTA. Dentro de la proteína de fusión, el término enlazado operativamente” indica que el polipéptido de PD-L3 o VISTA y el polipéptido no PDL3 o VISTA se fusionan mutuamente en el marco. El polipéptido no PD-L3 o VISTA se puede fusionar al extremo N-terminal o C-terminal del polipéptido de PD-L3 o

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DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL en

VISTA y corresponde a una porción que altera la solubilidad, afinidad de unión, estabilidad o valencia del polipéptido de PD-L3 o VISTA.

Por ejemplo, en una modalidad, la proteína de fusión es una proteína de fusión GST-PD-L3 o VISTA en la que las secuencias de PD-L3 o VISTA se fusionan al C-terminal de las secuencias de GST. Dichas proteínas de fusión pueden facilitar la purificación de PD-L3 o VISTA recombinante. En otra modalidad la proteína de fusión es un polipéptido de PD-L3 o VISTA que contiene una secuencia señal heteróloga en su N-terminal. En determinadas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión y/o secreción de PD-L3 o VISTA se puede aumentar por el uso de una secuencia señal heteróloga. En una modalidad preferida, la proteína de fusión es una proteína de fusión de lg-PD-L3 o VISTA en la que las secuencias PD-L3 o VISTA se fusionan a una parte de una molécula de Ig. La parte Ig de la proteína de fusión puede incluir una región constante de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio C de gamma 1 o un dominio C de gamma 4 humana (por ejemplo, las regiones bisagra, CH2, y CH3 de IgC humana gamma 1 o IgC humana gamma 4 (ver, por ejemplo, Capón y otros, patente de Estados Unidos núm. 5,116,964; 5,580,756; 5,844,095, y similares, que se incorporan en la presente descripción como referencia). Una proteína de fusión resultante puede tener alterada la solubilidad, afinidad de unión, estabilidad y/o valencia de PD-L3 o VISTA (es decir, el número de sitios de unión por molécula) y puede aumentar la eficiencia de la purificación de proteínas.

En particular las proteínas de fusión de Ig con PD-L3 o VISTA preferidas incluyen una parte del dominio extracelular de PD-L3 o VISTA acoplado a una región constante de inmunoglobulina (por ejemplo, la región Fe). La región constante de inmunoglobulina puede contener modificaciones genéticas que reducen o eliminan la actividad efectora inherente en la estructura de inmunoglobulina. Por ejemplo, el ADN que codifica una parte extracelular de un polipéptido de PD-L3 o VISTA se puede unir ai ADN que codifica las regiones bisagra, CH2, y CH3 de IgG gamma 1 y/o IgG gamma 4 humana modificada por mutagénesis sitio dirigida, por ejemplo, como se enseña en WO 97/28267. Las proteínas de fusión de PD-L3 o VISTA de la invención se pueden incorporar en

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Μ composiciones farmacéuticas y administrar in vivo a un individuo. Las proteínas de fusión PD-L3 o VISTA se pueden usar para afectar la biodisponibilidad de una pareja de unión de PD-L3 o VISTA. El uso de proteínas de fusión de PD-L3 o VISTA puede ser útil terapéuticamente para el tratamiento de afecciones o trastornos que se beneficiarían a partir de la modulación de la respuesta inmune. Además, las proteínas de fusión de PD-L3 o VISTA de la invención se pueden usar como inmunógenos para producir anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA en un individuo, para purificar proteínas de unión de PD-L3 o VISTA, y en ensayos de tamizajes para identificar moléculas que inhiben la interacción de PD-L3 o VISTA con su pareja de unión natural.

Preferentemente, una proteína de fusión o quimérica de PD-L3 o VISTA de la invención se produce por técnicas estándares de ADN recombinante.

La presente invención se corresponde también con variantes de polipéptidos de PD-L3 o VISTA que funcionan ya sea como agonistas de PD-L3 o VISTA (miméticos) o como antagonistas de PD-L3 o VISTA. Las variantes de polipéptidos de PD-L3 o VISTA se pueden generar por mutagénesis, por ejemplo, mutación del punto discreto o truncamiento de un polipéptido de PD-L3 o VISTA. Un agonista de los polipéptidos de PD-L3 o VISTA puede conservar sustancialmente la misma, o un subconjunto, de las actividades biológicas de la forma de origen natural de un polipéptido de PD-L3 o VISTA. Un antagonista de un polipéptido de PD-L3 o VISTA puede inhibir una o más de las actividades de la forma de origen natural del polipéptido de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, modulando competitivamente una actividad mediada por PD-L3 o VISTA de un polipéptido de PD-L3 o VISTA. Así, los efectos biológicos específicos se pueden obtener por el tratamiento con una variante de la función limitada. En una modalidad, el tratamiento de un individuo con una variante que tiene un subconjunto de las actividades biológicas de la forma de origen natural dei polipéptido tiene menos efectos secundarios en un individuo con respecto al tratamiento con la forma de origen natural del polipéptido de PD-L3 o VISTA.

En una modalidad, las variantes de un polipéptido de PD-L3 o VISTA que funcionan ya sea como agonistas (miméticos) de PD-L3 o VISTA o como o

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL antagonistas de PD-L3 o VISTA se pueden identificar tamizando las bibliotecas combinatorias de mutantes, por ejemplo, mutantes de truncamiento de un polipéptido de PD-L3 o VISTA para la actividad agonista o antagonista del polipéptido de PD-L3 o VISTA. En una modalidad, una biblioteca muy diversa de variantes de PD-L3 o VISTA se genera por mutagénesis combinatoria al nivel del ácido nucleico y se codifica por una biblioteca génica muy diversa. Una biblioteca muy diversa de variantes de PD-L3 o VISTA se puede producir, por ejemplo, ligando enzimáticamente una mezcla de oligonucleótidos sintéticos en secuencias génicas tal que un conjunto degenerado de secuencias potenciales de PDL-3 o VISTA es expresable como polipéptidos individuales, o como alternativa, como un conjunto de proteínas de fusión mayores (por ejemplo, por expresión en fago) que contienen el conjunto de secuencias de PD-L3 o VISTA en ellas. Existe una variedad de métodos que se pueden usar para producir bibliotecas de variantes potenciales de PD-L3 o VISTA a partir de una secuencia degenerada de oligonucleótido. La síntesis química de una secuencia génica degenerada se puede realizar en un sintetizador automático de ADN, y ligar el gen sintético después en un vector de expresión apropiado. El uso de un conjunto degenerado de genes permite la provisión, en una mezcla, de todas las secuencias que codifican el conjunto deseado de secuencias potenciales de PD-L3 o VISTA. Los métodos para sintetizar oligonucleótidos degenerados se conocen en la técnica (Ver, por ejemplo, Narang, S. A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura y otros (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura y otros (1984) Science 198:1056; Ike y otros (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).

Además, las bibliotecas de fragmentos de una secuencia que codifica el polipéptido de PD-L3 o VISTA se pueden usar para generar una población muy diversa de fragmentos de PD-L3 o VISTA para el tamizaje y selección posterior de variantes de un polipéptido de PD-L3 o VISTA. En una modalidad, una biblioteca de fragmentos de secuencia codificante se puede generar tratando un fragmento de PCR de doble cadena de una secuencia codificante de PD-L3 o VISTA con una nucleasa bajo condiciones en donde se produce cortando sólo aproximadamente una vez por molécula, desnaturalizando el ADN de doble cadena, renaturalizando o

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en el ADN para formar ADN de doble cadena que puede incluir pares sentido/antlsentido de diferentes productos cortados, eliminando partes de simple cadena a partir de los dúplex reformados por tratamiento con nucleasa S1 ligando la biblioteca de fragmentos resultante en un vector de expresión. Mediante este método, se puede derivar una biblioteca de expresión que codifica fragmentos N-terminal, C-terminal e internos de diversos tamaños del polipéptido de PD-L3 o VISTA.

Se conocen varios procedimientos en la técnica para el tamizaje de productos génicos de bibliotecas combinatorias producidas por mutaciones puntuales o truncación, y para el tamizaje de ADNc\bibliotecas para productos génicos que tienen una propiedad seleccionada. Dichas técnicas son adaptables para el tamizaje rápido de las bibliotecas de genes generadas por la mutagénesis combinatoria de polipéptidos de PD-L3 o VISTA. Las técnicas más ampliamente usadas, que son susceptibles al análisis de alto rendimiento, para tamizar grandes bibliotecas de genes incluyen típicamente clonar la biblioteca de genes en vectores de expresión replicables, transformar las células apropiadas con la biblioteca de vectores resultante, y expresar los genes combinatorios en condiciones en las que la detección de una actividad deseada facilita el aislamiento del vector que codifica el gen cuyo producto se detectó. La mutagénesis recursiva de conjunto (REM), una técnica nueva que aumenta la frecuencia de mutantes funcionales en las bibliotecas, se puede usar en combinación con los ensayos de tamizaje para identificar las variantes de PD-L3 o VISTA (Arkin y Youvan (1992) Proc Nati. Acad. Sci. USA 89:7811-7815; Delagrave y otros (1993) Protein Eng. 6 (3):327-331).

Además de los polipéptidos de PD-L3 o VISTA que consisten solamente en aminoácidos de origen natural, se proporcionan también los péptidos miméticos de PD-L3 o VISTA. Los análogos de péptido se usan comúnmente en la industria farmacéutica como fármacos no peptídicos con propiedades análogas a aquellas del péptido molde. Estos tipos de compuestos no-péptidos se denominan péptidos miméticos o peptidomiméticos (Fauchere, J. (1986) Adv. Drug Res. 15:29; Veber y Freidinger (1985) TINS p.392; y Evans y otros (1987) J. Med. Chem. 30: 1229 que se incorporan en la presente descripción como referencia) y se desarrollan por £

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O σι lo general con la ayuda del modelación molecular computarizada. Los péptidos miméticos que son estructuralmente similares a péptidos terapéuticamente útiles se pueden usar para producir un efecto terapéutico o profiláctico equivalente. Generalmente, los péptidos miméticos son estructuralmente similares a un polipéptido paradigma (es decir, un polipéptido que tiene una actividad biológica o actividad farmacológica), tales como PD-L3 o VISTA humano o de ratón, pero tienen uno o más enlaces de péptidos opcionalmente sustituidos por un enlace seleccionado del grupo que consiste de: -CH2NH--,-CH2SCH.dbd.CH- (cis y trans),-COCH2-,-CH(OH)CH2-, y -CH2SO

-CH2—CH2—,— , por métodos conocidos en la técnica y descritos además en las siguientes referencias: Spatola, A. F. en Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides, and Proteins Weinstein, B., editor, Marcel Dekker, Nueva York, p. 267 (1983); Spatola. A. F„

Vega Data (Marzo de 1983), Vol. 1, Número 3, Peptide Backbone Modifications;

Morley, J. S. (1980) Trends. Pharm. Sci. págs. 463-468; Hudson, D. y otros (1979) Int. J. Pept. Prot. Res. 14: 177-185 (-CH2NH-, CH2CH2-); Spatola, A. F. y otros (1986) Life. Sci. 38:1243-1249 (--CH2-S); Hann, Μ. M. (1982) J. Chem. SoC Perkin.Trans. I 307-314 (-CH-CH-, cis y trans); Almquist, R. G. y otros (Í980)J. Med. Chem. 23: 1392-1398 (-COCH2-); Jennings-White, C y otros (1982) Tetrahedron Lett. 23:2533 (-COCH2-); Szelke. M. y otros, solicitud de patente Europea Núm. EP 45665 (1982) CA: 97:39405 (-CH(OH)CH2-); Holladay, M. W. y otros (1983) Tetrahedron. Lett. 24:4401-4404 (-C(OH)CH2-); y Hruby, V. J. (1982) Life Sci. 31:189-199 (--CH2-S--); cada una de las cuales se incorpora en la presente descripción como referencia. Un enlace no-peptídico particularmente preferido es - CH2NH -. Dichos péptidos miméticos pueden tener ventajas significativas sobre las modalidades de polipéptidos, incluyendo por ejemplo: producción más económica, mayor estabilidad química, mejores propiedades farmacológicas (vida media, absorción, potencia, eficacia, etc), especificidad alterada (por ejemplo, un amplio espectro de actividades biológicas), antigenicidad reducida, y otros. El mareaje de los péptidos miméticos por lo general involucra la unión covalente de uno o más marcadores, directamente o a través de un espaciador (por ejemplo, un grupo amida) para posición(es) que no interfiere(n) en el péptido mimético que se predicen por datos de actividad-estructura cuantitativa £

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σι de modelación molecular. Dichas posiciones en general son posiciones que no forman contactos directos con la(s) macromolécula(s) a la que se une el péptido mimético para producir el efecto terapéutico. La derivatización (por ejemplo, mareaje) del péptido mimético no debería interferir sustancialmente con la actividad biológica o farmacológica deseada del péptido mimético.

La sustitución sistemática de uno o más aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de PD-L3 o VISTA con un D-aminoácido del mismo tipo (por ejemplo, D-lisina en lugar de L-lisina) se puede usar para generar péptidos más estables.

Además, los péptidos constreñidos que comprenden una secuencia de aminoácidos de PD-L3 o VISTA o una variación de la secuencia sustancialmente idéntica se puede generar por métodos conocidos en la técnica (Rizo y Gierasch (1992) Annu. Rev. Biochem. 61:387, incorporado en la presente descripción como referencia); por ejemplo, añadiendo residuos de cisteína internos capaces de formar puentes disulfuro intramoleculares que ciclan el péptido. Las secuencias de aminoácidos de polipéptidos de PD-L3 o VISTA identificados en la presente descripción permitirán a las personas con experiencia en la técnica producir polipéptidos correspondiente a las secuencias de péptidos de PD-L3 o VISTA y variantes de secuencia de éstos. Dichos polipéptidos se pueden producir en células

V huésped procarióticas o eucarióticas mediante la expresión de polinucleótidos que codifican una secuencia de péptido de PD-L3 o VISTA, frecuentemente como parte de un polipéptido mayor. Como alternativa, dichos péptidos se pueden sintetizar mediante métodos químicos. Los métodos para la expresión de polipéptidos heterólogos en huéspedes recombinantes, síntesis química de polipéptidos, y traducción in vitro se conocen bien en la técnica. Determinadas modificaciones amino-terminal y/o carboxi-terminal y/o extensiones peptídicas a la secuencia del núcleo puede proporcionar propiedades ventajosas físicas, químicas, bioquímicas, y farmacológicas, tales como: estabilidad mejorada, mayor potencia y/o eficacia, resistencia a las proteasas séricas, propiedades farmacocinéticas deseables, y otras. Los péptidos se pueden usar terapéuticamente para tratar la enfermedad, por ejemplo, alterando la co-estimulación en un paciente.

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Un polipéptido aislado de PD-L3 o VISTA, o una parte o fragmento de éste, se puede usar como un inmunógeno para generar anticuerpos que unen PD-L3 o VISTA usando técnicas estándares para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. Un polipéptido completo de PD-L3 o VISTA se puede usar o, como alternativa, la invención proporciona fragmentos peptídicos antigénicos de PDL3 o VISTA para usar como inmunógenos. En una modalidad, un péptido antigénico de PDL3 o VISTA comprende ai menos 8 residuos de aminoácidos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en las sec. con núms. de ident.: 2,4 ó 5 e incluye un epítopo de PD-L3 o VISTA tal que un anticuerpo generado contra el péptido forma un complejo inmune específico con el polipéptido de PD-L3 o VISTA. Preferentemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 residuos de aminoácidos, con mayor preferencia al menos 15 residuos de aminoácidos, incluso con mayor preferencia al menos 20 residuos de aminoácidos, y con máxima preferencia al menos 30 residuos de aminoácidos. Los epítopos preferidos que se incluyen por el péptido antigénico son regiones de PD-L3 o VISTA que se encuentran en el dominio extracelular del polipéptido, por ejemplo, regiones hidrofílicas, así como regiones con alta antigenicidad.

Un inmunógeno de PD-L3 o VISTA típicamente se usa para preparar anticuerpos inmunizando con el inmunógeno un individuo adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón, u otro mamífero). Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, el polipéptido de PD-L3 o VISTA expresado de forma recombinante o un polipéptido de PD-L3 o VISTA sintetizado químicamente. La preparación puede incluir además un adyuvante, tal como Adyuvante completo o incompleto de Freund, o agente inmunoestimulador similar. La inmunización de un individuo adecuado con una preparación inmunogénica de PD-L3 o VISTA induce una respuesta de anticuerpo policlonal anti-PD-L3 o VISTA.

Como consecuencia, otro aspecto de la invención corresponde con los anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA. El término anticuerpo'* como se usa en la presente descripción, se refiere a las moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina, es decir, las moléculas que contienen un sitio de unión al antígeno que une específicamente o

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en (inmunorreacciona con) un antígeno, tal como un PD-L3 o VISTA. Los ejemplos de partes inmunológicamente activas de las moléculas de inmunoglobulina incluyen fragmentos F(ab) y F(ab’)2 que se pueden generar tratando el anticuerpo con una enzima tal como pepsina. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a moléculas de PD-L3 o VISTA. El término anticuerpo monoclonal o composición de anticuerpo monoclonal, como se usa en la presente descripción se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen sólo una especie de un sitio de unión del antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo en particular de PD-L3 o VISTA. Una composición de anticuerpo monoclonal típicamente muestra así una afinidad de unión única para un polipéptido en particular de PD-L3 o VISTA con el que inmunorreacciona.

Los anticuerpos policlonales anti-PD-L3 o VISTA se pueden preparar como se describió anteriormente inmunizando un individuo adecuado con un inmunógeno PD-L3 o VISTA, por ejemplo, una proteína de fusión PD-L3 o VISTA-lg. El título de anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA en el individuo inmunizado se puede monítorear a lo largo del tiempo mediante técnicas estándares, tales como con un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzima (ELISA) usando PD-L3 o VISTA inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra PD-L3 o VISTA se pueden aislar a partir del mamífero (por ejemplo, a partir de la sangre) y purificar además mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía de proteína A para obtener la fracción IgG. En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA son más altos, las células productoras de anticuerpos se pueden obtener del individuo y usarlas para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas estándares, tales como la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Mílstein (1975) Nature 256:495-497 (ver también Brown y otros (1981) J. Immunol. 127:539-46; Brown y otros (1980) J. Biol. Chem. 255:4980-83; Yeh y otros (1976) Proc Nati. Acad. Sci. USA 76:2927-31, y Yeh y otros (1982) Int. J. Cáncer 29:269-75), la más reciente técnica de hibridoma de células B humanas (Kozbor y otros (1983) Immunol. Today 4:72), la técnica EBV-hibridoma (Colé y otros (1985) Monoclonal Antibodies and £

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Cáncer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales es bien conocida (ver, generalmente Kenneth R. H. en Monoclonal Antibodies: A New Dimensión In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., Nueva York, N.Y. (1980); Lemer, E.A. (1981) Yale J. Biol. Med. 54:387-402; Gefter, M. L. y otros (1977) Somatic Cell Genet.3:231-36). En resumen, una línea celular inmortal (típicamente un mieloma) se fusiona con linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de PD-L3 o VISTA como se describió anteriormente, y los sobrenadantes de cultivo de las células del hibridoma resultante se tamizan para identificar un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal que se une a PD-L3 o VISTA. Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos usados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas se pueden aplicar para el propósito de generar un anticuerpo monoclonal anti-PD-L3 o VISTA (ver, por ejemplo, Galfre, G. y otros (1977) Nature 266:55052; Gefter y otros (1977) arriba; Lemer (1981) arriba; y Kenneth (1980) arriba). Además, la persona con experiencia en la técnica apreciará que existen muchas variaciones de dichos métodos que podrían también ser útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, los hibridomas murinos se pueden preparar fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea de célula de ratón inmortalizada. Las líneas celulares inmortales preferidas son líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles a medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT).Cualquiera de un número de líneas celulares de mieloma se pueden usar como pareja de fusión de acuerdo con técnicas estándares, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles de la ATOO. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensible a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón usando polietilenglicol (PEG). Las células de hibridoma resultantes de la fusión se seleccionan después usando medio HAT, que da muerte a las células de mieloma fusionadas improductivas y no fusionadas (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días porque no se transforman). Las células de hibridoma que producen un 93 £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL anticuerpo monoclonal de la invención se detectan tamizando los sobrenadantes de cultivo de hibridoma para los anticuerpos que se unen a PD-L3 o VISTA, por ejemplo, usando un ensayo ELISA estándar.

Los métodos específicos para producir anticuerpos que se unen a PD-L3 o VISTA se pueden llevar a cabo usando los métodos conocidos en la técnica y según se describe en los Ejemplos. Alternativamente a la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, se puede identificar y aislar un anticuerpo monoclonal anti-PD-L3 tamizando una biblioteca combinatoria de inmunoglobulinas recombinantes (por ejemplo, una biblioteca de anticuerpos de expresión en fagos) con PD-L3 o VISTA para de ese modo aislar los miembros de la biblioteca de inmunoglobulinas que se unen a PD-L3 o VISTA. Los estuches para generar y tamizar las librerías de expresión en fagos están disponibles en el comercio.

Como se señaló estos anticuerpos se tamizan para identificar aquellos que se unen a epítopos específicos de PD-L3 o VISTA, por ejemplo en el dominio IgV u otros dominios específicos y/o para seleccionar los anticuerpos que poseen alta afinidad y avidez a la proteína PD-L3 o VISTA. Además, estos anticuerpos se tamizan para identificar aquellos que modulan las funciones y efectos específicos de PD-L3 o VISTA en la inmunidad y células inmunes in vitro e in vivo. Por ejemplo, en caso, de un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA en particular se pueden llevar a cabo los ensayos para determinar el efecto modulador sobre las funciones inmunes negativamente reguladas por PD-L3 o VISTA incluyendo la producción de citoquinas por las células T CD4+ o CD8+, co-estimulación de CD28, proliferación de células T CD4+, y la proliferación de células T CD4+ vírgenes y de memoria, y otros. En una modalidad preferida, los ensayos se llevan a cabo para identificar el potencial terapéutico de los anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA in vitro mientras que la presencia de PD-L3 o VISTA-lg mejora la supresión por PD-L3 o VISTA-lg, estos anticuerpos PD-L3 o VISTA actúan in vivo de manera opuesta, es decir son inmunosupresores. La invención incluye los anticuerpos anti-VISTA y sus usos, los cuales se unen específicamente al dominio extracelular de 136 aminoácidos, por ejemplo anticuerpos para 1-50, 50-100, 100-136 aminoácidos, que se unen o

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o σι específicamente al IgV, anticuerpos que se unen específicamente a la región del tallo, anticuerpos que se unen específicamente a la región de transmembrana y anticuerpos que se unen específicamente la región citoplasmática. Estas regiones específicas se identifican en la solicitud.

Además, los anticuerpos recombinantes anti-PD-L3 o VISTA, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden tanto partes humanas como no-humanas, que se pueden preparar usando técnicas de ADN recombinante, están dentro del alcance de la invención. Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados se pueden producir por técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo usando los métodos descritos en Robinson y otros, solicitud internacional núm. PCT/US86/02269; Akira y otros, solicitud de patente europea 184,187; Taniguchi, M., solicitud de patente europea 171,496; Morrison y otros, solicitud de patente europea 173,494; Neuberger y otros, Publicación Internacional PCT núm. WO 86/01533; Cabilly y otros, patente de los Estados Unidos núm. 4,816,567; Cabilly y otros, solicitud de patente europea 125,023; Better y otros (1988) Science 240:1041-1043; Liu y otros (1987) Proc Nati. Acad. Sel. USA 84:3439-3443; Liu y otros (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun y otros (1987) Proc Nati. Acad. Sci. USA 84:214- 218; Nishimura y otros (1987) Cáncer Res. 47:999-1005; Wood y otros (1985) Nature 314:446-449; Shaw y otros (1988) J. Nati. Cáncer Inst. 80:1553-1559; Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi y otros (1986) Biotechniques 4:214; Winter, Patente de los Estados Unidos núm. 5,225,539; Jones y otros (1986) Nature 321:552-525; Verhoeyen y otros (1988) Science 239:1534; y Beidler y otros (1988) J. Immunol. 141:40534060.

Un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) se puede usar para aislar PD-L3 o VISTA por técnicas estándares, tales como cromatografía de afinidad o inmunoprecipitación. Un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA puede facilitar la purificación de PD-L3 o VISTA natural a partir de las células y PDL3 o VISTA producida de forma recombinante expresada en las células huéspedes. Además, un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA se puede usar para detectar el polipéptido PD-L3 o VISTA (por ejemplo, en un lisado celular o sobrenadante £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL celular) para evaluar la abundancia y el patrón de expresión del polipéptido PD-L3 o VISTA. Los anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA se pueden usar para monitorear en el diagnóstico los niveles de polipéptido en el tejido como parte de un procedimiento de ensayo clínico, para determinar por ejemplo, la eficacia de un régimen de tratamiento dado. La detección se puede facilitar por acoplamiento (es decir, enlazado físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen fluoresceína umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; ejemplos de materiales bioluminiscentes incluyen luciferasa, luciferina, y aequorina, y ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen 1125,1131, S35 o H3.

III. Vectores de expresión recombinante y células huéspedes

Otro aspecto de la invención se corresponde con los vectores, preferentemente vectores de expresión, que contienen una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido PD-L3 o VISTA (o una parte de éste). Como se usa en la presente descripción, el término vector se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se enlazó. Un tipo de vector es un plásmido, que se refiere a un bucle circular de ADN de doble cadena en el que se pueden ligar segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, en donde se pueden ligar los segmentos adicionales de ADN en el genoma viral. Determinados vectores son capaces de la replicación autónoma en una célula huésped en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomales de mamíferos). Otros vectores (por ejemplo, vectores no episomales de mamífero) se integran en el genoma de una célula huésped después de la introducción en la célula huésped, y

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL de ese modo se replican junto con el genoma del huésped. Además, determinados vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se enlazan operativamente. Dichos vectores se denominan en la presente invención como vectores de expresión. En general, los vectores de expresión de utilidad en las técnicas de ADN recombinante son frecuentemente en forma de plásmidos. En la presente especificación, plásmido y vector se pueden usar indistintamente ya que el plásmido es la forma más comúnmente usada de vector. Sin embargo, la invención pretende incluir dichas otras formas de vectores de expresión, tales como vectores virales (por ejemplo, replicación defectuosa de retrovirus, adenovirus y virus adeno-asociado), que cumplen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinante de la invención comprenden un ácido nucleico de la invención en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula huésped, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas sobre la base de las células huéspedes a utilizar para la expresión, que se enlazan operativamente a la secuencia de ácido nucleico que se expresa. Dentro de un vector de expresión recombinante, enlazado operativamente se pretende significar que la secuencia de nucleótidos de interés se enlaza a la secuencia(s) reguladora(s) de una manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula huésped cuando el vector se introduce en la célula huésped). El término secuencia reguladora pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (1990) Methods Enzymol. 185:3-7. Las secuencias reguladoras incluyen aquellas que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células huéspedes y aquellas de expresión directa de la secuencia de nucleótidos sólo en determinadas células huéspedes (por ejemplo, secuencias reguladoras de tejidos específicos). Se apreciará por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula huésped a transformar, el nivel de expresión de la proteína o

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL deseada, y similares. La vectores de expresión de la invención se pueden introducir en células huéspedes para producir de ese modo proteínas o péptidos, incluyendo proteínas o péptidos de fusión, codificados por ácidos nucleicos como se describen en la presente invención (por ejemplo, polipéptidos PD-L3 o VISTA, formas mutantes de polipéptidos PD-L3 o VISTA, proteínas de fusión y similares).

Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden diseñar para la expresión de polipéptidos PD-L3 VISTA en células procarióticas eucarióticas. Por ejemplo, los polipéptidos PD-L3 VISTA se pueden expresar en células bacterianas tales como E. col!, células de insectos (usando vectores de V expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Las células huéspedes adecuadas se discuten además en Goeddel (1990) arriba. Como alternativa, el vector de expresión recombinante se puede transcribir y traducir in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor T7 y polimerasa T7. Las proteínas de fusión purificadas se pueden usar en los ensayos de actividad de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, se describen en detalle a continuación, ensayos directos o ensayos competitivos), o para generar anticuerpos específicos a polipéptidos PD-L3 o VISTA, por ejemplo. En otra modalidad, el vector de expresión de PD-L3 o VISTA es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en la levadura S. cerevisiae incluyen pYepSecI (Baldari y otros (1987) EMBO J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz (1982) Cell 30:933943), pJRY88 (Schultz y otros (1987) Gene 54: 113-123), pYES2 (Invitrogen

Corporation, San Diego, California), y picZ (Invitrogen Corporation, San Diego

California). Como alternativa, los polipéptidos PD-L3 o VISTA se pueden expresar en células de insectos usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de polipéptidos en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf9) incluyen la serie pAc (Smith y otros (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow y Summers (1989) Virology 170:3139). En aún otra modalidad, un ácido nucleico de la invención se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman y otros (1987) EMBO J. 6:187-195). Cuando se usa o

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U1 en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión se proporcionan frecuentemente por elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente se derivan de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y virus de simio 40. Para otros sistemas de expresión adecuados tanto para células procariotas como eucariotas, ver los capítulos 16 y 17 de Sambrook, J. y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2da edición, Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y. 1989.

En otra modalidad, el vector de expresión recombinante de mamífero es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo de célula en particular (por ejemplo, los elementos reguladores específicos de tejidos se usan para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores específicos de tejido se conocen en la técnica. Los ejemplos no limitantes de promotores adecuados específicos de tejido incluyen el promotor de albúmina (específico de hígado; Pinkert y otros (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores específicos de linfoides (Caíame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275). En particular los promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Baneji y otros (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), los promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor de neurofilamentos; Byrne y Ruddle (1989) Proc Nati Acad Sci USA. 86:54735477), promotores específicos de páncreas (Edlund y otros (1985), Science 230:912-916), y promotores específicos de glándula mamaria (por ejemplo, el promotor de suero de leche; patente de los Estados Unidos, núm 4,873,316 y publicación de la solicitud europea núm 264,166). Los promotores en desarrollo regulados incluyen también, por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de alfafetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev.. 3:537-546).

La invención proporciona además un vector de expresión recombinante que comprende una molécula de ADN de la invención clonada dentro del vector de expresión en una orientación antisentido. Es decir, la molécula de ADN está operativamente enlazada a una secuencia reguladora de manera que permite la £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL expresión (por transcripción de la molécula de ADN) de una molécula de ARN que es antisentido al ARNm de PD-L3 o VISTA. Las secuencias reguladoras operativamente enlazadas a una molécula de ácido nucleico clonada en la orientación antisentido se pueden seleccionar para dirigir la expresión continua de la molécula de ARN antisentido en una variedad de tipos de células, por ejemplo, promotores y/o potenciadores virales, o se pueden seleccionar las secuencias reguladoras para dirigir la expresión constitutiva, específica de tejido o específica al tipo de célula del ARN antisentido. El vector de expresión antisentido puede estar en forma de un plásmido, fagémido, o virus atenuado recombinante en los cuales los ácidos nucleicos antisentido se producen bajo el control de una región reguladora de alta eficiencia, cuya actividad se puede determinar por el tipo de célula en la que se introduce el vector. Para una discusión de la regulación de la expresión génica usando genes antisentido, ver Weintraub, H. y otros, Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews--Trends in Genetics, volumen 1(1) 1986.

Otro aspecto de la invención se corresponde con las células huéspedes en las que una molécula de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA de la invención se introduce, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA dentro de un vector de expresión recombinante o una molécula de ácido nucleico de PDL3 o VISTA que contiene secuencias que le permiten recombinarse homólogamente en un sitio específico del genoma de la célula huésped. Los términos célula huésped y célula huésped recombinante se usan indistintamente en la presente descripción. Se entiende que dichos términos se refieren no sólo a la célula objeto en particular sino a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Debido a que pueden producirse determinadas modificaciones en generaciones sucesivas ya sea por mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede, de hecho, no ser idéntica a la célula parental, pero aún se incluyen dentro del alcance del término tal como se usa en la presente descripción. Una célula huésped puede ser cualquier célula procariota o eucariota. El ADN del vector se puede introducir en células procariotas o eucariotas a través de técnicas convencionales de transformación o transfección. Como se usa en la presente descripción, los o

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en términos transformación y transfección pretenden referirse a una variedad de técnicas reconocidas en la técnica para introducir el ácido nucleico foráneo (por ejemplo, ADN) en una célula huésped, que incluyen la co-precipitación con fosfato de calcio o cloruro de calcio, transfección mediada por DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar las células huéspedes se pueden encontrar en Sambrook y otros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2da, edición, Coid Spring Harbor Laboratory, Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, N.Y., 1989), y otros manuales de laboratorio. Para identificar y seleccionar estos integrantes, un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) se introduce generalmente en las células huéspedes junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen aquellos que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Una célula huésped de la invención, tal como una célula huésped procariota o eucariota en cultivo, se puede usar para producir (es decir, expresar) un polipéptido PD-L3 o VISTA. Por consiguiente, la invención proporciona además los métodos para producir un polipéptido PD-L3 o VISTA usando las células huéspedes de la invención. En una modalidad, el método comprende cultivar la célula huésped de la invención (en la que se introdujo un vector de expresión recombinante que codifica un polipéptido PD-L3 o VISTA) en un medio adecuado tal que un polipéptido PD-L3 o VISTA se produce. En otra modalidad, el método comprende además aislar un polipéptido PD-L3 o VISTA a partir del medio o la célula huésped.

Las células huéspedes de la invención se pueden usar para producir animales transgénicos no humanos. Por ejemplo, en una modalidad, una célula huésped de la invención es un oocito fertilizado o una célula madre embrionaria en la que se introdujo secuencias codificantes de PD-L3 o VISTA. Dichas células huéspedes se pueden usar después para crear animales transgénicos no humanos en los que se introdujeron en su genoma secuencias exógenas de PD-L3 o VISTA o animales recombinantes homólogos en los que se alteraron las secuencias endógenas de PD-L3 o VISTA. Dichos animales son útiles para estudiar la función y/o actividad de una PD-L3 o VISTA y para identificar y/o evaluar moduladores de

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U1 la actividad de PD-L3 o VISTA. Como se usa en la presente descripción, un animal transgénico es un animal no humano, preferentemente un mamífero, con mayor preferencia un roedor tal como una rata o ratón, en el que una o más de las células del animal incluye un transgén. Otros ejemplos de animales transgénicos incluyen primates no humanos, oveja, perros, vacas, cabras, pollos, anfibios, y similares. Un transgén es un ADN exógeno que se integra en el genoma de una célula a partir de un animal transgénico que desarrolla y permanece en el genoma del animal maduro, dirigiendo de ese modo la expresión de un producto génico codificado en uno o más tipos de células o tejidos del animal transgénico. Como se usa en la presente descripción, un animal recombinante homólogo es un animal no humano, preferentemente un mamífero, con mayor preferencia un ratón, en el que se alteró un gen endógeno de PD-L3 o VISTA mediante la recombinación homologa entre el gen endógeno y una molécula ADN exógena introducida en una célula del animal, por ejemplo, una célula embrionaria del animal, antes del desarrollo del animal. Un animal transgénico de la invención se puede crear introduciendo un ácido nucleico que codifica PD-L3 o VISTA en el pronúcleo masculino de un oocito fertilizado, por ejemplo, mediante microinyección, infección retroviral, y permitiendo al oocito desarrollarse en un animal de crianza hembra seudopreñada. La secuencia de ADNc de PD-L3 o VISTA de sec. con núms. de ident.: 1 ó 4 se puede introducir como un transgén en el genoma de un animal no humano. Como alternativa, un homólogo no humano de un gen de PD-L3 o VISTA humano, tal como un gen de PD-L3 o VISTA de mono o rata, se pueden usar como un transgén. Como alternativa, un gen homólogo a PD-L3 o VISTA, tal como otro miembro de la familia de PD-L3 O VISTA, se puede aislar en función de la hibridación a las secuencias de ADNc de PD-L3 O VISTA de sec. con núms. de ident.: 1 ó 3 (descrito anteriormente además en la subsección I) y se usa como un transgén. Las secuencias intrónicas y señales de poliadenilación se pueden incluir también en el transgén para aumentar la eficacia de la expresión del transgén. Una secuencia(s) reguladora específica a tejido puede estar operativamente enlazada a un transgén de PD-L3 o VISTA para dirigir la expresión de un polipéptido PD-L3 o VISTA en células particulares. Los métodos para generar animales transgénicos mediante la manipulación de embriones y microinyección, particularmente animales 102

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o σι tales como ratones, se han convertido en convencionales en la técnica y se describen, por ejemplo, en ias patentes de los Estados Unidos núms.4,736,866 y 4,870,009, ambas por Leder y otros, la patente de los Estados Unidos núm. 4,873,191 de Wagner y otros y en Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Coid Spring Harbor Laboratory Press, Coid Spring Harbor, Nueva York, 1986). Métodos similares se usan para la producción de otros animales transgénicos. Un animal transgénico fundador se puede identificar en función de la presencia de un transgén de PD-L3 o VISTA en su genoma y/o expresión del ARNm de PD-L3 o VISTA en tejidos o células de animales. Un animal transgénico fundador se puede usar entonces para criar animales adicionales que portan el transgén. Además, los animales transgénicos que portan un transgén que codifica un polipéptido PD-L3 o VISTA se puede cruzar además con otros animales transgénicos que portan otros transgenes.

Para crear un animal recombinante homólogo, se prepara un vector que contiene al menos una parte de un gen de PD-L3 o VISTA en la que una supresión, adición o sustitución se introdujo para alterar de ese modo, por ejemplo, interrumpir funcionalmente, el gen de PD-L3 o VISTA. El gen de PD-L3 o VISTA puede ser un gen humano o murino (por ejemplo, el ADNc de las sec. con núms. de ident.: 1 ó 3)

En otra modalidad, los animales transgénicos no humanos se pueden producir que contienen sistemas seleccionados que tienen en cuenta la expresión regulada del transgén. Un ejemplo de dicho sistema es el sistema de la recombinasa cre/loxP del bacteriófago P1. Para una descripción del sistema de recombinasa cre/loxP, ver, por ejemplo, Lakso y otros (1992) Proc Nati. Acad. Sci. USA. 89:6232-6236. Otro ejemplo de un sistema de recombinasa es el sistema de recombinasa FLP de S. cerevisiae (O'Gorman y otros (1991) Science 251:13511355. Si un sistema de recombinasa cre/loxP se usa para regular la expresión del transgén, se requieren los animales que contienen transgenes que codifican tanto la recombinasa Cre y un polipéptido seleccionado. Dichos animales se pueden proporcionar mediante la construcción de animales transgénicos doble, por ejemplo, acoplamiento de dos animales transgénicos, uno que contiene un

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U1 transgén que codifica un polipéptido seleccionado y el otro que contiene un transgén que codifica una recombinasa.

Los clones de los animales transgénicos no humanos descritos en la presente invención se pueden producir también de acuerdo con los métodos descritos en Wilmut, I. y otros (1997) Natura 385:810-813 y la publicación internacional PCT núms. WO 97/07668 y WO 97/07669. En resumen, una célula, por ejemplo, una célula somática, del animal transgénico se puede aislar e inducir para salir del ciclo de crecimiento y entrar en la fase G0. La célula quiescente puede fusionarse después, por ejemplo, a través del uso de pulsos eléctricos, a un oocito enucleado a partir de un animal de la misma especie de la cual se aísla la célula quiescente. El oocito reconstruido se cultiva después tal que se desarrolla a la etapa de mórula o blastocisto y se transfiere después al animal de crianza hembra seudopreñada. La descendencia nacida de este animal de crianza hembra será un clon del animal del que se aísla la célula, por ejemplo, la célula somática

IV. Composiciones Farmacéuticas

Las moléculas de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA, fragmentos de polipéptidos de PD-L3 o VISTA y anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA (también denominado en ia presente descripción como compuestos activos o agentes de modulación) de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para la administración. Dichas composiciones típicamente comprenden la molécula de ácido nucleico, polipéptido o anticuerpo y un vehículo, por ejemplo, un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en la presente descripción la expresión vehículo farmacéuticamente aceptable incluye cualquier disolvente, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y agentes retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de dichos medios y agentes en sustancias farmacéuticamente activas se conoce bien en la técnica. Excepto que, cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo su uso en las composiciones se contempla en la medida de lo posible. Los compuestos activos suplementarios también se pueden incorporar dentro de las composiciones.

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Como se señaló dichas composiciones pueden comprender adicionalmente antígeno deseado, por ejemplo, un antígeno tumoral u otros compuestos ¡nmunomoduladores, tales como agonistas del receptor similar a Toll, interferón tipo 1, tales como interferones alfa y beta y agonistas de CD40 tales como anticuerpos agonistas de CD40 y fragmentos de anticuerpos, preferentemente anticuerpos agonistas anti-CD40 humanos y fragmentos de anticuerpos u otros potenciadores o supresores inmunes tales como PD-L1, PD-L2, proteínas de fusión CTLA4 y anticuerpos específicos a ellos.

En algunas modalidades preferidas, la composición o terapia basada en PDL3 O VISTA puede incluir además un antígeno u otro agonista inmune. Cuando el antígeno está presente en la composición o terapia, se puede administrar en una cantidad que, en combinación con los otros componentes de la combinación, es eficaz para generar una respuesta inmune contra el antígeno. Por ejemplo, el antígeno se puede administrar en una cantidad aproximadamente de 100 .mu.g/kg aproximadamente 100 mg/kg. En algunas modalidades, el antígeno se puede administrar en una cantidad aproximadamente de 10 .mu.g /kg a aproximadamente 10 mg/kg. En algunas modalidades, el antígeno se puede administrar en una cantidad aproximadamente de 1 mg/kg a aproximadamente 5 mg/kg. La cantidad de antígeno en particular que constituye una cantidad eficaz para generar una respuesta inmune, sin embargo, depende en cierta medida de determinados factores tales como, por ejemplo, el antígeno en particular que se administra; el agonista en particular que se administra y la cantidad de éstos; el agonista en particular que se administra y la cantidad de éste; el estado del sistema inmune; el método y orden de administración del agonista y el antígeno; las especies a las que se administra la formulación; y el resultado terapéutico deseado. Como o

U1 consecuencia, no es práctico determinar generalmente la cantidad que constituye una cantidad eficaz del antígeno. Aquellos con experiencia en la técnica, sin embargo, pueden determinar fácilmente la cantidad apropiada con la debida consideración de dichos factores.

El antígeno puede ser cualquier material capaz de elevar una respuesta inmune Th1, que puede incluir uno o más de, por ejemplo, una respuesta de células

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T CD8+, una respuesta de células T NK, una respuesta de células T gamma/deita, o una respuesta de anticuerpos Th1. Los antígenos adecuados incluyen pero no se limitan a péptidos; polipéptidos; lípidos; glicolípidos; polisacáridos; carbohidratos; polinucleótidos; priones; bacterias vivas o inactivadas; virus u hongos; y antígenos bacterianos, virales, fúngicos, protozoos, antígenos derivado de tumor, o derivado de organismo, toxinas o toxoides.

Además, determinados antígenos actualmente experimentales, especialmente materiales tales como proteínas recombinantes, glicoproteínas y péptidos que no causan una respuesta inmunológica fuerte, se pueden usar en conexión con combinaciones de adyuvantes de la invención. Los antígenos de subunidades experimentales ilustrativos incluyen aquellos relacionados con la enfermedad viral, tales como adenovirus, SIDA, varicela, citomegalovirus, dengue, leucemia felina, peste aviar, hepatitis A, hepatitis B, HSV-1, HSV-2, cólera del cerdo, influenza A, influenza B, encefalitis japonesa, sarampión, parainfluenza, rabia, virus sincitial respiratorio, rotavirus, verruga, y fiebre amarilla.

En una modalidad, el antígeno puede ser un antígeno de cáncer o un antígeno tumoral. Los términos antígeno de cáncer y antígeno tumoral se usan indistintamente y se refieren a un antígeno que se expresa diferencialmente por las células cancerosas. Por lo tanto, los antígenos de cáncer se pueden explotar para orientar diferencialmente una respuesta inmune contra las células cancerosas. Los antígenos de cáncer, pueden así estimular potencialmente las respuestas inmunes tumor-específica. Determinados antígenos de cáncer se codifican, aunque no necesariamente se expresan, por las células normales. Algunos de estos antígenos se pueden caracterizar normalmente como silentes (es decir, no se expresan) en células normales, esos que se expresan sólo en determinadas etapas de diferenciación, y aquellos que temporalmente se expresan (por ejemplo, los antígenos embrionarios y fetales). Otros antígenos de cáncer se pueden codificar por genes celulares mutantes tales como, por ejemplo, oncogenes (por ejemplo, oncogén ras activado), genes supresores (por ejemplo, p53 mutante), o proteínas de fusión resultantes de supresiones interiores o translocaciones cromosómicas.

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Aún otros antígenos de cáncer se pueden codificar por genes virales tales como esos trasmitidos por los virus tumorales del ARN y ADN.

Los ejemplos de antígenos tumorales incluyen MAGE, MART-1/Melan-A, gp 100, dipeptidil peptidasa IV (DPPUV), proteína de unión adenosina deaminasa (ADAbp), ciclofilina b, antígeno colorrectal asociado (CRC)-C017-1A/GA733, antígeno carcinoembrionario (CEA) y sus epítopos antigénicos CAP-1 y CAP-2, etv6, am11, antígeno específico a próstata (PSA) y sus epítopos antigénicos PSA1, PSA-2 y PSA-3, antígeno de membrana específico a próstata (PSMA), cadena zeta del receptor células T/CD3, familia de antígenos tumorales MAGE (por ejemplo, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2 (MAGE-B2), MAGE-Xp3 (MAGE-B3), MAGE-Xp4 (MAGE-B4), MAGE-C1, MAGEC2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), familia de antígenos tumorales-GAGE (por ejemplo, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, tirosinasa, p53, familia MUC, HER2/neu, p21ras, RCAS1, alfafetoproteína, epsiloncaderina alfa-catenina, beta-catenina, gamma.-catenina, p120ctn, gp10.sup.Pmel117, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, proteína coli de poliposis adenomatosa (APC), fodrina, Conexina 37, idiotipo-lg, p15, gp75, gangliósidos GM2 y GD2, productos virales tales como proteínas del virus del papiloma humano, antígenos tumorales de la familia Smad, lmp-1, PIA, antígeno nuclear codificado por EBV (EBNA)-1, glucógeno fosforilasa cerebral, SSX-1, SSX-2 (HOM-MEL-40), SSX-3, SSX-4, SSX-5, SCP-1 y CT-7, y c-erbB-2.

Los cánceres o tumores y antígenos tumorales específicos asociados con dichos tumores (pero no exclusivamente), incluyen leucemia linfoblástica aguda (etv6, am11, ciclofilina b), linfoma de células B (idiotipo-lg), glioma (E-caderina, alfacatenina, beta-catenina, gamma-catenina, p120ctn), cáncer de vejiga (p21ras), cáncer biliar (p21ras), cáncer de mama (familia MUC, HER2/neu, c-erbB-2), carcinoma cervical (p53, p21ras), carcinoma de colon (p21ras, HER2/neu, c-erbB-2, familia MUC), cáncer colorrectal (antígeno colorectal asociado (CRC)-CO171A/GA733, APC), coriocarcinoma (CEA), cáncer de células epiteliales (ciclofilina b),

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en cáncer gástrico (HER2/neu, c-erbB-2, glicoproteína ga733), cáncer hepatocelular (alfa-fetoproteína), linfoma de Hodgkins (lmp-1, EBNA-1), cáncer de pulmón (CEA, MAGE-3, NY-ESO-1), leucemia derivada de células linfoides (ciclofilina b), melanoma (proteína p5, gp75, antígeno oncofetal, gangliósidos GM2 y GD2, MelanA/MART-1, cdc27, MAGE-3, p21ras, gplOO.sup.Pmell 17), mieloma (familia MUC, p21ras), carcinoma de pulmón de células no pequeñas (HER2/neu, c-erbB-2), cáncer de la nasofaringe (lmp-1, EBNA-1), cáncer de ovario (familia MUC, HER2/neu, c-erbB-2), cáncer de próstata (Antígeno Específico a Próstata (PSA) y su epítopos antigénicos PSA-1, PSA-2, y PSA-3, PSMA, HER2/neu. c-erbB-2 glicoproteína ga733), cáncer renal (HER2/neu, c-erbB-2), cánceres de células escamosas del cuello de útero y esófago (productos virales tales como proteínas del virus de papiloma humano), cáncer testicular (NY-ESO-1), y leucemia de células T (epítopos HTLV-1).

Una composición farmacéutica de la invención se formula para ser compatible con su vía de administración prevista. Los ejemplos de vías de administración parenteral incluyen, por ejemplo, administración intravenosa, intradérmica, subcutánea, oral (por ejemplo, inhalación), transdérmica (tópica), transmucosa y rectal. Las soluciones o suspensiones usadas para aplicación parenteral intradérmica, o subcutánea pueden incluir los siguientes componentes: un diluyente estéril tal como agua para inyección, solución salina, aceites fijos, polietilenglicoles, glicerina, propilenglicol u otros disolventes sintéticos; agentes antibacterianos tales como alcohol bencílico o parabenos metilo; antioxidantes tales como ácido ascórbico o bisulfito de sodio; agentes quelantes tales como ácido etilendiaminotetraacético; tampones tales como acetatos, citratos o fosfatos y agentes para el ajuste de la tonicidad tales como cloruro de sodio o dextrosa. El pH se puede ajustar con ácidos o bases, tal como ácido clorhídrico o hidróxido de sodio. La preparación parenteral se puede contener en ampollas, jeringas desechables o viales de dosis múltiples hechos de vidrio o plástico.

Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando es soluble en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL inyectables estériles. Para la administración intravenosa, los vehículos adecuados incluyen solución salina fisiológica, agua bacteriostática, Cremophor EL.TM. (BASF

Parsippany, N.J.) o solución salina regulada con fosfato (PBS). En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida en la medida que exista fácil disponibilidad de jeringa. Debe ser estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y debe preservarse contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido, y similares), y mezclas adecuadas de éstos. La fluidez apropiada se puede conservar, por ejemplo, usando un revestimiento tal como lecitina, mediante la conservación del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. La prevención de la acción de microorganismos se puede lograr mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos en la composición, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol sorbitol, y cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede provocar incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar incorporando el compuesto activo (por ejemplo, agentes de modulación tales como una molécula de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA, un fragmento de un polipéptido PD-L3 o VISTA, un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA, o una combinación de un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA y un anticuerpo anti-PD-L1) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son el o

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U1 secado al vacío y liofilización que producen un polvo de ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente filtrada de éste.

Las composiciones orales generalmente incluyen un diluyente inerte o un vehículo comestible. Pueden encerrarse en cápsulas de gelatina o comprimirse en pastillas. Para el propósito de administración terapéutica oral, el compuesto activo se puede incorporar con excipientes y usar en forma de pastillas, trociscos cápsulas. Las composiciones orales se pueden preparar también usando o

un vehículo fluido para uso como un enjuague bucal, en donde el compuesto en el vehículo fluido se aplica oralmente y agita y expectora o ingiere. Los agentes de unión farmacéuticamente compatibles, y/o materiales adyuvantes se pueden incluir como parte de la composición. Las pastillas, píldoras, cápsulas, trociscos similares pueden contener cualquiera de los siguientes ingredientes, o compuestos de una naturaleza similar: un aglutinante tales como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tales como almidón o lactosa, un agente

desintegrante tales como ácido algínico, Primogel, o almidón de maíz; un lubricante tales como estearato de magnesio o esterotes; un agentes de deslizamiento tal como dióxido de silicio coloidal; un agente educorante tal como sacarosa o sacarina, o un agente saborizante tales como menta, salicilato de metilo o sabor de naranja.

Para la administración por inhalación, los compuestos se administran en la forma de un atomizador de aerosol de un contenedor o dispensador presurizado que contiene un propulsor adecuado, por ejemplo, un gas tal como dióxido de carbono, o un nebulizador.

La administración sistémica puede ser también por medio transmucoso o transdérmico. Para la administración transmucosa o transdérmica, se usan en la formulación agentes penetrantes apropiados para que se permee la barrera. Dichos agentes penetrantes se conocen generalmente en la técnica, e incluyen, por ejemplo, para la administración transmucosa, detergentes, sales biliares, derivados del ácido fusídico. La administración transmucosa se puede lograr a través del uso de atomizadores nasales o supositorios. Para la administración transdérmica, los no

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en compuestos activos se formulan en ungüentos, pomadas, geles, o cremas como se conoce generalmente en la técnica.

Los compuestos se pueden preparar también en forma de supositorios (por ejemplo, con bases convencionales de supositorios tales como manteca de cacao y otros glicéridos) o enemas de retención para la administración rectal. En una modalidad, los compuestos activos se preparan con vehículos que protegerán el compuesto contra la eliminación rápida del cuerpo, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes y sistemas microencapsulados de administración. Los polímeros biodegradables, biocompatibles se pueden usar, tales como acetato vinil etiieno, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres, y ácido poliláctico. Los métodos para la preparación de dichas formulaciones serán evidentes para aquellas personas con experiencia en la técnica. Los materiales se pueden obtener comercialmente también a partir de Alza Corporation y Nova Pharmaceuticals, Inc. Las suspensiones liposomales (incluyendo liposomas dirigidos a células infectadas con anticuerpos monoclonales de antígenos virales) se pueden usar también como vehículos farmacéuticamente aceptables. Estos se pueden preparar de acuerdo con métodos conocidos por las personas con experiencia en la técnica, por ejemplo, como se describe en la Patente de los Estados Unidos núm. 4,522,811.

Es especialmente ventajoso formular composiciones orales o parenterales en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria según se usa en la presente descripción se refiere a las unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para que se trate el individuo; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitarias de la invención se dictan por y dependen directamente de las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico a lograrse en particular, y las limitaciones inherentes en la técnica de componer dicho compuesto activo para el tratamiento de individuos.

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o

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La toxicidad y eficacia terapéutica de dichos compuestos se pueden determinar por procedimientos farmacéuticos estándares en cultivos celulares o animales experimentales. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivos celulares y estudios con animales se pueden usar en la formulación a un intervalo de dosificación para uso en seres humanos. La dosificación de dichos compuestos preferentemente se encuentra dentro de un intervalo de concentraciones circulantes que incluyen la ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos de cultivo celular. Una dosis se puede formular en modelos animales para lograr una concentración plasmática circulante en el intervalo que incluye la IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que logra la inhibición media máxima de los síntomas) como se determina en el cultivo celular. Dicha información se puede usar para determinar más exactamente las dosis útiles en seres humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, mediante cromatografía líquida de alto rendimiento.

Como se define en la presente descripción, una cantidad terapéuticamente eficaz de proteína o polipéptido (es decir, una dosificación eficaz) se encuentra en el intervalo de aproximadamente 0.001 a 30 mg/kg de peso corporal, preferentemente aproximadamente de 0.01 a 25 mg/kg de peso corporal, con mayor preferencia aproximadamente de 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal, y aún con mayor preferencia aproximadamente de 1 a 10 mg/kg, 2 a 9 mg/kg, 3 a 8 mg/kg, 4 a 7 mg/kg, o 5 a 6 mg/kg de peso corporal. El técnico con experiencia apreciará que determinados factores pueden influir en la dosificación requerida para tratar efectivamente a un individuo, incluyendo pero sin limitarse a la gravedad de la enfermedad o trastorno, tratamientos anteriores, la salud general y/o edad del individuo, y otras enfermedades presentes. Además, el tratamiento de un individuo con una cantidad terapéuticamente eficaz de una proteína, polipéptido o anticuerpo puede incluir un tratamiento único o, preferentemente, puede incluir una serie de tratamientos.

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En un ejemplo preferido, un individuo se trata con anticuerpo, proteína, o polipéptido en el intervalo aproximadamente entre 0.1 a 20 mg/kg de peso corporal, una vez por semana durante aproximadamente entre 1 a 10 semanas, preferentemente entre 2 a 8 semanas, con mayor preferencia aproximadamente entre 3 a 7 semanas, y aún con mayor preferencia aproximadamente de 4, 5, ó 6 semanas. Se apreciará también que la dosificación eficaz de anticuerpo, proteína o polipéptido usado para el tratamiento puede aumentar o disminuir en el curso de un tratamiento en particular. Los cambios en la dosificación pueden resultar y ser evidentes a partir de los resultados de los ensayos de diagnóstico como se describe en la presente invención.

La presente invención incluye los agentes que modulan la expresión o actividad de PD-L3 o VISTA. Un agente puede, por ejemplo, ser una molécula pequeña. Por ejemplo, dichas moléculas pequeñas incluyen, pero no se limitan a, péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polínucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compuestos orgánicos o inorgánicos (es decir, incluyendo compuestos heteroorgánicos y organometálicos) que tienen un peso molecular aproximadamente menor que 10,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular aproximadamente menor que 5,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular aproximadamente menor que 1,000 gramos por mol, compuestos orgánicos o inorgánicos que tienen un peso molecular aproximadamente menor que 500 gramos por mol, y sales, ásteres, y otras formas farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos. Se entenderá que las dosis apropiadas de agentes moleculares pequeños dependen de una serie de factores dentro del alcance de aquellos con pericia en la medicina, veterinaria o investigación. La(s) dosis de molécula pequeña variará, por ejemplo, en dependencia de la identidad, tamaño y afección del individuo o muestra a tratar, además en dependencia de la vía por la que se administra la composición, si es aplicable, y el efecto que desea el médico tenga la molécula pequeña sobre el ácido nucleico o polipéptido de la invención.

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σι

Las dosis ilustrativas incluyen cantidades en miligramos o microgramos de la molécula pequeña por kilogramo de peso del individuo o muestra (por ejemplo, aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 500 miligramos por kilogramo, aproximadamente

100 microgramos por kilogramo aproximadamente 5 miligramos por kilogramo, o aproximadamente 1 microgramo por kilogramo a aproximadamente 50 microgramos por kilogramo). Se entiende además que las dosis apropiadas de una molécula pequeña dependen de la potencia de la molécula pequeña con respecto a la expresión o actividad que se modula. Dichas dosis apropiadas se pueden determinar usando los ensayos que se describen en la presente invención. Cuando una o más de estas moléculas pequeñas se deben administrar a un animal (por ejemplo, un ser humano) para modular la expresión o actividad de un polipéptido o ácido nucleico de la invención, un médico, veterinario o investigador puede, por ejemplo, prescribir una dosis relativamente baja al principio, aumentando posteriormente la dosis hasta que se obtiene una respuesta apropiada. Además, se entiende que el nivel de dosis específico para cualquier individuo animal en particular dependerá de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, y dieta del individuo, el tiempo de administración, la ruta de administración, la tasa de excreción, cualquier combinación de fármacos, y el grado de expresión o actividad que se modula.

Además, un anticuerpo (o fragmento de éste) se puede conjugar con una región terapéutica tai como una citotoxina, un agente terapéutico o un ion metálico radiactivo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que es perjudicial para las células. Los ejemplos incluyen taxoi, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi diona antracina, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticoides, *

procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol y puromicina y homólogos de éstos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo metotrexato

6-mercaptopurina,

6-tioguanina, citara bina

5-fluorouracilo decarbazina), agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina, tioepa

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL clorambucilo, melfalano, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU), ciclotosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatino), antraciclinas (por ejemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (por ejemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina, y antramicina (AMC)), y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastlna).

Los conjugados de la invención se pueden usar para modificar una respuesta biológica dada, la región del fármaco que no se construye para limitar a los agentes clásicos químicos terapéuticos. Por ejemplo, la región del fármaco puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Dichos polipéptidos pueden incluir, por ejemplo, una toxina tales como abrina, ricina A, exotoxina de pseudomonas, o toxina diftérica; una proteína tales como factor de necrosis tumoral, interferón alfa, interferón beta, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento derivado de plaquetas, activador del plasminógeno tisular; o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL-Γ), interieucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulante de colonia de granulocitos (G-CSF) u otros factores de crecimiento. Las técnicas para conjugar dicha región terapéutica con anticuerpos se conocen bien.

Las moléculas de ácidos nucleicos de la invención se pueden insertar en vectores y usar como vectores de terapia génica. Los vectores de terapia génica se pueden administrar a un individuo mediante, por ejemplo, inyección intravenosa, administración local (ver patente de los Estados Unidos núm. 5,328,470) o por inyección estereostática (ver, por ejemplo, Chen y otros (1994) Proc Nati. Acad. Sci. USA. 91:3054-3057). La preparación farmacéutica del vector de terapia génica puede incluir el vector de terapia génica en un diluyente aceptable, o puede comprender una matriz de liberación lenta en la que se embebe el vehículo de administración génica. Como alternativa, cuando el vector de administración génica completo se puede producir intacto a partir de células recombinantes, por ejemplo, vectores retrovirales, la preparación farmacéutica puede incluir una o más células o

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U1 que producen el sistema de administración génica.

Las composiciones farmacéuticas se pueden incluir en un recipiente, envase o dispensador junto con las instrucciones para la administración.

V. Usos y Métodos de la Invención

Las moléculas de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, las moléculas de ácido nucleico, polipéptidos, homólogos de polipéptidos, y anticuerpos y fragmentos de anticuerpos de PD-L3 o VISTA descritos en la presente invención se pueden usar en uno o más de los siguientes métodos: a) ensayos de tamizaje; b) medicina predictiva (por ejemplo, ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico, ensayos de monitoreo clínico), y c) métodos de tratamiento (por ejemplo, terapéutico y profiláctico, por ejemplo, modulando positiva y negativamente la respuesta inmune). Como describe en la presente invención, un polipéptido de PD-L3 o VISTA de la invención tiene una o más de las siguientes actividades: 1) se une a y/o modula la actividad de su pareja(s) de unión natural, 2) modula la señalización intra-o intercelular, 3) modula la activación de linfocitos T, 4) modula la respuesta inmunitaria de un organismo, por ejemplo, un organismo mamífero, tal como un ratón o ser humano. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de la invención se pueden usar, por ejemplo, para expresar el polipéptido de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, a través del vector de expresión recombinante en una célula huésped en aplicaciones de terapia génica), para detectar el ARNm de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, en una muestra biológica) o una alteración genética en un gen de PD-L3 o VISTA, y para modular la actividad de PD-L3 o VISTA, tal como se describe más abajo. Los polipéptidos de PD-L3 o VISTA se pueden usar para tratar afecciones o trastornos caracterizados por la producción insuficiente o excesiva de un polipéptido de PD-L3 o VISTA o producción de inhibidores de PD-L3 o VISTA. Además, los polipéptidos de PD-L3 o VISTA se pueden usar para tamizar la(s) pareja(s) de unión de origen natural de PD-L3 o VISTA, para tamizar fármacos o compuestos que modulan la actividad de PD-L3 o VISTA, así como para tratar afecciones o trastornos caracterizadas por la producción insuficiente o excesiva del polipéptido de PD-L3 o VISTA o producción de formas de polipéptidos de PD-L3 o

VISTA que disminuyeron, de manera aberrante o indeseada la actividad en

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σι comparación con el polipéptido de tipo salvaje de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, trastornos del sistema inmunológico como la inmunodeficiencia severa combinada, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, diabetes mellitus tipo I, síndrome linfoproliferativo, enfermedad intestinal inflamatoria, alergias, asma, enfermedad de injerto contra huésped, y rechazo de trasplantes; respuestas inmunes a patógenos infecciosos tales como bacterias y virus; y cánceres del sistema inmune tales como linfomas y leucemias). Además, los anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA de la invención •b se pueden usar para detectar y aislar polipéptidos de PD-L3 o VISTA, regular la biodisponibilidad de polipéptidos de PD-L3 o VISTA, y modular la actividad de PDL3 o VISTA, por ejemplo, modulando la interacción entre PD-L3 o VISTA y su(s) pareja(s) de unión natural.

A. Ensayos de tamizaje:

La invención proporciona un método (también denominado en la presente descripción como un ensayo de tamizaje) para identificar moduladores, es decir, candidatos o compuestos o agentes de prueba (por ejemplo, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas u otros fármacos) que se unen a polipéptidos de PD-L3 o VISTA, tienen un efecto estimulante o inhibidor en, por ejemplo, la expresión de PD-L3 o VISTA o actividad de PD-L3 o VISTA, o tienen un efecto estimulante o inhibidor en la interacción entre PD-L3 o VISTA y su(s) pareja(s) de unión natural.

En una modalidad, la invención proporciona ensayos para tamizar el candidato o compuestos de prueba que se unen a la proteína o polipéptido de PDL3 o VISTA o la parte biológicamente activa de éstos, por ejemplo, modulan la capacidad del polipéptido de PD-L3 o VISTA de interactuar con su(s) pareja(s) de unión natural. En otra modalidad, la invención proporciona ensayos para tamizar los candidatos o compuestos de prueba que se unen a o modulan la actividad de una proteína o polipéptido de PD-L3 o VISTA o parte biológicamente activa de éstos. En una modalidad preferida, la invención proporciona ensayos para tamizar candidatos o compuestos de prueba que tienen un efecto estimulante o inhibidor sobre las funciones inmunes reguladas negativamente por PD-L3 o VISTA tai como se identifican en la presente descripción o en función de su efecto sobre la interacción

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IMPI entre PD-L3 o VISTA y su(s) pareja(s) dé unión natural. Estas funciones asociadas con PD-L3 o VISTA incluyen a modo de ejemplo la inhibición de la producción de citoquinas (por ejemplo, IL-2, interferón gamma por células T, supresión de la coestimulación moderada de CD28, inhibición de la proliferación de células T CD4+ y CD8+, supresión de la proliferación de células T CD4+ vírgenes y de memoria, y supresión de la activación de TCR sin la inducción de apoptosis. Los compuestos de prueba de la presente invención se pueden obtener usando cualquiera de los numerosos enfoques en los métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, incluyendo: bibliotecas biológicas: bibliotecas paralelas espacialmente direccionables de fase sólida o en solución; métodos de bibliotecas sintéticas que requieren deconvolución; el método de biblioteca una sola gota un compuesto , y métodos de bibliotecas sintéticas que usan la selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de biblioteca biológica se limita a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques se aplican a péptidos, oligómeros no peptídicos o bibliotecas de compuestos de moléculas pequeñas (Lam, K.S. (1997) Anticancer Drug Des. 12:145).

En una modalidad, un ensayo es un ensayo basado en células en el que una célula que expresa un polipéptido de PD-L3 o VISTA o parte biológicamente activa de éste se pone en contacto con un compuesto de prueba, y se determina la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de PD-L3 o VISTA. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de PD-L3 o VISTA se puede lograr monitoreando, por ejemplo, la capacidad de PD-L3 o VISTA para unirse a su(s) pareja(s) de unión natural, y modular la actividad de las células inmunes. La célula inmune puede ser, por ejemplo, una célula T, una célula B o una célula mieloide. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para modular la unión de PD-L3 o VISTA a su contra-receptor (a determinarse) se puede llevar a cabo, por ejemplo, acoplando PD-L3 o VISTA con un radioisótopo o marcador enzimático para monitorear la capacidad de un compuesto de prueba para modular la unión de PD-L3 o VISTA a las células T que expresan el contra-receptor de PD-L3 o VISTA. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para unirse a PD-L3 o VISTA se puede w

o σι

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL llevar a cabo, por ejemplo, acoplando el compuesto con un radioisótopo o marcador enzimático tal que la unión del compuesto a PD-L3 o VISTA se puede determinar detectando el compuesto de PD-L3 o VISTA marcado en un complejo.

También está dentro del alcance de esta invención determinar la capacidad de un compuesto para interactuar con PD-L3 o VISTA sin el mareaje de cualquiera de los interactuantes. Por ejemplo, un microfisiómetro se puede usar para detectar la interacción de un compuesto con PD-L3 o VISTA sin el mareaje ya sea del compuesto o el PD-L3 o VISTA (McConnell, H.M. y otros (1992) Science 257:19061912). Como se usa en la presente descripción, un microfisiómetro” (por ejemplo, Cytosensor) es un instrumento analítico que mide la velocidad a la que una célula acidifica su entorno usando un sensor potenciométrico de luz direccionable (LAPS). Los cambios en esta velocidad de acidificación se pueden usar como un indicador de la interacción entre un compuesto y PD-L3 o VISTA.

En otra modalidad, un ensayo es un ensayo basado en células que comprende contactar a la célula T que expresa una pareja de unión de PD-L3 o VISTA con un compuesto de prueba y determinar la capacidad del compuesto de prueba para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad de la pareja de unión de PD-L3 o VISTA. La determinación de la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de una pareja de unión de PD-L3 o VISTA se puede llevar a cabo, por ejemplo, determinando la capacidad del polipéptido de PDL3 o VISTA para unirse o interactuar con la pareja de unión de PD-L3 o VISTA.

La determinación de la capacidad del polipéptido de PD-L3 o VISTA, o un fragmento biológicamente activo de éste, para unirse o interactuar con una pareja de unión de PD-L3 o VISTA, se puede llevar a cabo por uno de los métodos descritos anteriormente para determinar la unión directa. En una modalidad preferida, la determinación de la capacidad del polipéptido de PD-L3 O VISTA para unirse o interactuar con una pareja de unión de PD-L3 O VISTA se puede llevar a cabo determinando la actividad de la pareja de unión. Por ejemplo, la actividad de la pareja de unión se puede determinar detectando la inducción de un segundo mensajero celular (por ejemplo, actividad de tirosina quinasa o fosfatasa), detectando la actividad enzimática catalítica de un sustrato apropiado, detectando 119 o

en

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o σι la inducción de un gen reportero (que comprende un elemento regulador sensible al objetivo operativamente enlazado a un ácido nucleico que codifica un marcador detectable, por ejemplo, luciferasa), o detectando una respuesta celular regulada por el objetivo. Por ejemplo, la determinación de la capacidad del polipéptido de PD-L3 o VISTA para unirse o interactuar con una pareja de unión natural a PD-L3 o VISTA, puede llevarse a cabo midiendo la capacidad de un compuesto para modular la co-estimulacion o inhibición de células inmunes en un ensayo de proliferación, o interfiriendo con la capacidad de un polipéptido de PD-L3 o VISTA para unirse a anticuerpos que reconocen una parte del polipéptido de PD-L3 o VISTA. En una modalidad, los compuestos que modulan la activación de células T se puede identificar determinando la capacidad de un compuesto para modular la proliferación de células T o producción de citoquinas. En una modalidad preferida los compuestos que modulan la activación de células T se pueden identificar determinando la capacidad de un compuesto para modular la proliferación de células T o producción de citoquinas en más de una concentración de antígeno.

En aún otra modalidad, un ensayo de la presente invención es un ensayo libre de células en el que un polipéptido de PD-L3 o VISTA o parte biológicamente activa de éste se pone en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad del compuesto de prueba para unirse al polipéptido de PD-L3 o VISTA o parte biológicamente activa de éste. Las partes biológicamente activas preferidas de los polipéptidos de PD-L3 o VISTA que se usan en los ensayos de la presente invención incluyen fragmentos que participan en las interacciones con otras moléculas no-PD-L3 o VISTA, por ejemplo, al menos una parte de un dominio extracelular que se une a una pareja de unión de PD-L3 o VISTA. La unión del compuesto de prueba al polipéptido de PD-L3 o VISTA se puede determinar ya sea directamente o indirectamente como se describió anteriormente.

En otra modalidad, el ensayo es un ensayo libre de células en el que un polipéptido de PD-L3 o VISTA o parte biológicamente activa de éste se pone en contacto con un compuesto de prueba y se determina la capacidad del compuesto de prueba para modular (por ejemplo, estimular o inhibir) la actividad del polipéptido de PD-L3 o VISTA o parte biológicamente activa de éste. La determinación de la

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o

U1 capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de un polipéptido de PD-L3 o VISTA se puede llevar a cabo, por ejemplo, determinando la capacidad del polipéptido PD-L3 o VISTA para unirse a una pareja de unión de PD-L3 o VISTA por uno de los métodos descritos anteriormente para determinar la unión directa. Los ensayos libres de células de la presente invención son susceptibles al uso de ambas formas de polipéptidos solubles y/o unidos a membrana (por ejemplo, polipéptidos de PD-L3 o VISTA o partes biológicamente activas de éstos, o parejas de unión a las que PD-L3 o VISTA se une). En el caso de los ensayos libres de células en el que una forma unida a membrana se usa un polipéptido (por ejemplo, un PD-L3 o VISTA de superficie celular), puede ser deseable utilizar un agente de solubilización tal que la forma unida a membrana del polipéptido se mantiene en solución. Los ejemplos de dichos agentes de solubilización incluyen detergentes no iónicos tales como noctilglucósido, n-dodecilglucósido, n-dodecilmaltósido, octano i IN-metilglucamida, decanoil-N-metilglucamida, Triton.RTM. X-100, Tritón.RTM. X114, Tesit, Isotridecipoli (éter de etilenglicol)n, 3-[(3-colamidopropyl) dimetilamonio]1-propano sulfonato (CHAPS), 3-[(3-colamidopropii) dimetilamonio]-2-hidroxi-1propano sulfonato (CHAPSO), o N-dodecil.dbd.NN-dimetil-3-amonio-1-propano sulfonato.

En más de una modalidad de los métodos de ensayo anteriores de la presente invención, puede ser deseable inmovilizar ya sea PD-L3 o VISTA o su pareja de unión para facilitar la separación de las formas complejas de las no complejas de uno o ambos polipéptidos, así como para acomodar la automatización del ensayo. La unión de un compuesto de prueba a un polipéptido de PD-L3 o VISTA, o la interacción de un polipéptido de PD-L3 o VISTA con su pareja de unión en presencia y ausencia de un compuesto candidato, se puede llevar a cabo en cualquier recipiente adecuado para contener los reactivos. Los ejemplos de dichos recipientes incluyen placas de microtitulación, tubos de ensayo y tubos de microcentrífuga. En una modalidad, se puede proporcionar una proteína de fusión que adiciona un dominio que permite a uno o ambos de los polipéptidos que se unan a una matriz. Por ejemplo, glutatión-S-transferasa/proteínas de fusión de PDL3 o VISTA o glutatión-S-transferasa/proteínas de fusión de la pareja de unión se

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en pueden adsorber sobre perlas de glutatión sefarosa (Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) o placas de microtitulación derivatizadas de glutatión, que se combinan después con el compuesto de prueba o el compuesto de prueba y ya sea el polipéptido de la pareja de unión no adsorbido o polipéptido PD-L3 o VISTA, y la mezcla se incubó en condiciones que conducen a la formación de complejos (por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH). A continuación de la incubación, ias perlas o pocilios de la placa de microtitulación se lavan para eliminar cualquiera de los componentes sin unirse, la matriz se inmoviliza en el caso de las perlas, y se determina la formación del complejo ya sea directamente o indirectamente, por ejemplo, como se describió anteriormente. Como alternativa, los complejos se pueden disociar de la matriz, y determinar el nivel de unión o actividad de PD-L3 o VISTA usando técnicas estándares. Otras técnicas para inmovilizar polipéptidos en matrices se pueden usar también en los ensayos de tamizaje de la invención. En una modalidad alternativa, la determinación de la capacidad del compuesto de prueba para modular la actividad de un polipéptido de PD-L3 o VISTA se puede llevar a cabo determinando la capacidad del compuesto de ensayo para modular la actividad de una molécula que funciona corriente abajo de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, interactuando con el dominio citoplasmático de una pareja de unión de PD-L3 o VISTA. Por ejemplo, los niveles de segundos mensajeros, la actividad de la molécula de interacción en una diana apropiada, o la unión del interactor a un objetivo apropiado se puede determinar según se describió anteriormente.

En otra modalidad, los moduladores de expresión de PD-L3 o VISTA se identifican con un método en donde una célula se pone en contacto con un compuesto candidato y se determina la expresión del ARNm o polipéptido de PDL3 o VISTA en la célula. El nivel de expresión del ARNm o polipéptido de PD-L3 o VISTA en presencia del compuesto candidato se compara con el nivel de expresión de ARNm o polipéptido de PD-L3 o VISTA en la ausencia del compuesto candidato. El compuesto candidato se puede identificar después como un modulador de la expresión de PD-L3 o VISTA en función de esta comparación si el cambio es estadísticamente significativo.

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DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL en

En aún otro aspecto de la invención, los polipéptidos de PD-L3 o VISTA se pueden usar como proteínas cebo en un ensayo de doble híbrido o ensayo de triple híbrido (ver, por ejemplo, patente de los Estados Unidos núm. 5,283,317; Zervos y otros (1993) Cell 72:223-232; Madura y otros (1993) J. Biol. Chem. 268:12046-12054; Bartel y otros (1993) Biotechniques 14:920-924; Iwabuchi y otros (1993) Oncogene 8: 1693-1696, y Brent WO94/10300), para identificar otros polipéptidos que se unen a o interactúan con PD-L3 o VISTA (proteínas de unión a PD-L3 o VISTA, parejas de unión a PD-L3 o VISTA, o PD-L3 o VISTA-bp) y se involucran en la actividad de PD-L3 o VISTA. Dichas proteínas de unión a PD-L3 o VISTA es probable también que se involucren en la propagación de las señales por los polipéptidos de PD-L3 o VISTA u objetivos de PDL3 o VISTA como, por ejemplo, los elementos corriente abajo de una vía de señalización mediada por PDL3 o VISTA. Como alternativa, dichos polipéptidos de unión a PD-L3 o VISTA pueden ser inhibidores de PD-L3 o VISTA. El sistema de dos híbridos se basa en la *

naturaleza modular de la mayoría de los factores de transcripción, que consisten en dominios separables de unión a ADN y activación. En resumen, el ensayo utiliza dos constructos de ADN diferentes. En un constructo, el gen que codifica para un polipéptido de PD-L3 o VISTA se fusiona a un gen que codifica el dominio de unión a ADN de un factor de transcripción conocido (por ejemplo, GAL-4). En el otro constnjcto, una secuencia de ADN, de una biblioteca de secuencias de ADN, que codifica un polipéptido no identificado (presa o muestra) se fusiona a un gen que codifica para el dominio de activación del factor de transcripción conocido. Si los polipéptidos cebo y presa son capaces de interactuar, in vivo, formando un complejo dependiente de PD-L3 o VISTA, los dominios de unión al ADN y activación del factor de transcripción se atraen en estrecha proximidad. Esta proximidad permite la transcripción de un gen reportero (por ejemplo, LacZ) que se enlaza operativamente a un sitio regulador transcripcional sensible al factor de transcripción. La expresión del gen reportero se puede detectar y las colonias celulares que contienen el factor de transcripción funcional se pueden aislar y usar para obtener el gen clonado que codifica el polipéptido que interactúa con el polipéptido de PD-L3 o VISTA.

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o σι ιι

En otro aspecto, la invención se corresponde con una combinación de dos o más de los ensayos descritos en la presente invención. Por ejemplo, un agente de modulación se puede identificar usando un ensayo basado en células o libre de células, y la capacidad del agente para modular la actividad de un polipéptido de PD-L3 o VISTA se puede confirmar in vivo, por ejemplo, en un animal tal como un modelo animal para la transformación celular y/o tumorigénesis.

Esta invención se corresponde además con nuevos agentes identificados por los ensayos de tamizaje anteriormente descritos. Como consecuencia, está dentro del alcance de esta invención usar además un agente identificado en un modelo animal apropiado como se describe en la presente invención. Por ejemplo, un agente identificado como se describe en la presente invención (por ejemplo, un agente de modulación de PD-L3 o VISTA, una molécula de ácido nucleico antisentido de PD-L3 o VISTA, un anticuerpo específico a PD-L3 o VISTA, o una pareja de unión a PD-L3 o VISTA) se puede usar en un modelo animal para determinar los efectos de eficacia, toxicidad o efectos secundarios del tratamiento con dicho agente. Como alternativa, un agente identificado como se describe en la presente invención se puede usar en un modelo animal para determinar el mecanismo de acción de dicho agente. Además, esta invención se corresponde con los usos de nuevos agentes identificados por los ensayos de tamizaje descritos anteriormente para los tratamientos que se describen en la presente invención.

B. Ensayos de Detección

Las partes o fragmentos de las secuencias de ADNc identificadas en la presente descripción (y las secuencias génicas completas correspondientes) se pueden usar de diversas maneras como reactivos de polinucleótidos. Por ejemplo, estas secuencias se pueden usar para: (i) mapear sus respectivos genes en un cromosoma, y, así, localizar regiones génicas asociadas con la enfermedad genética; (ii) identificar un individuo de una muestra biológica diminuta (tipificación de tejido), y (iii) ayudar en la identificación forense de una muestra biológica. Estas aplicaciones se describen en las sub-secciones siguientes.

1. Mapeo cromosómico

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Una vez que se aisló la secuencia (o una parte de la secuencia) de un gen, esta secuencia se puede usar para mapear la localización del gen en un cromosoma. Este proceso se denomina mapeo cromosómico. Como consecuencia, las partes o fragmentos de las secuencias de nucleótidos de PD-L3 o VISTA descritas en la presente invención, se pueden usar para mapear la localización de los genes de PD-L3 o VISTA en un cromosoma. El mapeo de las secuencias de PD-L3 o VISTA en los cromosomas es un primer paso importante en la correlación de estas secuencias con genes asociados con la enfermedad. En resumen, los genes de PD-L3 o VISTA se pueden mapear en los cromosomas preparando cebadores de PCR (preferentemente de 15-25 pb de longitud) a partir de las secuencias de nucleótidos de PD-L3 o VISTA. El análisis informático de las secuencias de PD-L3 o VISTA se puede usar para predecir cebadores que no abarcan más de un exón en el ADN genómico, complicando así el proceso de amplificación. Estos cebadores se pueden usar después para la detección por PCR de híbridos de células somáticas que contienen cromosomas humanos individuales. Sólo aquellos híbridos que contienen el gen humano correspondiente a las secuencias de PD-L3 O VISTA rendirán un fragmento amplificado. Los híbridos de células somáticas se preparan fusionando células somáticas a partir de diferentes mamíferos (por ejemplo, células humanas y de ratón). Como los híbridos de células humanas y de ratón crecen y se dividen, pierden gradualmente los cromosomas humanos en un orden aleatorio, pero conservan los cromosomas de ratón. Usando medios en los que las células de ratón no pueden crecer, porque carecen de una enzima en particular, pero las células humanas pueden, se conservará el único cromosoma humano que contiene el gen que codifica la enzima necesaria. Usando diversos medios, se pueden establecer paneles de líneas celulares híbridas. Cada línea celular en un panel contiene ya sea un solo cromosoma humano o un pequeño número de cromosomas humanos, y un conjunto completo de cromosomas de ratón, lo que permite el fácil mapeo de genes individuales en cromosomas humanos específicos (D'Eustachio, P. y otros (1983) Science 220:919-924). Los híbridos de células somáticas que contienen sólo fragmentos de cromosomas humanos se pueden producir también usando cromosomas humanos con translocaciones y supresiones.

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U1

El mapeo por PCR de híbridos de células somáticas es un procedimiento rápido para asignar una secuencia en particular a un cromosoma en particular. Tres o más secuencias se pueden asignar por día usando un único termociclador. Usando las secuencias de nucleótidos de PD-L3 o VISTA para diseñar cebadores de oligonucleótidos, la sub-localización se puede lograr con paneles de fragmentos a partir de cromosomas específicos. Otras estrategias de mapeo que se pueden usar igualmente para mapear una secuencia de PD-L3 o VISTA en su cromosoma Incluyen la hibridación in situ (descrito en Fan, Y. y otros (1990) Proc Nati. Acad. Sci. USA. 87:6223-27), pre-tamizaje con los cromosomas marcados separados por flujo y preselección por hibridación a cromosomas específicos de bibliotecas de ADNc.

La hibridación in situ fluorescente (FISH) de una secuencia de ADN a una extensión de cromosomas en metafase se puede usar además para proporcionar una localización cromosómica precisa en una sola etapa.

Las extensiones de cromosomas se pueden preparar usando células cuya división se bloqueó en la metafase mediante un producto químico tal como colcemida que interrumpe el huso mitótico. Los cromosomas se pueden tratar brevemente con tripsina, y teñir después con Giemsa. Un patrón de bandas ciaras y oscuras se desarrolla en cada cromosoma, de manera que los cromosomas se pueden identificar individualmente. La técnica FISH se puede usar con una secuencia de ADN tan corta como 500 ó 600 bases. Sin embargo, los clones mayores de 1,000 bases tienen una mayor probabilidad de unirse a una localización cromosómica única con suficiente intensidad de señal para la detección sencilla. Preferentemente 1,000 bases, y con mayor preferencia 2,000 bases serán suficientes para conseguir buenos resultados en un tiempo razonable. Para una revisión de esta técnica, ver Verma y otros

Human Chromosomes: A Manual of basic techniques (Pergamon Press, Nueva

York 1988). Los reactivos para el mapeo de cromosomas se pueden usar individualmente para marcar un único cromosoma o un único sitio en ese cromosoma, o se pueden usar paneles de reactivos para marcar sitios múltiples y/o cromosomas múltiples. Los reactivos correspondientes a regiones no codificantes de los genes en realidad se prefieren para propósitos de mapeo. Las secuencias

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o

U1 codificantes son más probables que se conserven dentro de las familias de genes, aumentando así la posibilidad de hibridación cruzada durante el mapeo cromosómico.

Una vez que una secuencia se mapeó en una localización cromosómica precisa, la posición física de la secuencia en el cromosoma se puede correlacionar con los datos del mapa genético. En última instancia, la secuenciación completa de los genes a partir de varios individuos se puede realizar para confirmar la presencia de una mutación y para distinguir mutaciones de polimorfismos.

2. Tipificación de Tejido.

Las secuencias de PD-L3 o VISTA de la presente invención se pueden usar también para identificar a los individuos a partir de muestras biológicas diminutas. Además, las secuencias de la presente invención se pueden usar para proporcionar una técnica alternativa que determina la secuencia real de ADN base por base de las partes seleccionadas del genoma de un individuo. Así, las secuencias de nucleótidos de PD-L3 o VISTA descritas en la presente invención se pueden usar I.

para preparar dos cebadores de POR de los extremos 5' y 3' de las secuencias. Estos cebadores se pueden usar después para amplificar el ADN de un individuo y

L posteriormente la secuencia.

Los paneles de secuencias de ADN correspondientes a partir de individuos, preparados de esta manera, pueden proporcionar identificaciones únicas individuales, ya que cada individuo tendrá un conjunto único de dichas secuencias de ADN debido a diferencias alélicas. Las secuencias de la presente invención se pueden usar para obtener dichas secuencias de identificación a partir de individuos y a partir de tejido. Las secuencias de nucleótidos de PD-L3 o VISTA de la invención representan únicamente partes del genoma humano. La variación alélica ocurre en algún grado en las regiones codificantes de estas secuencias, y en mayor grado en las regiones no codificantes. Se estima que la variación alélica entre humanos individuales ocurre con una frecuencia de aproximadamente una vez por cada 500 bases. Cada una de las secuencias descritas en la presente invención se puede usar, en cierta medida, como un estándar contra el que el ADN de un individuo se puede comparar para propósitos de identificación. Debido a que los 127 £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL mayores números de polimorfismos ocurren en las regiones no codificantes, se necesitan menos secuencias para diferenciar individuos. Las secuencias no codificantes de sec. con núms. de ident.: 1 ó 4 cómodamente pueden proporcionar la identificación del individuo positivo con un panel de quizás 10 a 1,000 cebadores que rinde cada una de las secuencias amplificadas no codificantes de 100 bases. Si las secuencias codificantes predichas, se usan tales como aquellas de sec con núms. de ident.: 3 ó 6, un número más apropiado de cebádores para la identificación individual positiva sería 500-2000.

Si un panel de reactivos de secuencias de nucleótidos de PD-L3 o VISTA descritos en la presente invención se usa para generar una base de datos de identificación única para un individuo, esos mismos reactivos se pueden usar posteriormente para identificar el tejido de ese individuo. Usando la base de datos de identificación única, la identificación positiva del individuo vivo o muerto, se puede preparar a partir de muestras de tejido extremadamente pequeñas.

3. Uso de secuencias de PD-L3 o VISTA en la Biología Forense

Las técnicas de identificación basadas en ADN se pueden usar también en biqlogía forense. Las secuencias de la presente invención se pueden usar para proporcionar reactivos de polinucleótidos, por ejemplo, cebadores de PCR, dirigidos a loci específicos en el genoma humano, que pueden mejorar la fiabilidad de las identificaciones forenses basadas en ADN, por ejemplo, proporcionando otro marcador de identificación (es decir, otra secuencia de ADN que es única para un individuo en particular). Como se mencionó anteriormente, la información de la secuencia de bases real se puede usar para la identificación como una alternativa precisa para los patrones formados por los fragmentos generados mediante la enzima de restricción. Las secuencias dirigidas a regiones no codificantes de sec. con núms. de ident.: 1 ó 3 son particularmente apropiadas para este uso mientras ocurren mayores números de polimorfismos en las regiones no codificantes, haciéndolo más fácil para diferenciar individuos usando esta técnica. Los ejemplos de reactivos de polinucleótido incluyen las secuencias de nucleótidos de PD-L3 o VISTA o partes de éstos, por ejemplo, fragmentos derivados de las regiones no codificantes de sec. con núms. de ident.: 1 ó 3 que tienen una longitud de al menos 128 o

en £

IMPI o

U1 bases, preferentemente al menos 30 bases. Las secuencias de nucleótidos de PD-L3 o VISTA descritas en la presente invención se pueden usar además para proporcionar reactivos de polinucleótidos, por ejemplo, sondas marcadas o marcables que se pueden usar en, por ejemplo, una técnica de hibridación in situ, para identificar un tejido específico, por ejemplo, linfocitos. Esto puede ser muy útil en los casos donde un patólogo forense se presenta con un tejido de origen desconocido. Los paneles de dichas sondas de PD-L3 o VISTA se pueden usar para identificar el tejido por especie y/o por tipo de órgano. De manera similar, estos reactivos, por ejemplo cebadores o sondas de PD-L3 o VISTA se pueden usar para tamizar el cultivo de tejido para la contaminación (es decir, tamizar para la presencia de una mezcla de diferentes tipos de células en un cultivo).

C Medicina predictiva

La presente invención se corresponde también con el campo de la medicina predictiva, en el cual se usan los ensayos de diagnóstico, ensayos de pronóstico y monitorización de ensayos clínicos en los propósitos de pronóstico (predictivos) para tratar de ese modo profilácticamente a un individuo. Como consecuencia, un aspecto de la presente invención se relaciona con ensayos de diagnóstico para determinar la expresión del polipéptido y/o del ácido nucleico de PD-L3 o VISTA así como la actividad de PD-L3 o VISTA, en el contexto de una muestra biológica (por ejemplo, sangre, suero, células o tejido) para determinar de ese modo si un individuo está aquejado de una enfermedad o trastorno, o está en riesgo de desarrollar un trastorno, asociado con la expresión o actividad aberrante o no deseada de PD-L3 o VISTA. La invención proporciona también ensayos de pronóstico (o predictivos) para determinar si un individuo está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con la expresión o actividad del ácido nucleico, polipéptido de PD-L3 o VISTA. Por ejemplo, las mutaciones en un gen de PD-L3 o VISTA se pueden ensayar en una muestra biológica. Dichos ensayos se pueden usar para propósitos de pronóstico o predictivo para tratar de ese modo profilácticamente a un individuo antes de la aparición de un trastorno caracterizado por o asociado con la expresión o actividad del ácido nucleico, polipéptido de PDL3 o VISTA.

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Otro aspecto de la invención se corresponde con el monitoreo de la influencia de los agentes (por ejemplo, fármacos, compuestos) sobre la expresión o actividad de PD-L3 o VISTA en ensayos clínicos. Estos y otros agentes se describen con más detalle en las siguientes secciones.

1. Ensayos de Diagnóstico

Un método ilustrativo para detectar la presencia o ausencia del polipéptido o ácido nucleico de PD-L3 o VISTA en una muestra biológica involucra obtener una muestra biológica de un individuo de prueba y contactar la muestra biológica con un compuesto o un agente capaz de detectar el ácido nucleico o polipéptido de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, ARNm o ADN genómico) que codifica el polipéptido de PDL3 o VISTA tal que la presencia de ácido nucleico o polipéptido de PD-L3 o VISTA se detecta en la muestra biológica. Un agente preferido para detectar ARNm o ADN genómico de PD-L3 o VISTA es una sonda marcada de ácido nucleico capaz de hibridarse con ARNm o ADN genómico de PD-L3 o VISTA. La sonda de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, el conjunto de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA establecido en la sec. con núms. de ident: 1, ó 3, o una parte de éste tal como un oligonucleótido de al menos 15, 30, 50, 100, 250 ó 500 nucleótidos de longitud y suficiente para hibridar específicamente bajo condiciones rigurosas ARNm o ADN genómico de PD-L3 o VISTA. Otras sondas adecuadas para uso en los ensayos de diagnóstico de la invención se describen en la presente invención. Un agente preferido para detectar el polipéptido de PD-L3 o VISTA es un anticuerpo capaz de unirse al polipéptido de PD-L3 o VISTA preferentemente un anticuerpo con un marcador detectable. Los anticuerpos pueden ser peticiónales, o con mayor preferencia, monoclonales. Un anticuerpo intacto, o un fragmento de éste (por ejemplo, Fab o F(ab’)2) se pueden usar. El término marcado”, con respecto a la sonda o anticuerpo, pretende incluir el mareaje directo de la sonda o anticuerpo acoplando (es decir, enlazando físicamente) una sustancia detectable a la sonda o anticuerpo, así como el mareaje indirecto de la sonda o anticuerpo mediante reactividad con otro reactivo que se marea directamente. Los ejemplos de mareaje indirecto incluyen la detección de un anticuerpo primario usando un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia y una sonda de ADN marcada al final con

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U1 biotina do manera que se puede detectar con estreptavidina marcada con fluorescencia. El término muestra biológica pretende incluir tejidos, células y fluidos biológicos aislados de un individuo, así como tejidos, células y fluidos presentes dentro de un individuo. Es decir, el método de detección de la invención se puede usar para detectar ARNm, polipéptido, o ADN genómico de PD-L3

VISTA, en una muestra biológica in vitro así como in vivo. Por ejemplo, las técnicas in vitro para la detección de ARNm de PD-L2 incluyen hibridaciones de tipo

Northern e hibridaciones in situ. Las técnicas in vitro para la detección de polipéptido de PD-L3 o VISTA incluyen ensayos inmunoabsorbentes ligados enzimas (ELISA), inmunoelectrotransferencias, inmunoprecipitaciones ínmunofluorescencia. Las técnicas in vitro para la detección de ADN genómico de PD-L3 o VISTA incluyen hibridaciones de tipo Southern. Además, las técnicas in vivo para la detección de polipéptido de PD-L3 o VISTA incluyen la introducción de un anticuerpo marcado anti-PD-L3 o VISTA en un individuo. Por ejemplo, el anticuerpo se puede marcar con un marcador radiactivo cuya presencia y localización en un individuo se puede detectar por técnicas de imagen estándares. En una modalidad, la muestra biológica contiene moléculas de polipéptido del individuo de prueba. Como alternativa, la muestra biológica puede contener moléculas de ARNm del individuo de prueba o moléculas de ADN genómico del individuo de prueba. Una muestra biológica preferida es una muestra de suero aislada de un individuo por medios convencionales. En otra modalidad, los métodos involucran además obtener una muestra biológica control de un individuo control, contactar la muestra control con un compuesto o agente capaz de detectar polipéptido, ARNm, o ADN genómico de PD-L3 o VISTA, tal que la presencia de polipéptido, ARNm, o ADN genómico de PD-L3 o VISTA se detecta en la muestra biológica, y comparar la presencia de polipéptido, ARNm, o ADN genómico de PDL3 o VISTA en la muestra control con la presencia de polipéptido, ARNm o ADN genómico de PD-L3 o VISTA en la muestra de prueba.

La invención incluye también estuches para detectar la presencia de PD-L3 o VISTA en una muestra biológica. Por ejemplo, el estuche puede comprender un compuesto marcado o agente capaz de detectar el polipéptido o ARNm de PD-L3

131

IMPI ω

VISTA en una muestra biológica; medios para determinar la cantidad de PD-L3 o VISTA en la muestra, y medios para comparar con un estándar la cantidad de PDL3 o VISTA en la muestra. El compuesto o agente se puede envasar en un recipiente adecuado. El estuche además puede comprender instrucciones para el uso del estuche que detecta polipéptido o ácido nucleico de PD-L3 o VISTA.

2. Ensayos de pronóstico

Los métodos de diagnóstico descritos en la presente invención además, se pueden utilizar para identificar individuos que tienen o están en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o no deseada de PD-L3 o VISTA. Como se usa en este documento, el término aberrante incluye una expresión o actividad de PD-L3 o VISTA que se desvía de la expresión o actividad de PD-L3 o VISTA de tipo salvaje. La expresión o actividad aberrante incluye la expresión o actividad aumentada o disminuida, así como la expresión o actividad que no sigue el patrón de desarrollo de la expresión de tipo salvaje o el patrón de expresión sub-celular. Por ejemplo, la expresión o actividad aberrante de PD-L3 o VISTA pretende incluir los casos en los que una mutación en el gen de PD-L3 o VISTA causa que el gen de PD-L3 o VISTA sea insuficientemente expresado o sobre-expresado y situaciones en las que dichas mutaciones resultan en un polipéptido no-funcional de PD-L3 o VISTA o un polipéptido que no funciona en forma de tipo salvaje, por ejemplo, un polipéptido que no interactúa con una pareja de unión de PD-L3 o VISTA, o uno que interactúa con una pareja de unión no-PD-L3 o VISTA. Como se usa en este documento, el término no deseado incluye un fenómeno no deseado que se involucra en una respuesta biológica tal como la activación de la célula inmune. Por ejemplo, el término no deseado incluye una expresión o actividad de PD-L3 o VISTA que no es deseable en un individuo.

Los ensayos descritos en la presente invención, tales como los ensayos de diagnóstico precedentes o los siguientes ensayos, se pueden utilizar para identificar un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar un trastorno asociado con una regulación defectuosa en la actividad del polipéptido o la expresión del ácido nucleico de PD-L3 o VISTA tal como un trastorno autoinmune, un trastorno de 132 o

σι £

IMPI o

U1 inmunodeficiencia, un trastorno del sistema inmunológico, tales como autoinmunidad, trastorno alérgico o inflamatorio o cáncer. Así, la presente invención proporciona un método para identificar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o no deseada de PD-L3 o VISTA en el que una muestra de prueba se obtiene de un individuo y el polipéptido o ácido nucleico de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, ARNm o ADN genómico) se detecta en donde la presencia de polipéptido o ácido nucleico de PD-L3 o VISTA es diagnóstico para un individuo que tiene o está en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o no deseada de PD-L3 o VISTA. Como se usa en la presente descripción, una muestra de prueba se refiere a una muestra biológica obtenida de un individuo de interés. Por ejemplo, una muestra de prueba puede ser un fluido biológico (por ejemplo, líquido cefalorraquídeo o suero), muestra celular, o tejido.

Además, los ensayos de pronóstico descritos en la presente invención se pueden usar para determinar si a un individuo se le puede administrar un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, peptidomimético, polipéptido, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro fármaco-candidato) para tratar una enfermedad o trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o no deseada PD-L3 o VISTA. Por ejemplo, dichos métodos se pueden usar para determinar si un individuo se puede tratar eficazmente con un agente para un trastorno autoinmune, trastorno de inmunodeficiencia, cáncer del sistema inmune, o trastorno alérgico o inflamatorio. Así, la presente invención proporciona los métodos para determinar si un individuo se puede tratar eficazmente con un agente para un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o no deseada de PDL-3 o VISTA en los que se obtiene una muestra de prueba y se detecta la expresión o actividad del polipéptido o ácido nucleico de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, en donde la abundancia de expresión o actividad del polipéptido o ácido nucleico de PD-L3 o VISTA se diagnóstica para un individuo que se le puede administrar el agente para tratar un trastorno asociado con la expresión o actividad aberrante o no deseada de PD-L3 o VISTA). Los métodos de la invención se pueden usar también para detectar alteraciones genéticas en un gen de PD-L3 o VISTA, determinando de ese

133

IMPI modo si un individuo con el gen alterado está en riesgo de un trastorno caracterizado por la regulación defectuosa en la actividad del polipéptido o la expresión del ácido nucleico de PD-L3 o VISTA, tales como un trastorno autoinmune, un trastorno de inmunodeficiencia, un cáncer del sistema inmune, un trastorno alérgico, o un trastorno inflamatorio. Los métodos descritos en la presente invención se pueden llevar a cabo, por ejemplo, mediante la utilización de estuches de diagnóstico pre-envasados que comprenden al menos un reactivo de anticuerpo o sonda de ácido nucleico descritos en la presente invención, que se pueden usar r convenientemente, por ejemplo, en prácticas clínicas para diagnosticar los pacientes que presentan síntomas o antecedentes familiares de una enfermedad o una dolencia que involucra un gen de PD-L3 o VISTA. Además, cualquier tipo de célula o tejido en la que se expresa PD-L3 o VISTA se puede utilizar en los ensayos de pronóstico descritos en la presente invención.

3. Mon¡toreo de los efectos durante los ensayos clínicos

El monitoreo de la influencia de agentes (por ejemplo, fármacos) sobre la expresión o actividad de un polipéptido de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, la modulación de la proliferación celular y/o migración) se puede aplicar no sólo en el tamizaje básico de fármacos, sino también en los ensayos clínicos. Por ejemplo, la eficacia de un agente determinado por un ensayo de tamizaje como se describe en la presente invención para aumentar la expresión génica, niveles de polipéptido de PD-L3 o VISTA, o actividad regulada positivamente de PD-L3 o VISTA, se puede monitorear en los ensayos clínicos de individuos que presentan disminuidos la expresión génica, niveles de polipéptido de PD-L3 o VISTA, o actividad regulada negativamente de PD-L3 o VISTA. Como alternativa, la eficacia de un agente determinado por un ensayo de tamizaje para disminuir la expresión génica, niveles de polipéptidos de PD-L3 o VISTA, o actividad regulada negativamente de PD-L3 o VISTA, se puede monitorear en los ensayos clínicos de individuos que presentan aumentadas la expresión génica, niveles de polipéptidos de PDL-3 o VISTA, o actividad de PD-L3 o VISTA. Como se señaló PD-L3 o VISTA se expresa en

I muchos tipos de células hematopoyéticas, que incluyen las APC (macrófagos y células dendríticas mieloides), y células T CD4+, y más específicamente se expresa w

o en

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W g en en las DC CD11c⁺, células T CD4⁺ (incluyendo tanto las células T efectoras Foxp3' y nTregs Foxp3⁺), células T CD8⁺, y granulocitos Gri+, y se expresa en niveles bajos en células B y células NK. En dichos ensayos clínicos, la expresión o actividad de un gen de PD-L3 o VISTA, y preferentemente, otros genes que se involucraron en, por ejemplo, un trastorno asociado a PD-L3 o VISTA se puede usar como una lectura o marcador del fenotipo de una célula en particular.

Por ejemplo, y no a modo de limitación, se pueden identificar los genes, incluyendo los de PDL-3 o VISTA, que se modulan en las células mediante el tratamiento con un agente (por ejemplo, compuesto, fármaco o molécula pequeña) que modula la actividad de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, identificada en un ensayo de tamizaje como se describe en la presente invención). Así, para estudiar el efecto de los agentes en los trastornos asociados con PD-L3 o VISTA, por ejemplo, en un ensayo clínico, las células se pueden aislar y preparar y analizar el ARN para los niveles de expresión de PD-L3 o VISTA y otros genes involucrados en el trastorno asociado con PD-L3 o VISTA respectivamente. Los niveles de expresión génica

I (por ejemplo, un patrón de expresión génica) se puede cuantificar por análisis de membrana tipo Northern o RT-PCR, como se describe en la presente invención, o como alternativa midiendo la cantidad de polipéptido producido, por uno de los métodos como se describe en la presente invención, o midiendo los niveles de actividad de PD-L3 o VISTA o de otros genes. De este modo, el patrón de expresión génica puede servir como un marcador, indicativo de la respuesta fisiológica de las células al agente. En consecuencia, este estado de respuesta se puede determinar antes, y en diversos puntos durante el tratamiento del individuo con el agente. En una modalidad preferida, la presente invención proporciona un método para monitorear la eficacia del tratamiento de un individuo con un agente (por ejemplo, un agonista, antagonista, péptido mimético, polipéptido, péptido, ácido nucleico, molécula pequeña, u otro candidato del fármaco identificado por los ensayos de tamizaje descritos en la presente invención) incluyendo las etapas de (i) obtener una muestra previa de un individuo antes de la administración del agente; (¡i) detectar el nivel de expresión de un polipéptido, ARNm o ADN genómico de PD-L3 o VISTA en la muestra previo a la administración; (iii) obtener una o más

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g

U1 muestras del individuo posterior a la administración; (iv) detectar posterior a ia administración el nivel de expresión o actividad de polipéptido, ARNm o ADN genómico de PD-L3 o VISTA en las muestras; (v) comparar el nivel de expresión o actividad del polipéptido, ARNm, o ADN genómico de PD-L3 o VISTA de la muestra previo a la administración con el posterior a la administración de polipéptido, ARNm o ADN genómico de PD-L3 o VISTA en la muestra o muestras, y (vi) alterar en consecuencia, la administración del agente al individuo. Por ejemplo, se puede desear la administración aumentada del agente para aumentar la expresión o actividad de PD-L3 o VISTA hasta niveles más altos que los detectados, es decir, para aumentar la eficacia del agente. Como alternativa, se puede desear la administración disminuida del agente para disminuir la expresión o actividad de PDL3 o VISTA hasta los niveles más bajos que los detectados, es decir, para disminuir la eficacia del agente. De acuerdo con una modalidad, la expresión o actividad de PD-L3 o VISTA se puede usar como un indicador de la eficacia de un agente, incluso en ia ausencia de una respuesta fenotípica observable.

D. Métodos de Tratamiento

La presente invención proporciona los métodos tanto profilácticos como terapéuticos para tratar a un individuo en riesgo de (o susceptible a) un trastorno caracterizado por insuficiente o excesiva producción de proteína PD-L3 o VISTA o producción de formas de proteínas PD-L3 o VISTA que tienen actividad aberrante o disminuida en comparación con la proteína de tipo salvaje de PD-L3 o VISTA. Además, los anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA de la invención se pueden usar para detectar y aislar proteínas PD-L3 o VISTA, regular la biodisponibilidad de las proteínas PD-L3 o VISTA, y modular la actividad de PD-L3 o VISTA por ejemplo, modulando la interacción de PD-L3 o VISTA con su contra receptor.

1. Métodos profilácticos

En un aspecto, la invención proporciona un método para prevenir en un individuo, una enfermedad o afección asociada con una expresión o actividad aberrante o no deseada de PD-L3 o VISTA, suministrando al individuo un polipéptido de PD-L3 o VISTA o un agente que modula la expresión de PD-L3 o VISTA o al menos una actividad de PD-L3 o VISTA. Los individuos en riesgo de 136 £

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL una enfermedad o trastorno que se causa o contribuye por la expresión o actividad aberrante o no deseada de PD-L3 o VISTA se pueden identificar mediante, por ejemplo, cualquiera o una combinación de ensayos de diagnóstico o pronóstico como se describe en la presente invención. La administración de un agente profiláctico puede ocurrir antes de la manifestación de los síntomas característicos de la aberración de PD-L3 o VISTA, tal que se impide una enfermedad o trastorno o, como alternativa, se retrasa en su progresión. Dependiendo del tipo de la aberración de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, un polipéptido de PD-L3 o VISTA, agonista de PD-L3 o VISTA o agente antagonista de PD-L3 o VISTA (por ejemplo, un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA) se puede usar para tratar al individuo. El agente apropiado se puede determinar en función de los ensayos de tamizaje descritos en la presente invención.

2. Métodos terapéuticos

Un aspecto importante de la invención se corresponde con los métodos para modular la expresión o actividad o interacción de PDL-3 o VISTA con sus parejas de unión natural. Con relación a la terapia de PD-L3 o VISTA se demostró inhibir la co-estimulación de CD28, inhibir la activación de TCR de las células inmunes, inhibir la proliferación de las células inmunes activadas (células T CD4+ y CD8+), inhibir la producción de citoquinas por las células T (IL-2, interferón gamma) y transmitir una señal inhibidora a las células inmunes. Como consecuencia, la expresión y/o actividad de PD-L3 o VISTA, así como se puede modular la interacción entre PD-L3 o VISTA y su(s) pareja(s) de unión en las células T para modular la respuesta inmune. Debido a que PD-L3 o VISTA se une a receptores inhibidores (en las células T), la regulación positiva de la actividad de PD-L3 o VISTA debe resultar en la regulación negativa de la respuesta inmune, mientras que la regulación negativa de la actividad de PD-L3 o VISTA debe resultar en la regulación positiva de respuestas inmunes. En una modalidad preferida, PD-L3 o VISTA se une a los receptores inhibidores. Como se señaló anteriormente, contrario a lo esperado los anticuerpos específicos contra PD-L3 o VISTA producidos por el solicitante en que in vitro (en presencia de PD-L3 o VISTA-lg) mejoran las actividades de supresión de las proteínas de fusión de PD-L3 o VISTAo

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o

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Ig (es decir, estos anticuerpos mejoran las actividades relacionadas con la supresión de PDL-3 o VISTA tales como los efectos de PD-L3 o VISTA en la producción de citoquinas, proliferación de células T, diferenciación o activación y otras funciones como se señalaron anteriormente), se comportan de manera opuesta a lo que se esperaría in vivo, es decir, se encontró que estos anticuerpos son inmunosupresores in vivo.

Los métodos moduladores de la invención involucran contactar una célula con un polipéptido o agente de PD-L3 o VISTA que modula una o más de las actividades de actividad del polipéptido de PD-L3 o VISTA asociado con la célula, por ejemplo, un agente que modula la expresión o actividad de PD-L3 o VISTA y/o modula la interacción de PD-L3 o VISTA y su(s) pareja(s) de unión natural. Un agente que modula la actividad del polipéptido de PD-L3 o VISTA puede ser un agente como se describe en la presente invención, tal como un ácido nucleico o un polipéptido, una pareja de unión de origen natural de un polipéptido de PD-L3 o VISTA, un anticuerpo de PD-L3 o VISTA, un agonista o antagonista de PD-L3 O VISTA, un peptidomimético de un agonista o antagonista de PD-L3 o VISTA, un peptidomimético de PD-L3 o VISTA u otra molécula pequeña. Las formas solubles de PD-L3 o VISTA se pueden usar también para interferir con la unión de PD-L3 o VISTA a cualquiera de sus parejas o ligandos de unión natural.

Un agente que modula la expresión de PD-L3 o VISTA es, por ejemplo, una molécula de ácido nucleico antisentido, oligonucleótido triple, ribozimas, o vector recombinante para ia expresión de un polipéptido de PD-L3 o VISTA. Por ejemplo se puede sintetizar un oligonucleótido complementario al área alrededor del sitio de iniciación de la traducción del polipéptido de PD-L3 o VISTA. Uno o más oligonucleótidos antisentido se pueden adicionar al medio celular, típicamente a 200 pg/ml, o administrar a un paciente para impedir la síntesis de un polipéptido de PD-L3 o VISTA. El oligonucleótido antísentido se absorbe por las células e híbrida con un ARNm de PD-L3 o VISTA para impedir la traducción. Como alternativa, se puede usar un oligonucleótido que se une al ADN de doble cadena para formar un constructo triple que impide el desenrollamiento y transcripción del ADN. Como resultado de uno u otro, se bloquea la síntesis del polipéptido de PD-L3 o VISTA.

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Cuando la expresión de PD-L3 o VISTA se modula preferentemente, dicha modulación ocurre de una manera diferente a la anulación del gen de PD-L3 o

VISTA.

Los agentes que modulan la expresión, por virtud del hecho de que controlan la cantidad de PD-L3 o VISTA en una célula, también modulan la cantidad total de actividad de PD-L3 o VISTA en una célula. En una modalidad, el agente que modula el PD-L3 o VISTA estimula una o más actividades de PD-L3 o VISTA. Los ejemplos de dichos agentes estimuladores incluyen polipéptido activo de PD-L3 o VISTA y una molécula de ácido nucleico que codifica PD-L3 o VISTA que se introdujo en la célula. En otra modalidad, el agente inhibe una o más actividades de PD-L3 o VISTA. Los ejemplos de dichos agentes inhibidores incluyen moléculas de ácido nucleico antisentido de PD-L3 o VISTA, anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA, inhibidores de PD-L3 o VISTA, y los compuestos identificados en los ensayos de tamízaje de individuos. En una modalidad preferida adicional, un agente inhibidor es una combinación de un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA y un anticuerpo anti-PDL1 o anti-PD-L2. Estos métodos moduladores se pueden realizar in vitro (por ejemplo, contactando la célula con el agente) o, como alternativa, contactando in vivo un agente con las células (por ejemplo, administrando el agente a un individuo). Como tal, la presente invención proporciona métodos de tratamiento de un individuo aquejado de una afección o trastorno que se beneficia de la modulación positiva o negativa de un polipéptido de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, un trastorno caracterizado por la expresión o actividad no deseada, insuficiente o aberrante de un polipéptido o molécula de ácido nucleico de PD-L3 o VISTA. En una modalidad, el método involucra administrar un agente (por ejemplo, un agente identificado por un ensayo de tamizaje descrito en la presente invención), o combinación de agentes que modulan (por ejemplo, regulan positivamente o regulan negativamente) la expresión o actividad de PD-L3 o VISTA. En otra modalidad, el método involucra administrar un polipéptido o molécula de ácido nucleico de PDL3 o VISTA como terapia para compensar la expresión o actividad reducida, aberrante, o no deseada de PD-L3 o VISTA.

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U1

Las enfermedades del individuo que se pueden tratar con los agentes de unión de PD-L3 o VISTA se identifican anteriormente e incluyen diversos trastornos inflamatorios, autoinmunes, cancerosos, alérgicos e infecciosos. Una indicación preferida en particular es la esclerosis múltiple.

La estimulación de la actividad de PD-L3 o VISTA es deseable en situaciones en las que PD-L3 o VISTA se regula negativamente de modo anormal y/o en los que la actividad aumentada de PD-L3 o VISTA es probable que tenga un efecto beneficioso. Del mismo modo, la inhibición de la actividad de PD-L3 o VISTA es deseable en situaciones en las que la PD-L3 o VISTA se regula positivamente de modo anormal y/o en el que la actividad disminuida de PD-L3 o VISTA es probable que tenga un efecto beneficioso. Los agentes ilustrativos para el uso en la modulación negativa de PD-L3 o VISTA (es decir, antagonistas de PD-L3 o VÍSTA) incluyen, por ejemplo, moléculas de ácidos nucleicos antisentido, anticuerpos que reconocen y bloquean PD-L3 o VISTA, combinaciones de anticuerpos que reconocen y bloquean PD-L3 o VISTA y anticuerpos que reconocen y bloquean contra receptores de PD-L3 o VISTA, y compuestos que bloquean la interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión de origen natural en una célula inmune (por ejemplo, moléculas monovalente solubles, de PD-L3 o VISTA; formas solubles de moléculas de PD-L3 o VISTA que no se unen a los receptores Fe en las células presentadoras de antígeno; formas solubles de parejas de unión de PD-L3 o VISTA; y compuestos identificados en los ensayos de tamizaje del individuo). Los agentes ilustrativos para el uso en la modulación positiva de PD-L3 o VISTA (es decir, agonistas de PD-L3 o VISTA) incluyen, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que codifican polipéptidos de PD-L3 o VISTA, formas multivalentes de PDL3 o VISTA, compuestos que aumentan la expresión de PDL3 o VISTA, compuestos que mejoran la interacción de la PD-L3 o VISTA con sus parejas de unión de origen natural y las células que expresan PD-L3 o VISTA.

3. Regulación negativa de las respuestas inmunes

Existen numerosas modalidades de la invención para la regulación positiva de la función inhibidora de un polipéptido de PD-L3 o VISTA para de ese modo regular negativamente las respuestas inmunes. La regulación negativa puede ser 140 £

IMPI o

en en forma de inhibir o bloquear una respuesta inmune ya en progreso, o puede involucrar que se impida la inducción de una respuesta inmune. Las funciones de las células inmunes activadas se pueden inhibir regulando negativamente las respuestas celulares inmunes o induciendo anergia específica en las células inmunes, o ambas. Por ejemplo, en modalidades en donde PD-L3 o VISTA se une a un receptor inhibitorio, formas de PD-L3 o VISTA que se unen al receptor inhibidor, por ejemplo, PD-L3 o VISTA multivalente en una superficie celular, se pueden usar para modular negativamente la respuesta inmune. En una modalidad de la invención, un anticuerpo de activación usado para estimular la actividad de PD-L3 o VISTA es un anticuerpo biespecífico. Por ejemplo, dicho anticuerpo puede comprender un sitio de unión a PD-L3 o VISTA y otro sitio de unión que se dirige a un receptor de superficie celular en una célula inmune, por ejemplo, una célula T, una célula B o una célula mieloide. En una modalidad, dicho anticuerpo, además de que comprende un sitio de unión de PD-L3 o VISTA, puede comprender además un sitio de unión que se une a un receptor de antígeno de células B, un receptor de antígeno de células T, o un receptor de Fe, para dirigir la molécula a una población celular específica. La selección de este segundo antígeno para el anticuerpo biespecífico proporciona flexibilidad en la selección de la población celular que se dirige a la inhibición. Los agentes que promueven una actividad de PD-L3 o VISTA que mejoran la interacción de PD-L3 o VISTA con sus parejas de unión natural (por ejemplo, anticuerpos de activación de PD-L3 o VISTA o moléculas pequeñas de activación de PD-L3 o VISTA) se pueden identificar por su capacidad para inhibir la proliferación de células inmunes y/o función efectora, o para inducir anergia cuando se adicionan a un ensayo in vitro. Por ejemplo, las células se pueden cultivar en la presencia de un agente que estimula la señal de transducción a través de un receptor de activación. Un número de lecturas reconocidas en la técnica de activación de la célula se pueden emplear para medir, por ejemplo, la proliferación celular o función efectora (por ejemplo, producción de anticuerpos, producción de citoquinas, fagocitosis) en la presencia del agente de activación. La capacidad de un agente de prueba para bloquear esta activación se puede determinar fácilmente midiendo la capacidad del agente para llevar a cabo una disminución en la proliferación o la función efectora que se mide. En una 141

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U1 modalidad, a concentraciones bajas de antígeno, las interacciones de las células inmunes con PD-L3 o VISTA inhiben fuerte las señales de B7-CD28. En otra modalidad, a concentraciones altas de antígeno, las interacciones de las células inmunes con PD-L3 o VISTA pueden reducir la producción de citoquinas, pero no inhibir la proliferación de células T. En consecuencia, la capacidad de un compuesto de prueba para bloquear la activación se puede determinar midiendo la producción de citoquinas y/o la proliferación a diferentes concentraciones de antígeno.

En una modalidad de la invención, se induce tolerancia contra antígenos específicos por co-administración de un antígeno con un agonista de PD-L3 o VISTA. Por ejemplo, la tolerancia se puede ser inducir a polipéptidos específicos. En una modalidad, se pueden inhibir las respuestas inmunes a los alérgenos o polipéptidos extraños a los que una respuesta inmune no es deseable. Por ejemplo, los pacientes que reciben Factor VIII generan con frecuencia anticuerpos contra este factor de coagulación. La co-administración de un agente que estimula la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción con su(s) pareja(s) de unión natural, con el factor VIII recombinante (o uniendo físicamente PD-L3 o VISTA a Factor VIII, por ejemplo, mediante entrecruzamiento) puede resultar en la modulación negativa de la respuesta inmune.

En una modalidad, un agonista de PD-L3 o VISTA y otro agente que puede bloquear la actividad de los receptores co-estimuladores en una célula inmune se puede usar para modular negativamente las respuestas inmunes. Las moléculas ilustrativas incluyen: formas agonistas de otros ligandos PD, formas solubles de CTLA-4, anticuerpos anti-B7-1, anticuerpos anti-B7-2, o combinaciones de éstos. Como alternativa, dos péptidos separados (por ejemplo, un polipéptido de PD-L3 o VISTA con formas de polipéptidos que bloquean B7-2 y/o B7-1), o una combinación de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos de activación contra un polipéptido de PDL3 o VISTA con anticuerpos monoclonales que bloquean anti-B7-2 y/o anti-B7-1) se puede combinar como una composición única o administrar por separado (simultáneamente o secuencialmente) para regular negativamente las respuestas inmunes mediadas por células inmunes en un individuo. Además, una cantidad

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U1 terapéuticamente activa de uno o más péptidos que tienen una actividad de polipéptido de PD-L3 o VISTA, además de uno o más polipéptidos que tienen B7-1 y/o actividad de B7-1, se pueden usar junto con otros reactivos que modulan negativamente para influir en las respuestas inmunes. Los ejemplos de otros reactivos que modulan negativamente incluyen anticuerpos que bloquean una señal co-estimuladora (por ejemplo, contra CD28 o ICOS), anticuerpos que activan una señal inhibitoria a través de CTLA4 y anticuerpos contra otros marcadores de células Inmunes (por ejemplo, contra CD40, ligando de CD40, o citoquinas) proteínas de fusión (por ejemplo, CTLA4-Fc o PD-1-Fc), y fármacos inmunosupresores (por ejemplo, rapamicina, ciclosporina A, o FK506). Los polipéptidos de PD-L3 o VISTA pueden ser útiles también en la construcción de agentes terapéuticos que bloquean la función celular inmune por la destrucción de las células. Por ejemplo, las partes de un polipéptido de PD-L3 o VISTA se pueden enlazar a una toxina para preparar un agente citotóxico capaz de desencadenar la destrucción de las células a la que se une.

Para preparar agentes citotóxicos, los polipéptidos de la invención se pueden enlazar, o unir operativamente, a las toxinas usando procedimientos que se conocen en la técnica. Una amplia variedad de toxinas se conocen que se pueden conjugar a los polipéptidos o anticuerpos de la invención. Los ejemplos incluyen: toxinas derivadas de numerosas plantas útiles, hongos o incluso bacterias, que, a modo de ejemplo, incluyen: diversas toxinas de cadena A en particular de la cadena A de ricina; proteínas de inactivación de ribosomas tales como saporina o gelonina; alfa-sarcina; aspergilina; restrictocina, y ribonucleasas tales como ribonucleasa placental, angiogénica, toxina de la difteria, o exotoxina de pseudomonas. Una región preferida de toxina para usar en relación con la invención, la cadena A desglicosilada, es la cadena A de la toxina que se trató para modificar o eliminar los residuos de carbohidratos. (Patente de Estados Unidos núm. 5,776,427).

La infusión de uno o una combinación de dichos agentes citotóxicos (por ejemplo, PD-L3 o VISTA-ricina (sólo o en combinación con PD-L1-ricina), en un paciente puede resultar en la muerte de las células inmunes, en particular a

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IMPI consecuencia del hecho de que las células inmunes activadas expresan cantidades más altas de parejas de unión de PD-L3 o VISTA. Por ejemplo, debido a que PD-1 se induce en la superficie de los linfocitos activados, un polipéptido de PD-L3 o VISTA se puede usar para dirigir el agotamiento de estas células específicas por mecanismos dependientes de Fc-R o por ablación conjugando un fármaco citotóxico (por ejemplo, ricina, saporina, o caliqueamicina) al polipéptido de PD-L3 o VISTA. En una otra modalidad, la toxina se puede conjugar con un anticuerpo antiPD-L3 o VISTA para tener como meta la muerte de la célula presentadora de antígeno que expresa PD-L3 o VISTA. En una modalidad adicional, PD-L3 o VISTA-anticuerpo-toxina puede ser un anticuerpo biespecífico. Dichos anticuerpos biespecíficos son útiles para dirigir una población celular específica, por ejemplo, usando un marcador que sólo se encuentra en un determinado tipo de célula, por ejemplo, linfocitos B, monocitos, células dendríticas, o células de Langerhans. Las respuestas inmunes que regulan negativamente mediante la activación de la Actividad de PD-L3 o VISTA o la interacción de la célula inmune con PDL3 o VISTA (y así estimular la función de señalización negativa de PD-L3 o VISTA) es útil en la modulación negativa de la respuesta inmune, por ejemplo, en situaciones de trasplante de tejido, piel y órganos, en la enfermedad del injerto contra el huésped (GVHD), o alergias, o en enfermedades autoinmunes tales como lupus eritematoso sistémico y esclerosis múltiple. Por ejemplo, el bloqueo de la función de células inmunes resulta en la destrucción reducida del tejido en el trasplante de tejido. Típicamente, en los trasplantes de tejidos, el rechazo del trasplante se inicia a través de su reconocimiento como extraño por las células inmunes, seguido por una reacción inmune que destruye el trasplante. La administración de una molécula que promueve la actividad de PD-L3 o VISTA, o la interacción de la PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural, puede inhibir la generación de una señal coestimuladora en las células inmunes (tal como una forma soluble, multimérica de un polipéptido de PD-L3 o VISTA) sólo o junto con otro agente modulador negativo antes o en el momento del trasplante. Además, la promoción de la actividad de PDL3 o VISTA puede ser suficiente también para anergizar las células inmunes, induciendo de ese modo tolerancia en un individuo.

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en

Para lograr inmunosupresión o tolerancia suficiente en un individuo, se puede desear también bloquear la función co-estimuladora de otras moléculas. Por ejemplo, se puede desear bloquear la función de B7-1 y B7-2 administrando una forma soluble de una combinación de péptidos que tienen una actividad de cada uno de estos antígenos o bloqueando anticuerpos contra estos antígenos (separadamente o juntos en una composición única) antes o en el momento del trasplante. Como alternativa, puede ser deseable para promover la actividad inhibitoria de PD-L3 o VISTA e inhibir una actividad co-estimuladora de B7-1 y/o B7-2. Otros agentes moduladores negativos que se pueden usar en conexión con los métodos moduladores negativos de la invención incluyen, por ejemplo, agentes que transmiten una señal inhibidora a través de CTLA4, formas solubles de CTLA4, anticuerpos que activan una señal inhibidora a través de CTLA4, anticuerpos de bloqueo contra otros marcadores de células inmunes, o formas solubles de otros pares de ligando receptor (por ejemplo, agentes que alteran la interacción entre CD40 y ligando de CD40 (por ejemplo, ligando anticuerpos anti-CD40)), anticuerpos contra citoquinas, o fármacos inmunosupresores. Por ejemplo, la actividad de activación de PD-L3 o VISTA o la interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural, es útil en el tratamiento de la enfermedad autoinmune. Muchos trastornos autoinmunes son el resultado de la activación no apropiada de las células inmunes que son reactivas contra el propio tejido y que promueven la producción de citoquinas y autoanticuerpos involucrados en la patología de las enfermedades. La prevención de la activación de células inmunes autorreactivas puede reducir o eliminar los síntomas de la enfermedad. La administración de agentes que promueven la actividad de PD-L3 o VISTA o la interacción de PD-.L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural, puede inducir tolerancia antígeno-específica de células inmunes autorreactivas que podría conducir a largo plazo al alivio de la enfermedad. Además, la co-administración de agentes que bloquean la co-estimulación de las células inmunes alterando las interacciones receptor-ligando de moléculas B7 con receptores co-estimuladores puede ser útil en inhibir la activación de células inmunes para impedir la producción de autoanticuerpos o citoquinas que se pueden involucrar en el proceso de la enfermedad. La eficacia de reactivos en la prevención o el alivio de trastornos 145

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U1 autoinmunes se pueden determinar usando un número de modelos animales bien caracterizados de enfermedades autoinmunes humanas. Los ejemplos incluyen encefalitis autoinmune murina experimental, lupus eritematoso sistémico en ratones MRL/lpr/lpr o ratones híbridos NZB, artritis por colágeno autoinmune murina, diabetes mellitus en ratones NOD y ratas BB, y miastenia grave experimental murina (ver Paul editor, Fundamental Immunology, Raven Press, Nueva York, 1989, págs. 840-856).

La inhibición de la activación de las células inmunes es útil terapéuticamente en el tratamiento de alergias y reacciones alérgicas, por ejemplo, inhibiendo la producción de IgE. Un agente que promueve la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural se puede administrar a un individuo alérgico para inhibir las respuestas alérgicas mediadas por la célula inmune en el individuo. La estimulación de la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción con su(s) pareja(s) de unión natural, se puede acompañar por la exposición a alérgeno junto con moléculas MHC apropiadas. Las reacciones alérgicas pueden ser sistémicas o locales en la naturaleza, dependiendo de la ruta r de entrada del alérgeno y el patrón de deposición de la IgE en las células mastoides o basófilos. Así, las respuestas alérgicas mediadas por células inmunes se pueden inhibir de forma local o sistémica por la administración de un agente que promueve la actividad de PD-L3 o VISTA o interacciones de PD-L3 o VISTA-célula inmune.

La inhibición de la activación de las células inmunes a través de la estimulación de I la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural, puede ser también importante terapéuticamente en las infecciones patogénicas de las células inmunes (por ejemplo, por virus o bacterias). Por ejemplo, en el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), la replicación viral se estimula por la activación de las células inmunes. La estimulación de la actividad de PD-L3 o VISTA puede resultar en la inhibición de la replicación viral y de ese modo mejora el curso del SIDA.

La regulación negativa de una respuesta inmune a través de la estimulación de la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) 146

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en pareja(s) de unión natural, puede ser también útil en el tratamiento de un ataque autoinmune de los tejidos autólogos. Así, las afecciones que se causan o exacerban por ataque autoinmune (por ejemplo, enfermedad cardiaca, Infarto de miocardio o aterosclerosis) se puede corregir o mejorar aumentando la actividad de PD-L3 o VISTA o unión de PD-L3 o VISTA a su pareja de unión natural. Se ha tratado dentro del alcance de la invención, por lo tanto, modular las afecciones exacerbadas por el ataque autoinmune, tales como los trastornos autoinmunes (así como afecciones tales como enfermedad cardíaca, infarto del miocardio y arterioesclerosis), estimulando la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PDL3 o VISTA con su contra receptor.

4. Regulación positiva de las respuestas inmunes

La inhibición de la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural, es también útil en la terapia como un medio de regulación positiva de la respuesta inmune. La regulación positiva de la respuesta inmune puede ser en la forma de mejorar una respuesta inmune existente o producir una respuesta inmune inicial. Por ejemplo, mejorar una respuesta inmune a través de la inhibición de la actividad de PD-L3 o VISTA es útil en los casos de infecciones con microbios, por ejemplo, bacterias, virus o parásitos, o en casos de inmunosupresión. Por ejemplo, en una modalidad, un agente que inhibe la actividad de PD-L3 o VISTA, por ejemplo, un anticuerpo que no se activa (es decir, un anticuerpo de bloqueo) contra PD-L3 o VISTA, o una forma soluble de PD-L3 o VISTA, es terapéuticamente útil en situaciones donde la regulación positiva de respuestas de anticuerpos y mediada por células, que resultan en el aclaramiento más rápido o completo de un virus, bacteria, o parásito, pueden ser beneficiosas. Estas afecciones incluyen enfermedades virales de la piel tales como Herpes o culebrilla, en cuyo caso el agente se puede administrar por vía tópica a la piel. Además, las enfermedades virales sistémicas tales como influenza, el resfriado común, y encefalitis se pueden aliviar por la administración en forma sistémica de dichos agentes. En determinados casos, se puede desear además administrar otros agentes que regulan positivamente las respuestas inmunes, por ejemplo,

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σι formas de miembros de la familia B7 que transducen señales a través de receptores co-estimuladores, para aumentar además la respuesta inmune.

Alternativamente, las respuestas inmunes se pueden mejorar en un paciente infectado eliminando las células inmunes del paciente, contactando las células inmunes in vitro con un agente que inhibe la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural, y reintroduciendo en el paciente las células inmunes estimuladas in vitro. En otra modalidad, un método para mejorar las respuestas inmunes involucra aislar células infectadas de un paciente, por ejemplo, células infectadas por virus, transfectarlas con una molécula de ácido nucleico que codifica una forma de PD-L3 o VISTA que no se puede unir a su(s) pareja(s) de unión natural, tal que las células expresan todo o una parte de la molécula de PD-L3 o VISTA en su superficie, y reintroducir las células transfectadas en el paciente. Las células transfectadas pueden ser capaces de impedir una señal inhibidora, y de ese modo células activar in vivo las células inmunes.

Un agente que inhibe la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural, se puede usar profilácticamente en vacunas contra diversos polipéptidos, por ejemplo, polipéptidos derivados de patógenos. La inmunidad contra un patógeno, por ejemplo, un virus, se puede inducir por la vacunación con un polipéptido viral junto con un agente que inhibe la actividad de PD-L3 o VISTA, en un adyuvante apropiado. Como alternativa, se puede usar para la vacunación un vector que comprende ios genes que codifican tanto para un antígeno patogénico como una forma de PD-L3 o VISTA que bloquea la interacción de PD-L3 o VISTA con las células inmunes. Las vacunas de ácidos nucleicos se pueden administrar por una variedad de medios, por ejemplo, por inyección (por ejemplo, intramuscular, intradérmica, o la inyección biolística de partículas de oro recubiertas de ADN dentro la epidermis con una pistola de genes que usa un acelerador de partículas o gas comprimido para inyectar las partículas dentro de la piel (Haynes y otros. (1996) J. Biotechnol. 44:37)). Como alternativa, las vacunas de ácidos nucleicos se pueden administrar por medios no invasivos. Por ejemplo, el ADN puro o formulado con lípido se puede administrar al sistema

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U1 respiratorio o dirigir a otro sitio, por ejemplo, placas de Peyer mediante la administración oral de ADN (Schubbert (1997) Proc Nati. Acad. Sci. USA 94:961). Los microorganismos atenuados se pueden usar para la administración a superficies mucosas (Sizemore y otros (1995) Science 270:29).

En otra modalidad, el antígeno en la vacuna es un auto-antígeno. Dicha vacuna es útil en la modulación de la tolerancia de un organismo. La inmunización con un auto-antígeno y un agente que bloquea la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su pareja de unión natural puede romper la tolerancia (es decir, interferir con la tolerancia de un antígeno propio). Dicha vacuna puede incluir también adyuvantes tales como alumbre o citoquinas (por ejemplo

GM-CSF, IL-12. B7-1, o B7-2). En una modalidad, un agente que inhibe la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural, se puede administrar con los polipéptidos MHC de clase I, por ejemplo, una célula transfectada para co-expresar un polipéptido de PD-L3 o VISTA o anticuerpo de bloqueo y la cadena polipeptídica alfa de MHC clase I, y beta 2 de microglobulina que resultan en la activación de las células T y proporcionan inmunidad a partir de la infección. Por ejemplo, los patógenos virales para los que las vacunas son útiles incluyen: hepatitis B, hepatitis C, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, HIV-1, HIV-2, tuberculosis, malaria y esquistosomiasis.

En otra aplicación, la inhibición de la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural, puede ser útil en el tratamiento de la inmunidad tumoral. Las células tumorales (por ejemplo, sarcoma, melanoma, linfoma, leucemia, neuroblastoma, o carcinoma) se pueden transfectar con una molécula de ácido nucleico que inhibe la actividad de PD-L3 o VISTA. Estas moléculas pueden ser, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico que son antisentido de PD-L3 o VISTA, o pueden codificar anticuerpos anti-PD-L3 o VISTA que no se activan. Estas moléculas pueden ser también la región variable de un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA. Si se desea, las células tumorales se pueden transfectar con otros polipéptidos que activan la co-estimulación (por ejemplo, B7-1 o B7-2). Las células tumorales transfectadas se devuelven al paciente, lo que resulta en la inhibición (por ejemplo, inhibición local) de la actividad de PD-L3 o

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VISTA. Como alternativa, las técnicas de terapia génica se pueden usar para dirigir una célula tumorai para la transfección in vivo.

La estimulación de una respuesta inmune a las células tumorales se puede lograr también inhibiendo la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural tratando un paciente con un agente que inhibe la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural. Los ejemplos preferidos de dichos agentes incluyen, por ejemplo, moléculas de ácido nucleico antisentido, anticuerpos que reconocen y bloquean a PD-L3 o VISTA, y compuestos que bloquean la interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión de origen natural en una célula inmune (por ejemplo, moléculas monovalentes solubles de PD-L3 o VISTA; formas solubles de moléculas de PD-L3 o VISTA que no se unen a los receptores Fe en las células presentadoras de antígenos; formas solubles de las pareja(s) de unión de PD-L3 o VISTA y los compuestos identificados en los ensayos de tamizaje del individuo). Además, las células tumorales que carecen de moléculas de MHC clase I o MHC clase II, o que dejan de expresar cantidades suficientes de moléculas de MHC clase I o MHC clase II se pueden transfectar con el ácido nucleico que codifica toda o una parte de (por ejemplo, una parte del dominio citoplásmico-truncado) de un polipéptido cadena alfa de MHC clase I y polipéptido beta2 de microglobulina o un polipéptido de cadena alfa de MHC clase II y un polipéptido de cadena beta de MHC clase II para de ese modo expresar polipéptidos de MHC clase I o MHC clase II en la superficie de la célula. La expresión de MHC clase I o II apropiada junto con un polipéptido que inhibe PD-L3 o VISTA o ácido nucleico antisentido induce una respuesta inmune mediada por células T contra la célula tumorai transfectada. Opcionalmente, un gen que codifica un constructo antisentido que bloquea la expresión de un polipéptido asociado con MHC clase II, tal como la cadena invariante, se puede co-transfectar también con un ADN que codifica un polipéptido que inhibe a PD-L3 o VISTA o ácido nucleico o antisentido para promover la presentación de antígenos asociados a tumor e inducir inmunidad específica tumorai. La expresión de B7-1 por células tumorales murinos negativas a B7 demostró inducir la inmunidad específica mediada por células T acompañada por

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en el rechazo de tumor y protección prolongada al reto del tumor en ratones (Chen, L. y otros (1992) Cell 71: 1093-1102; Townsend, S. E. y Allison, J. P. (1993) Science 259:368-370; Baskar, S. y otros (1993) Proc Nati. Acad. Sci. 90:5687-5690). Así, la inducción de una respuesta inmune mediada por células inmunes en un individuo humano puede ser suficiente para superar la tolerancia específica al tumor en el individuo. En otra modalidad, la respuesta inmune se puede estimular por la inhibición de la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural, tal que se supera la tolerancia pre-existente. Por ejemplo, las respuestas inmunes contra antígenos para los que un individuo no puede aumentar una respuesta inmune significativa, por ejemplo, antígenos específicos al tumor, se pueden inducir administrando un agente que inhibe la actividad de PD-L3 o VISTA o capacidad de PD-L3 o VISTA para unirse a su pareja de unión natural, se pueden usar como adyuvantes paré aumentar las respuestas a los antígenos extraños en el proceso de inmunización activa.

En una modalidad, las células inmunes se obtienen de un individuo y se cultivan ex vivo en presencia de un agente que inhibe la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural, para ampliar la población de células inmunes. En una modalidad adicional, las células inmunes se administran después a un individuo. Las células inmunes se pueden estimular para proliferar in vitro, por ejemplo, proporcionando las células inmunes con una señal de activación primaria y una señal co-estimuladora, como se conoce en la técnica. Diversas formas de polipéptido de PD-L3 o VISTA o agentes que inhiben la actividad de PD-L3 o VISTA se pueden usar también para co-estimular la proliferación de las células inmunes. En una modalidad, las células inmunes se cultivan ex-vivo de acuerdo con los métodos descritos en la solicitud PCT núm. WO

94/29436. La molécula co-estimuladora puede estar soluble, unida membrana celular o unida a una superficie sólida, tal como una perla.

a una

En una modalidad adicional, realizando cualquiera de los métodos descritos en la presente invención, está dentro del alcance de la invención regular positivamente una respuesta inmune administrando uno o más agentes adicionales. Por ejemplo, el uso de otros agentes conocidos para estimular la respuesta inmune,

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σι tales como citoquinas, adyuvantes, o formas estimuladoras de moléculas coestimuladoras o sus ligandos se pueden usar junto con un agente que inhibe la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural.

E. Identificación de citoquinas moduladas por modulación de la actividad de PD-L3 o VISTA o interacciones de PD-L3 o VISTA con su contra receptor en las células T.

Las moléculas de PD-L3 o VISTA descritas en la presente invención se pueden usar para identificar citoquinas que se producen por o cuya producción se mejora o inhibe en las células inmunes en respuesta a la modulación de la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con su(s) pareja(s) de unión natural. Las células inmunes se pueden estimular in vitro por debajo de lo pótimo con una señal de activación primaria, por ejemplo, las células T se pueden estimular con éster de forbol, anticuerpo anti-CD3 o preferentemente, antígeno, en asociación con una molécula de MHC clase II y dada una señal co-estimuladora, por ejemplo, por una forma estimuladora del antígeno de la familia B7, por ejemplo por una célula transfectada con ácido nucleico que codifica un polipéptido B7 y que expresa el péptido sobre su superficie, o por una forma estimuladora soluble del péptido. Las células se pueden contactar después con las células que expresan PD-L3 o VISTA (por ejemplo, anticuerpos contra PD-L3 o VISTA). Las citoquinas conocidas liberadas en los medios se pueden identificar por ELISA o por la capacidad de un anticuerpo que bloquea la citoquina para inhibir la proliferación de células inmunes o la proliferación de otros tipos de células que se inducen por la citoquina. Por ejemplo, un estuche ELISA IL-4 disponible en Genzyme (Cambridge

Massachusetts), como lo es un anticuerpo de bloqueo IL-7. Los anticuerpos de bloqueo contra IL-9 e IL-12 se disponen del Instituto de Genética (Cambridge, Massachusetts). El efecto para estimular o bloquear la actividad de PD-L3 o VISTA la interacción de PD-L3 o VISTA y su(s) pareja(s) de unión en el perfil de citoquina se puede determinar después. Como se señaló arriba y se muestra en los ejemplos, PD-L3 o VISTA aparentemente suprime la expresión del interferón IL-2 y gamma por las células inmunes.

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Un ensayo in vitro de co-estimulación de células inmunes como se describió anteriormente se puede usar también en un método para identificar las nuevas citoquinas que se pueden modular por la modulación de la actividad PD-L3 o VISTA. Por ejemplo, donde la estimulación de la vía CD28/CTLA4 parece mejorar la secreción de IL-2, la estimulación de la vía de ICOS parece aumentar la secreción de IL-10 (Hutloff y otros (1999) Nature 397:263). Si una actividad en particular después de la co-estimulación indujo, por ejemplo, proliferación celular inmune, no se puede inhibir adicionando anticuerpos de bloqueo a citoquinas conocidas, la actividad puede resultar de la acción de una citoquina desconocida. A continuación de la co-estimulación, esta citoquina se puede purificar a partir de los medios por métodos convencionales y su actividad se midió por su capacidad para inducir la proliferación de células inmunes.

Para identificar las citoquinas que pueden desempeñar un papel en la inducción de la tolerancia, se puede usar un ensayo in vitro de co-estimulación de células T como se describió anteriormente. En este caso, las células T se les pueden dar la señal de activación primaria y contactar con una citoquina seleccionada, pero no pueden dar la señal co-estimuladora. Después de lavar y reposar las células inmunes, se les puede volver a retar tanto con una señal de activación primaria como una señal co-estimuladora. Si las células inmunes no responden (por ejemplo, proliferan o producen citoquinas) se convirtieron en tolerantes y la citoquina no impidió la inducción de tolerancia. Sin embargo, si las células inmunes responden, se impidió por la citoquina la inducción de tolerancia. Aquellas citoquinas que son capaces de impedir la inducción de tolerancia pueden ser objeto de bloqueo in vivo junto con los reactivos que bloquean los antígenos de linfocitos B como un medio más eficiente para inducir la tolerancia en los receptores de trasplantes o individuos con enfermedades autoinmunes. Por ejemplo, se podría administrar una citoquina que bloquea al anticuerpo de un individuo junto con un agente que promueve la actividad de PD-L3 o VISTA o interacción de PD-L3 o VISTA con una pareja de unión.

Así, para resumir ahora se identificó un nuevo miembro de la familia del Ligando de Muerte Programada (PDL) que se expresa por las células Treg. Esta

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ΟΊ proteína nueva se designó PD-L3 o VISTA. Los receptores de esta familia de PD-L son proteínas transmembrana de tipo I que contienen un único dominio IgV, mientras que los ligandos son del tipo proteínas transmembrana tipo I que expresan tanto una IgV como un dominio extracelular IgC. Similar a otros miembros de la familia PDL, PD-L3 o VISTA co-estimula in vitro la proliferación de aCD3 de células T. Además, la expresión de PD-L3 o VISTA se incrementa en Treg aCD3 activado y reduce en presencia de aGITR.

Una segunda proteína, similar a TNF, se identificó también como regulada positivamente después de la estimulación aCD3/aGITR. Esta proteína se designó Treg-sTNF. Estas proteínas se pueden involucrar en la supresión dependiente de contacto y paracrina de la inmunidad y por lo tanto son útiles para modular (por ejemplo, inhibir o estimular) una respuesta inmune y en el tratamiento de enfermedades y afecciones que involucran la señalización de Treg. Por ejemplo, la proteína PD-L3 o VISTA se puede usar como una señal co-estimuladora para estimular o mejorar la activación de células inmunes. Las proteínas PDL-3 o VISTA y agentes de unión de PD-L3 o VISTA y agonistas y antagonistas de PD-L3 o VISTA son especialmente útiles en el tratamiento de afecciones inmunes en donde

L la regulación de la inmunidad de células T se desea, por ejemplo, modulación de la activación de células T, diferenciación y proliferación, y en particular la modulación de la proliferación de las células

CD4+ y CD8+, producción de citoquinas, y respuestas de células T durante las interacciones análogas entre células T y las APC derivadas mieloides.

Esta invención se ilustra además por los ejemplos siguientes, que no deben interpretarse como limitantes. Los contenidos de todas las referencias, patentes y solicitudes de patentes publicadas citadas en toda esta solicitud, así como las Figuras y Listado de Secuencia, se incorporan en la presente descripción como referencia.

Ejemplos

Los siguientes Materiales y Métodos se usaron en los ejemplos que siguen:

Materiales y Métodos

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Perfiles de expresión

Para facilitar las comparaciones con los perfiles de expresión establecidos de células Treg, se emplearon el crecimiento estándar y condiciones de activación (McHugh, y otros (2002) arriba). En resumen, nuevas células Treg aisladas (-96% positivo) se inocularon en 106/ml en medio RPMI completo suplementario con 10% de suero fetal bovino y 100 unidades de IL-2 en una placa de 24 pocilios precubierta con anti-CD3 con o sin anti-GITR (DTA-I) (Shimizu, y otros (2002) arriba). Las células se cultivaron a 37 °C durante 0 y 12 horas, el ARN se purificó y analizó posteriormente usando un arreglo de oligonucleótidos A430 del genoma del ratón Affymetrix®.

Comparando los datos de los grupos de células T CD4+ CD25+ en reposo o activadas, se encontraron que eran similares los patrones de expresión génica a aquellos establecidos en la técnica (Gavin, y otros (2002) arriba; McHugh, y otros (2002) arriba). Para identificar los genes regulados por señalización GIRT, los perfiles de expresión génica se compararon entre las diferentes poblaciones celulares con o sin tratamiento anti-GITR. Una lista de genes conocidos así como

F desconocidos se compilaron incluyendo PD-L3 o VISTA sin caracterizar anteriormente y Treg-sTNF.

Ratones

Los ratones C57BL/6, y ratones transgénicos CD4 OTII se adquirieron del Laboratorio Jackson. Los ratones reporteros knock-in FoxP3-GFP se describieron como previamente Fontenot, J.D., Rasmussen, J. P., Williams, L.M., Dooley, J.L., Farr, A.G., y Rudensky, A.Y. (2005). Regulatory T cell lineage specification by the forkhead transcription factor foxp3. Immunity 22, 329-341 y se proporcionaron generosamente por Alexander Rudensky, Escuela de Medicina de la Universidad de Washington, Seattle, Washington. Los ratones KO PD-1 se proporcionaron generosamente por el doctor Tasuku Honjo (Universidad de Kyoto, Japón) Nishimura, H., Nose, M., Hiai, H., Minato, N., y Honjo, T. (1999). Development of lupus-like autoinmune disease by disruption of the PD-1 gene encoding and ITIM motif-carrying immunoreceptor. Immunity 11, 141-151; Nishimura, H„ Okazaki, T.

Tanaka, Y, .Nakatani, K., Hara, M., Matsumori, A., Sasayama, S., Mizoguchi, A., w

o en

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Hiai, H., Mínato, N., y Honjo, T. (2001). Autoimmune dilated cardiomyopathy in PD-1 recepto r-deficient mice. Science 291, 319-322. Todos los animales se mantuvieron en una instalación libre de patógenos en la Escuela de Medicina de Dartmouth.

Acs, líneas celulares, y reactivo:

Los anticuerpos aCD3 (2C11), aCD28 (PV-I), aCD4 (GK1.5). aCD8 (53-6.7), aCD11b (M1/70), aF4/80 (BM8), aCD11c (N418), αΝΚ1.1 (PK136), aGrl (RB6-8C5), aPD-L1 (MIN5), aPD-L2 (TY25), aB7-H3 (M3.2D7), aB7-H4 (188) se adquirieron de Bioscience. LPS (Sigma), IFNG recombinante murino (Peprotech), IL-2 humana (Peprotech), proteína de fusión soluble PD-L1-lg (R & D Systems) se usaron a las concentraciones indicadas. El adyuvante completo de Freund (CFA) y la ovoalbúmina de pollo (OVA) se adquirieron de Sigma. La línea de células CHO que expresan la molécula l-Ad de MHC II y molécula co-estimuladora B7-2 se proporcionó amablemente por el Dr. Arlene Sharpe (Escuela Médica de Harvard).

Clonación molecular de PD-L3 o VISTA, producción de retrovirus y transducción retroviral de células

PD-L3 o VISTA completa se clonó a partir de células T CD4+ murinas purificadas. El ARN total se aisló de células T CD4+ usando el estuche Qiagen RNAminit. El ADNc se generó usando el estuche para la síntesis de ADNc Bio-Rad ¡ScriptTM. PD-L3 o VISTA completa se amplificó y se clonó en los sitios EcoRI-Xhol de un vector retroviral pMSCV-IRESGFP Zhang. X., y Ren, R. (1998).Bcr-Abl efficiently induces a myeloproliferative disease and production of excess interleukin3 and granulocyte-macrophage colony stimulating factor in mice: a novel model for chronic myelogenous leukemia. Blood 92,3829-3840, en el que se sustituyó el fragmento IRES-GFP por RFP, resultando así en una proteína de fusión de PD-L3 o VISTA fusionada al extremo N-terminal de RFP. Los retrovirus de ayuda libre se generaron en células HEK293T por transfección transitoria del vector retroviral de PD-L3 o VISTA-RFP junto con un vector de embalaje ecotrófico pCL-Eco (IMGENEX corp.). La transducción retroviral de células EL4 de la línea celular T murina, o las DC derivadas de médula ósea se llevaron a cabo centrifugando la infección a 2000 rpm durante 45 min a TA en la presencia de 8 pg/ml de polibreno (Sigma).

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Producción de proteína de fusión PD-L3 o VISTA- Ig

El dominio extracelular de PD-L3 o VISTA (aminoácidos 32-190) se amplificó y clonó en los sitios Spel-BamHI del vector parental CDM7B Hollenbaugh, D. Douthwright, J., McDonald, V., y Aruffo, A. (1995). J Immunol Methods 188, 1-7. Este vector contiene la forma mutante de las regiones constantes y bisagra de lgG1 humana, que redujo mucho la unión a receptores de Fe. El vector resultante CDM7B-PD-L3 o VISTA se co-transfectó con un vector de expresión DHFR pSVdhfr (Mclvor, R. S., y Simonsen, C. C. (1990)). Nucieic Acids Res 18,7025-7032 en la línea celular CHO (dhfr-) (ATCC # CRL-9096). Los clones celulares CHO estables que expresan PD-L3 o VISTA-lg se seleccionaron en medio MEM-alfa sin nucleótidos (Invitrogen). La amplificación adicional con metotrexato 0.5-1 μΜ (Sigma M9929) rindió clones que expresan altos niveles de proteína de fusión soluble PDL3 o VISTA-lg. La proteína de fusión se purificó además a partir del sobrenadante de cultivo usando cromatografía de afinidad estándar con columna de proteína G.

Generación de anticuerpos monoclonales de PD-L3 O VISTA

Hámsteres armenios se inmunizaron 4 veces semanalmente con células EL4 que sobreexpresan a PD-L3 o VISTA-RFP, reforzados después con la proteína de fusión PD-L3 o VISTA-lg emulsificada en CFA. Cuatro semanas después del refuerzo, los hámsteres se reforzaron nuevamente con la proteína de fusión de PDL3 o VISTA-lg soluble. Cuatro días después del último refuerzo, las células esplénicas de hámster se cosecharon y fusionaron con la línea celular de mieloma SP2/0-Agl4 (ATCC #CRL-1581) usando las técnicas estándares de fusión de hibridoma Shulman, M., Wilde, C. D., y Kohler, G. (1978). A better cell line for making hybridomas secreting specific antibodies. Nature 276, 269-270. Los clones de hibridoma que secretan anticuerpos específicos de PD-L3 O VISTA se seleccionaron después de limitar la dilución y tamizaron tanto por ELISA como métodos de citometría de flujo.

ARN y RT-PCR

El ARN total de diversas muestras de tejido de ratón o tipos de células hematopoyéticas purificadas se colectaron usando el método de TrizolTM

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U1 (Invitrogen) siguiendo las instrucciones de las compañías. Los ADNc se prepararon Usando el estuche de síntesis de ADNc ¡ScriptTM (Bio-Rad). Igual cantidad de los ADNc(10ng) de tejido se usaron por reacciones de RT-PCR para amplificar el PDL3 o VISTA completo. Los productos de PCR se observaron después de la corrida a través de un gel de agarosa al 1 %.

Citometría de Flujo

El análisis por citometría de flujo se realizó en el FACSCAN programa CelIQuest (BD Bioscience). El análisis de datos se realizó programa FlowJo (T reestar).

Preparación celular usando usando el el

Las células T CD4+ se aislaron a partir de ratones vírgenes usando el estuche de aislamiento de células de T CD4+ totales (Miltenyi). Cuando se indicó, las células T CD4+ enriquecidas se separaron por flujo en poblaciones vírgenes (CD441ow CD25-CD62Lh¡) y de memoria (CD44hi CD25-CD62Llow). Para los análisis de proliferación in vitro, las células T CD4+ se marcaron con 5 μΜ de CFSE (Molecular Probes) durante 10 minutos en 37C, y lavadas dos veces antes de ser estimuladas.

Ensayo in vitro de activación de células T unidas a placa

Las células T CD4+ purificadas (100,000 células por pocilio) se cultivaron en placas de fondo plano de 96 pocilios en la presencia de anti-CD3 (clon 2C11) y, ya sea PD-L3 o VISTA-lg o control-lg en las relaciones de concentración indicadas.

Por ejemplo, para una valoración de amplio intervalo, las placas de 96 pocilios se recubrieron con 2.5 pg/ml de aCD3 mezclado junto con 1.25 pg/ml (relación 2:1), 2.5 pg/ml (relación 1:1), 5 pg/ml (relación 1:2), o 10 pg/ml (relación de 1:4) de proteína PD-L3 o VISTA-lg o control-lg en PBS a 4 °C durante toda la noche. Los pocilios se lavaron 3 veces con PBS antes de adicionar las células T CD4+. Los cultivos replicados estuvieron en medio completo RPMI1640 suplementado con

FBS al 10%, 10 mM de HEPES, 50 μΜ de β-ΜΕ, penicilina/estreptomicina/Lglutamina. Cuando se indicó, ya sea 100 U/ml de IL-2 humana (PeproTech) cantidad titulada de CCD28 (clon PV-1, célula Bio X) se recubrieron junto con CCD3

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL para rescatar los efectos inhibidores de PD-L3 o VISTA-lg. Los cultivos se analizaron el día 3 por perfiles CFSE o como se indicó de acuerdo con una cinética.

El cultivo de las DC derivadas de médula ósea, transducción retroviral, y estimulación de células T CD4+ transgénicas

Las DC derivadas de médula ósea se generaron como describió Lutz, MB, Kukutsch, N., Ogilvie, A.L., Rossner, S., Koch, F., Romani, N., y Schuler, G. (1999). An advanced culture method for generating large quantities of highly puré dendritic cells from mouse bone marrow. J Immunol Methods 223, 77-92; Son, Y.I., Egawa, S., Tatsumi, T., Redlinger, R.E., Jr„ Kalinski, P., y Kanto, T. (2002). A novel bulk culture method for generating mature dendritic cells from mouse bone marrow cells. J. Immunol. Methods 262,145-157, con algunas modificaciones. En resumen, en el día 0, las células de médula ósea se aislaron a partir de la tibia y fémur lavándolas con aguja 27G. Después de la lisis de los glóbulos rojos, 1-2 x 106 células de médula ósea se resuspendieron en 1 mi de medio completo de RPMI 1640 que contiene 20 ng/ml de GM-CSF (Peprotech Inc.), en placas de cultivos celulares de 6x pocilios (Nunc, Inc.). Se adicionó a las células de médula ósea, 2 mi de sobrenadante que contienen ya sea retrovirus RFP o PD-L3 o VISTA-RFP. El Polibreno (Sigma) se adicionó también a una concentración final de 8 pg/ml. La infección se llevó a cabo centrifugando la placa a 2000 rpm durante 45min a TA. El medio fresco se adicionó antes de que las células se cultivaran después durante otras 2 horas. El procedimiento de infección similar se repitió en el día+1, día+ 3, día+ 5, y día+7. Las células ligeramente adherentes (90% son CD11c+) se recogieron en el día+10 y células CD11c+ RFP+ se clasificaron doble positivas y usaron para estimular las células T CD4+ transgénicas OT-II. Para ensayos de proliferación de células T OT-II, 100,000 células T CD4+ OT-II marcadas con CFSE se cultivaron en placas de 96 pocilios de fondo redondo con 30,000 BMDC clasificada RFP+ o PD-L3 o VISTA-RFP+, en presencia de la cantidad titulada de péptido sintético OVA323-339 (Anaspec). La proliferación de células T OT-II se analizó en 72 horas examinando os perfiles de CFSE.

Estudios de expresión de PD-L3 o VISTA en respuesta a la inmunización o

en

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Para inmunizar ratones transgénicos DO 11.10, 300 pg de OVA (Sigma) se emulsificaron con CFA (200 μΙ), e inyectaron por vía subcutánea en los flancos de los ratones. Los nodulos linfáticos inguinales desecados y no desecados, se cosecharon en los intervalos de tiempo indicados. Las suspensiones celulares solas se prepararon y analizaron por citometría de flujo para la expresión de PD-L3 o VISTA y otros marcadores de superficie.

Actividad inhibidora de PD-L3 o VISTA

La actividad inhibidora de PD-L1 se reveló usando las células presentadoras de antígeno que in vitro sobre-expresan PD-L1 con el receptor antigénico de células T CD4+ y CD8+ de las células T transgénicas y la estimulación antigénica (Cárter, y otros (2002) Eur. J. Immunol. 32:634-43). Del mismo modo, el lentivector descrito en la presente invención, que expresa el PD-L3 o VISTA completo, se transduce en las líneas celulares que expresan el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II y MHC clase I. La respuesta de TEa-Tg o las células T transgénicas 2C al antígeno presentado por el vector vacío transducido o células presentadoras de antígeno PD-L3 o VISTA-transducido se determina de acuerdo con métodos establecidos.

Expresión de Proteínas. Los patrones de expresión en los subconjuntos linfoides, monocitos y células dendríticas, así como los tejidos no hematopoyéticos, se determinaron por RT-PCR y análisis de inmunoelectrotransferencia usando protocolos estándares en conjunto con un anticuerpo de conejo de aPD-L3 o VISTA descritos en la presente invención.

Producción de anticuerpos monoclonales. PD-L3 o VISTA se sobreexpresa en la línea celular B murina A20, y la línea celular recombinante se usó para inmunizar los hámsteres armenios. Después de la inmunización celular 5x, los hámsteres se reforzaron con la proteína de fusión purificada PD-L3 o VISTA-lg emulsificada con CFA. Cuatro semanas después, un refuerzo final se proporcionó con PD-L3 o VISTA-lg. Posteriormente, se realizaron las fusiones de esplénocitos de hámsteres con células SP2/0 en el día 4. Se identificaron dieciséis clones diferentes que reconocen por ELISA la proteína de fusión PD-L3 o VISTA-lg, así como PD-L3 o VISTA teñida pero no PD-L1 sobreexpresada en la línea de células 160 o

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T murinas EM. Once de los clones se subclonaron con éxito y prepararon para la evaluación de su capacidad para teñir el PD-L3 o VISTA endógeno en células y tejidos, y bloquear las funciones de PD-L3 o VISTA.

Ensayos de proliferación:

Los ensayos de proliferación in vitro de células T CD4 se diseñaron para tamizar la actividad del AcM de PD-L3 o VISTA. En este ensayo, las células T se estimularon con anti-CD3 inmovilizado en pocilios de la microplaca, que retícula los receptores de células T. Usando una proteína de fusión PD-L3 o VISTA-lg, que se compone del dominio extracelular de PD-L3 o VISTA fusionado con la parte Fe de IgG humana, se detectó la actividad del AcM de PD-L3 o VISTA en dos configuraciones diferentes. Primero, cuando el AcM se co-inmovilizó con aCD3, inhibió potentemente la proliferación de células T, sólo en la presencia de proteína de fusión PD-L3 o VISTA-lg soluble adicionada. Esta actividad fue dependiente de la capacidad de PD-L3 o VISTA-lg para unirse al AcM inmovilizado en el pocilio. Usando esta forma de ensayo, se identificaron clones que tuvieron actividad supresora alta, intermedia o baja. En segundo lugar, cuando el AcM se adicionó como un reactivo soluble para el ensayo, ejerció potente actividad supresora sobre la proliferación de células T, sinergizando con la proteína de fusión de PD-L3 o VISTA-lg inmovilizada. En esta forma de ensayo, se identificaron clones que tuvieron diferentes actividades supresoras.

EJEMPLO 1: Clonación y análisis de secuencia de PD-L3 o VISTA.

PD-L3 o VISTA y Treg-sTNF se identificaron mediante el perfil transcripcional global de Treg en reposo, Treg activada con aCD3, y Treg activada con aCD3/aGITR. aGITR se seleccionó durante este análisis como inductor de GITR sobre Treg que mostró extinguir su actividad supresora dependiente de contacto (Shimizu, y otros (2002) arriba). PD-L3 o VISTA y Treg-sTNF se identificaron en las matrices de ADN AFFIMETRIX® en función de sus patrones de expresión únicos (Tabla 1). PD-L3 o VISTA presentó un aumento de la expresión en Treg activada por aCD3 y redujo la expresión en la presencia de aGITR; y TregsTNF presentó un aumento en ia expresión dependiente de aCD3/aGITR.

o σι

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IMPI o

en

Las células T CD4+CD25+ purificadas se estimularon en el cultivo durante toda la noche con ninguna, oCD3 o aCD3/aGITR, y el ARN se aisló para el análisis por PCR en tiempo real. La expresión listada se relaciona con la actina.

TABLA 1

ARNm

Expresión Relativa

Ninguna aCD3 aCD3/aGITR

PD-L3 o VISTA

T^reg-sTNF

0.2

0.3

1.5

El análisis de Affimetrix de las nTreg CD25+CD4+ activadas en función de reposo reveló la expresión de un producto génico (ADNc RIKEN 4632428N05, o 4632428N05Rik) con función desconocida pero con homología de secuencia a la superfamilia de Ig.

Más específicamente, un producto génico de 930 pb se clonó a partir de la d biblioteca de ADNc de células T CD4+, que se correlaciona con el tamaño y secuencia predicha. El análisis estructural y de secuencia in sílico predice una proteína transmembrana de 309 aminoácidos después de la maduración, con un dominio extracelular de 159 aminoácidos, un dominio transmembrana de 22 aminoácidos y una cola citoplasmática de 95 aminoácidos (Figura 1A). La alineación de secuencias de aminoácidos revela un dominio extracelular similar a la inmunoglobulina-(lg) V homólogo a los ligandos de la familia B7 tales como PD-L1, PD-L2, B7-H3 y B7-H4, así como los receptores de la familia B7 (es decir, PD -1,

CTLA-4, CD28, BTLA, ICOS) (Figura 1B-C). Aunque la identidad de secuencia de los dominios de Ig-V entre los ligandos y receptores de la familia B7 en general no es muy alta (<40%), el dominio Ig-V de 4632428N05Rik tiene la más alta homología con los ligandos de la familia B7 PD-L1 y PD-L2. La alineación de secuencia revela también diversas cisteínas altamente conservadas (Figura 1 B) que son importantes para la formación de enlaces disulfuros intra-cadena, que es 162

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL característico de la familia de ligandos B7 Sica y otros, (2003). Immunity 18, 849861.

El dominio extracelular de 4632428N05Rik contiene sólo el dominio Ig-V pero carece del dominio Ig-C (Figura 1B-C). Este rasgo único es característico de los receptores de la familia B7, y distingue a 4632428N05Rik de todos los otros ligandos de la familia B7, que contienen ambos dominios Ig-V e Ig-C Freeman, G.J. (2008). Proc. Nati Acad Sci USA 105, 10275-10276; Lazar-Molnar y otros, (2008). Proc. Nati Acad Sci USA 105,10483-10488; Lin y otros, (2008), Proc Nati Acad Sci USA 105, 3011-3016; Schwartz y otros, (2001), Nature, 410,604-608; Stamper y otros, (2001), Nature, 410, 608-61. En consecuencia, el análisis filogenético utilizando el algoritmo de PhyML (Probabilidad Filogenética Máxima) colocó a 4632428N05Rik en una distancia evolutiva más cercana evolutiva con los receptores de la familia B7, en particular con PD-1, que de los ligandos de la familia B7 (Figura 2) Guindon, S., y Gascuel, O. (2003). A simple, fast, and accurate algorithm to estímate large phylogenies by máximum likelihood. Syst Biol. 52,696704. Sin embargo, la cola citoplásmica de PD-L3 o VISTA no contiene ninguno de los dominios de señalización (por ejemplo ITIM, ITAM o ITSM), que son los dominios de firma de los receptores de la familia B7 Sharpe, A.H., y Freeman, G.J. (2002). The B7-CD28 superfamily. Nat Rev Immunol. 2, 116-126. Se formula la hipótesis por lo tanto que a pesar de su estrecha relación evolutiva con el receptor inhibidor PD-1, 4632428N05Rik representa un nuevo miembro de la familia de ligandos B7. En función de estas características estructurales y filogenéticas, esta molécula se denominó como el ligando que expresa PD-1 (PD-L3 o VISTA). PD-L3 o VISTA está altamente conservada también entre los ortólogos de ratón y humano, compartiendo el 77% de identidad de secuencia (Figura 1D).

La secuencia de ácido nucleico que codifica el PD-L3 o VISTA de ratón se expone en la presente descripción como sec. con núm. de ident.: 1 y la secuencia de proteína de PD-L3 o VISTA de ratón se expone como sec. con núm. de ident.: 2.

El homólogo humano de PD-L3 o VISTA se localiza en el cromosoma 10 (72.9 Mb) y compone de 6 exones generando de ese modo un transcripto de 4689 bases de longitud que codifica para una proteína residual 311. La secuencia 163 o

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codificante de ARNm homólogo humano se proporciona en el GenBank con el número de acceso NM_022153 y la secuencia de la proteína se da como NP_071436. La secuencia de ácido nucleico que codifica el PD-L3 o VISTA humano se expone en la presente descripción como sec. con núm. de ident.: 3 y la secuencia de la proteína PD-L3 O VISTA humana se expone como sec. con núm. de ident.: 4. Los genes de ratón y humano comparten el 74% y son 68% idénticos en el nivel de proteína. Los homólogos se identificaron también en Rattus norvegicus en el cromosoma 20 (27.7 Mb; número de acceso en el GenBank BC098723), así como Fugu rubripes y Danio rerio. En modalidades particulares las proteínas de PD-L3 o VISTA de la presente share comparten la secuencia de aminoácidos común expuesta en la sec. con núm. de ident.: 5.

EJEMPLO 2: Estudios de expresión de PD-L3 O VISTA por análisis de RT-PCR y citometría de flujo.

Como se muestra en los experimentos de la Figura 3, el análisis de RT-PCR se usó para determinar el patrón de expresión del ARNm de PD-L3 o VISTA en tejidos de ratón (Figure3A). PD-L3 o VISTA se expresa principalmente en los tejidos hematopoyéticos (bazo, timo, médula ósea), o tejidos con amplia infiltración de leucocitos (es decir, pulmón). La expresión débil se detectó también en tejidos no hematopoyéticos (es decir, corazón, riñón, cerebro, y ovario). El análisis de varios tipos de células hematopoyéticas revela la expresión de PD-L3 o VISTA en macrófagos perifonéales, monocitos esplénicos CD11b+, DC CD11c+, células T CD4+ y células T CD8+, pero nivel de expresión inferior en las células B (Figura 3B). Este patrón de expresión es ampliamente consecuente también con la base de datos de matriz génica de GNF (Instituto de Genómica de la Fundación de Investigación Novartis) Su y otros, (2002), Acad Proc Nati Sci USA 99,4465-4470, así como la base de datos GEO (Gene Expression Omnibus) de NCBI (Figura 4AD).

Para estudiar la expresión de proteína, se produjeron los anticuerpos monoclonales de hámster 8D8 y 6E7 específicos a PD-L3 o VISTA. La especificidad se demuestra mediante la tinción positiva en las células T EL4 o

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o

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL marinas que sobreexpresan a PD-L3 o VISTA, pero de tinción negativa en células

EL4 que sobreexpresan a PD-L1 (Figura 5).

Tanto los anticuerpos poiiclonales como monoclonales se produjeron contra PD-L3 o VISTA. Usando un anticuerpo anti-PD-L3 o VISTA de conejo, la proteína de PDL3 o VISTA se localizó en los órganos linfoides y encontró prominentemente en el tejido cerebral. De los anticuerpos monoclonales identificados, se evaluó además la especificidad de un clon 8D8 de aPD-L3 o VISTA. En este análisis, el clon 8D8 se probó para la unión frente a un panel de moléculas de proteínas de fusión-lg similares a PD-L incluyendo CTLA-4, PD-1, PD-L1, PD-L2, B7-1 y B7-2, PD-L3 o VISTA y hlg. Los resultados de este análisis indican que 8D8 aPDL-3 fue muy específico para PD-L3 o VISTA.

Específicamente, usando el AcM anti-PD-L3 o VISTA clon 8D8, la expresión de PD-L3 O VISTA se analizó en las células hematopoyéticas por citometría de flujo. Ratones Foxp3GFP carentes de reportero se usaron para distinguir las nTreg CD4+ (34). En los órganos linfoides periféricos (bazo y nódulos linfáticos), se observa la expresión significativa en todos los subconjuntos de células T CD4+ (ver total de células T CD4+, o células T vírgenes Foxp3- y células nTreg Foxp3+, y células T de memoria CD4+), mientras que las células T CD8+ expresan la cantidad notablemente expresión de

CD8+, bajo inferior de PD-L3 o VISTA superficial (Figura 3C). En el timo, la PD-L3 o VISTA es negativa en timocitos dobles positivos CD4+ en células individuales CD4 positivas, y detectable en células individuales CD8 positivas. A continuación, una fuerte correlación de alta expresión de PD-L3 o VISTA con marcador CD11b se puede observar tanto para células esplénicas como perifonéales, que incluyen tanto macrófagos F4180 como DCs mieloides CD11c+ (Figura 3D-E). Por otra parte, las células B y células NK son en su mayoría negativas para la expresión de PD-L3 o VISTA. A porciento pequeño de granulocitos Gr-1+ expresan también PD-L3 VISTA (Figura 3F).

Un patrón de expresión diferencial se muestra en el mismo linaje de células a partir de diferentes órganos linfoides (Figura 3G). Para las células T CD4+ y monocitos intermediarios CD11b, el nivel de expresión sigue el patrón de nodulo linfático mesentérico > LN periférico y bazo > de la cavidad peritoneal y sangre.

165 κ

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

Este patrón es menos pronunciado para las células CDL CDUbhi. Estos datos sugieren que la expresión de PD-L3 O VISTA en determinados tipos celulares se puede regular por la madurez celular y/o microambíente tisular.

Además de las células recién aisladas, la expresión de PD-L3 O VISTA se analizó en células T esplénicas CD4+, monocitos CDUbhi y CDs CD11c+ en cultivo in vitro con y sin activación (Figura 6). Las células del bazo se cultivaron ya sea con medio, o con anti-CD3 (para la activación de células T), o con IFND y LPS (para la activación de monocitos y DCs) durante 24 horas antes de ser analizadas para la expresión de PD-L3 o VISTA u otros ligandos de la familia B7 (por ejemplo, V

PD-L1, PD-L2, B7-H3 y B7-H4). Esta comparación reveló distintos patrones de expresión entre estas moléculas. La expresión de PD-L3 o VISTA se pierde rápidamente en todos los tipos celulares después del cultivo in vitro, independientemente del estado de activación. A diferencia, la expresión de PD-L1 se regula positivamente en las células T CD4+ después de la estimulación, o en monocitos CDUbhi y DC CD11c+ después del cultivo en medio solo, y se mejora además en la fisonomía de la estimulación. Las expresiones de PD-L2, B7-H3 y B7H4 no son prominentes bajo las condiciones de cultivo usadas. La pérdida de expresión de PD-L3 o VISTA in vitro es única en comparación con otros ligandos de la familia B7, pero pudieran reflejar condiciones de cultivo no óptimas que fallan al imitar el microambíente del tejido.

Para dirigir cómo la expresión de PD-L3 o VISTA se puede regular in vivo, los ratones transgénicos TCR CD4 DO11.10 se inmunizaron con el antígeno análogo de ovoalbúmina de pollo (OVA) emulsificado con adyuvante completo de Freund (CFA). En 24 horas después de la inmunización, las células del nodo linfático de drenaje se analizaron para la expresión de PD-L3 o VISTA (Figura 7A). La inmunización con el antígeno (CFA/OVA) sin el adyuvante sólo aumentó drásticamente la población de células mieloides CD11b+ PD-L3 o VISTA+, que contuvo una población mixta de macrófagos F4/80+ y DC CD11c+. La comparación adicional con PD-L1 y PD-L2 revela que a pesar de PD-L1 tiene el más alto nivel de expresión constitutiva, PD-L3 o VISTA es la más altamente regulada positivamente durante dicha respuesta inmune inflamatoria (Figura 7B). Colectivamente, estos o

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166 £

IMPI o

en datos sugieren fuertemente que la expresión de PD-L3 o VISTA en las APC mieloides es estrechamente regulada por el sistema inmunológico, lo que puede contribuir a su papel en el control de la respuesta inmune y regulación de la inmunidad de células T.

A diferencia de su expresión aumentada en las APC, la expresión PD-L3 O VISTA se disminuye en las células T CD4+ DO11.10 en un intervalo de tiempo tardío después de la inmunización (es decir en 48 horas pero no en 24 horas) (Figura 8). Este resultado sugiere que la expresión in vivo de PD-L3 o VISTA en las células T CD4 se puede regular por su estado de activación y microambiente de citoquinas durante una respuesta inmune activa.

EJEMPLO 3: Impacto funcional de la señalización de PD-L3 o VISTA en las respuestas de células T CD4+ y CD8+

Una proteína de fusión PD-L3 o VISTA-lg se produjo para examinar los papeles regúlatenos de PD-L3 o VISTA en las respuestas de células T CD4+. La proteína de fusión PD-L3 o VISTA-lg contiene el dominio extracelular del PD-L3 o VISTA fusionado a la región Fe de la lgG1 humana. Cuando inmovilizado en la microplaca, PD-L3 o VISTA-lg pero no el control de Ig suprimió la proliferación de células T CD4+ y CD8+ purificadas a granel en respuesta a la estimulación de anti-CD3 unido a la placa, tal como se determinó por la división celular detenida (Figura 9AB). La proteína de fusión PD-L3 o VISTA-lg no afectó la absorción del anticuerpo anti-CD3 a los pocilios de plástico, como se determinó por ELISA (datos no mostrados), excluyendo así la posibilidad de efectos inhibidores no específicos. Las células T CD4+ KO PD-1 se suprimieron también (Figura 9C), indicando que PD-1 no es el receptor para PD-L3 o VISTA. El efecto inhibidor de PD-L1-lg y PD-L3 O VISTA-lg se comparó directamente también (Figura 10). Cuando las cantidades de proteínas de fusión de Ig tituladas se absorbieron a las microplacas junto con □CD3 para estimular las células T CD4+, PD-L3 o VISTA-lg mostró la eficacia inhibidora similar a la proteína de fusión PD-L1-lg.

Debido a que las células T CD4+ purificadas a granel contienen varios subconjuntos, se evaluó el efecto de PD-L3 o VISTA-lg en subconjuntos de células T CD4+ clasificadas vírgenes (CD25-CD44lowCD62Lhi) y de memoria (CD25167 £

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CD44hiCD62Llow) (Figura 11). Se muestra que PD-L3 o VISTA puede suprimir la proliferación de ambos subconjuntos, aunque con mucha menos eficacia en las células de memoria.

Para entender más el mecanismo de supresión mediado por PD-L3 o VISTA, la expresión de marcadores de la activación temprana de TCR y apoptosis se midieron seguido de la activación de células T en presencia o ausencia de PD-L3

VISTA-lg. Consecuente con el efecto negativo sobre la proliferación celular, existe una supresión global sobre la expresión de los marcadores de activación temprana CD69, CD44, CD62L (Figura 12A suplementaria). Por otro lado, la proteína de fusión PD-L3 o VISTA-lg no indujo apoptosis. Al contrario, se observó menos apoptosis (como se determinó por el porciento de células 7AAD- anexina V+) en presencia de PD-L3 o VISTA o VISTA-lg que en el control-lg, tanto en la etapa temprana (24 horas) y tardía (48horas) de la activación de TCR (Figura 12B). Por ejemplo, en el intervalo de tiempo de 24 horas, en la población total sin control

II

I

-27% de las células fueron apoptóticas en presencia de PD-L3 o VISTA o VISTA-lg mientras -39% de las células de control fueron apoptóticas. Al examinar las células dentro del canal R1 de célula viva, es evidente que la PD-L3 o VISTA o VISTA-lg inhibió fuertemente la muerte celular inducida por la activación (ACID), ya que aproximadamente 72.6% células de control se convirtieron en apoptóticas mientras que sólo 43.5% de las células fueron apoptóticas cuando tratadas con PD-L3 o VISTA o VISTA-lg. Se observaron resultados similares para el intervalo de tiempo de 48 horas. Por lo tanto, parece que la PD-L3 o VISTA o VISTA regula negativamente las respuestas de células T CD4+ suprimiendo la activación temprana de TCR y deteniendo la división celular, pero con el efecto mínimo directo sobre la apoptosis. Este mecanismo de supresión es similar al de B7-H4 Sica G.

L., Choi, I. H., Zhu, G., Tamada, K., Wang, S. D., Tamura, H., Chapoval, A. I., Flies

D. B., Bajorath, J., y Chen, L. (2003). B7-H4, a molecule of the B7 family, negativeiy regulates T cell immunity. Immunity 18, 849-861.

Un ensayo de 2 pasos se desarrolló para determinar si PD-L3 o VISTA o VISTA-lg pueden suprimir ias células T CD4 pre-activadas, y qué tan persistente es su efecto supresor. Se muestra que el efecto supresor de PD-L3 o VISTA o

O σι

168

IMPI proteína de fusión VISTA-lg persiste después de su retirada a las 24 horas después de la activación (Figura 9D). Además, tanto las células T CD4+ vírgenes como preactivadas se pueden suprimir por PD-L3 o VISTA o VISTA-lg (Figura 9D¡, 9Diii y 9Div).

o

U1

A continuación, se analizó el efecto de PD-L3 o VISTA o VISTA-lg en la producción de citoquinas de las células T CD4+. PD-L3 o VISTA o VISTA-lg suprimió la producción de citoquinas Thl IL-2 y IFNalfa a partir del cultivo de células T CD4+ purificadas a granel (Figura 13A-B). El efecto de PD-L3 o VISTA o VISTA se probó además en las poblaciones de células T CD4+ vírgenes separadas (CD25-CD44lowCD62Lhi) y de memoria (CD25-CD44hiCD62Llow). Se muestra que las células T CD4+ de memoria son la principal fuente para la producción de citoquinas dentro del compartimiento de células T CD4+, y PD-L3 o VISTA o VISTA pueden suprimir esta producción (Figura 13C-D). El efecto inhibidor similar de PDL3 o VISTA o VISTA en la producción IFNalfa a partir de células T CD8+ se muestra también (Figura 13E). Este efecto inhibidor de PD-L3 o VISTA o VISTA en la producción de citoquinas por las células T CD4+ y CD8+ es consecuente con la hipótesis de que PD-L3 o VISTA o VISTA es un ligando inhibidor que regula negativamente las respuestas inmunes.

A continuación, se diseñaron estudios para determinar los factores que son capaces de superar el efecto inhibidor de la PD-L3 o VISTA o VISTA. Dado que PD-L3 o VISTA o VISTA suprimió la producción de IL-2, e IL-2 es esencial para la supervivencia y proliferación de células T, formulamos la hipótesis de que la IL-2 puede evadir la actividad inhibidora de PD-L3 o VISTA o VISTA. Como se muestra en la Figura 14A el IL-2 exógeno, pero no IL-15, IL-7, o IL-23, revirtieron parcialmente el efecto supresor de PD-L3 o VISTA o VISTA-lg sobre la proliferación celular. El rescate incompleto por los altos niveles de IL-2 indica que la señalización de PD-L3 o VISTA o VISTA se dirige a rutas de la activación de células T más amplias que a la producción simplemente de IL-2. Por otra parte, la señal de coestimulación potente proporcionada por el anticuerpo agonista anti-CD28 invirtió completamente la supresión mediada por PD-L3 o VISTA o VISTA-lg (Figura 14B) mientras que niveles intermediarios de co-estimulación se suprimen todavía por la

169 £

IMPI o

U1 señalización de PD-L3 o VISTA o VISTA (Figura 14C). Este resultado sugiere que la supresión inmune mediada por PD-L3 o VISTA o VISTA puede ser más eficaz en afecciones menos inflamatorias, pero será inevitablemente aplastada por señales co-estimuladoras positivas fuertes. En este sentido, PD-L3 o VISTA o VISTA comparte esta característica con otros ligandos supresores de la familia B7 como PD-L1 y B7-H4 Sica y otros, (2003), Immunity, 18,849-861. Cárter y otros, (2002), Eur J Immunol 32 ,634-643.

Además de la proteína de fusión PD-L3 o VISTA o VISTA-lg, es necesario confirmar que PD-L3 o VISTA o VISTA expresada en las APC puede suprimir la activación de las células T antígeno-específicas durante las interacciones análogas entre las APC y células T. Para este propósito, PD-L3 o VISTA o VISTA-RFP o proteína de control RFP se sobre-expresó mediante transducción retroviral en una línea celular presentadora de antígeno artificial (CHO-APC) que expresa establemente moléculas MHCII y B7-2 Latchman y otros, (2001). Nat. Immunol 2, 261-268. Uno de los problemas en la expresión de PD-L3 o VISTA o VISTA en CHO es que la mayoría de PD-L3 o VISTA o VISTA fracasa para localizarse en la superficie celular, quizás debido al ambiente extraño que carece de soporte para la localización superficial de PD-L3 o VISTA o VISTA (datos no mostrados). Aunque no existen motivos claros presentes en la cola citoplasmática de PD-L3 o VISTA o VISTA para sugerir el modo de regulación, especulamos que la cola puede desempeñar un papel para su localización intracelular. Por consiguiente, un mutante sin cola de PD-L3 o VISTA o VISTA se diseñó y se encontró para localizar exitosamente la superficie celular de CHO (datos no mostrados).

Para estimular la respuesta de células T, las células CHO-PD-L3 o VISTA o VISTA o CHO-RFP se incubaron junto con células T CD4+ DO 11.10 en presencia del péptido antigénico OVA. Como se muestra en la Figura 15 A-C, CHO-PD-L3 o VISTA o VISTA indujo menor proliferación de células DO11.10 que células CHORFP. Esto efecto supresor es más pronunciado a concentraciones inferiores de péptido, consecuente con la noción de que una señal estimulante más fuerte puede superar el efecto supresor de PD-L3 o VISTA o VISTA.

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Además, se confirmó el efecto inhibidor de PD-L3 o VISTA o VISTA completa sobre las APC naturales. Las células dendríticas derivadas de la médula ósea cultivadas in vitro (BMDC) no expresan altos niveles de PD-L3 o VISTA o VISTA (Figura 16). PD-L3 o VISTA o VISTA-RFP o RFP se expresó en las BMDC por transducción retroviral durante el período de cultivo de 10 días. Las células transducidas se clasificaron por la homogeneidad en función de la expresión de RFP. El nivel de expresión de PD-L3 o VISTA o VISTA en las DC transducidas se estimó por la tinción con el AcM anti-PD-L3 o VISTA o VISTA, y se encontró que era similar al nivel de los macrófagos perifonéales recién aislados, de ese modo dentro del intervalo fisiológico de expresión (Figura 16). Las BMDC clasificadas se usaron después para estimular las células T CD4+ transgénicas especificas-OVA (OTII) en presencia del péptido OVA (Figura15D). En ellas se muestra que la expresión de PD-L3 o VISTA o VISTA sobre las BMDC suprimieron las respuestas proliferativas de células T CD4+ análogas. Este resultado es consecuente con los datos previos usando la proteína de fusión PD-L3 o VISTA o VISTA-lg y las células CHO-APC, lo que sugiere que PD-L3 o VISTA o VISTA puede suprimir las respuestas inmunes mediadas por células T.

EJEMPLO 4: Evaluación de anticuerpos anti- PD-L3 o VISTA o VISTA en el modelo animal de Esclerosis Múltiple (EAE)

Debido a que los AcM TPD-L3 O VISTA o VISTA parecen suprimir in vivo las respuestas de las células T, CPD-L3 O VISTA o VISTA se ensayó para evaluar si puede inhibir una enfermedad autoinmune mediada por células T. Usando el modelo de la Encefalomielitis Alérgica Experimental (EAE), se determinó el efecto funcional de los AcM CPDL-L3 sobre las enfermedades inflamatorias. La EAE es un modelo murino de enfermedad autoinmune humana de esclerosis múltiple ampliamente usado. La EAE se puede inducir ya sea por inmunización con antígenos de mielina en adyuvante o por transferencia adoptiva de células T específicas a mielina, lo que resulta en los infiltrados inflamatorios de diversas células T y células B efectoras, y macrófagos, y la desmielinización del sistema nervioso central.

o en

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U1

El AcM aPDL-L3 se probó en el modelo pasivo de EAE para impedir la inducción de anafilaxis debido a la inyección de grandes cantidades de AcM como antígeno extraño. En este modelo EAE de transferencia adoptiva, los ratones donantes SJL se inmunizaron con CFA y péptido PLP. En el día 10, se aislaron los linfocitos totales a partir de LN de drenaje, y cultivaron in vitro con el péptido PLP

IL-23 (20 ng/ml) y anti-IFNg (10 pg/ml) durante 4 días. Las células T CD4 expandidas se purificaron después, y transfirieron adoptivamente en ratones receptores vírgenes. Este análisis indicó que el AcM aPDL-L3 retardó la aparición de la enfermedad, así como redujo la gravedad de la enfermedad, desplazando significativamente de ese modo la curva de progresión de la enfermedad (Figura 17). Además, redujo la gravedad en un gran porcentaje de los ratones y aumentó en gran medida la sobrevivencia de alrededor del 22% a más del 75%. Esta actividad demostrada del AcM aPDL-L3 en EAE es consecuente con los datos in vitro, y se muestra el uso de este reactivo como un nuevo reactivo inmunorregulador en diversas enfermedades inflamatorias.

EJEMPLO 5: EXPRESIÓN DE VISTA EN EL CNS

La expresión de VISTA en el CNS se llevó a cabo también. Estos ensayos revelaron que en ratones con la enfermedad, la expresión de VISTA se reduce notablemente (del 76%

33%) en las células CD11b+ (Figura 23) en consecuencia con la hipótesis de que la pérdida de VISTA se puede tolerar para mejorar la inflamación. Esto es interesante, y de importancia funcionalmente probable cuando contrastamos las células mieloides inflamatorias en la presente invención con la MDSC en tumores que expresan niveles de VISTA extremadamente altos. Se indicó que ratones EAE tienen elevados números de células supresoras derivadas mieloides (MDSC CDL11 b+Ly-6Chigh) en el bazo que son potentemente supresoras para la activación de células T y pueden moderar la enfermedad 32. Nuestros datos apoyan fuertemente la hipótesis de que VISTA puede desempeñar un papel en la supresión de EAE mediada por mieloide.

EJEMPLO 6: El efecto de VISTA en el destino y función de las células T en la EAE.

Llevamos a cabo también experimentos ensayando el efecto de VISTA en el destino y función de las células T en la EAE. Deseamos evaluar si VISTA altera el 172 £

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en crecimiento de las células T patogénicas, encefalitogénicas, expansión clonal de células T, polaridad de células T, longevidad y la conversión de Teff —>Treg. Estudiamos el efecto del bloqueo de VISTA en el destino de células T en EAE. En consecuencia con la más alta puntuación de la enfermedad, el análisis del CNS al final del curso de la enfermedad confirmó significativamente más infiltración de células T CD4+ que producen IL17A (desde 0.66-+11%) en el grupo tratado 13F3 ( VISTA) (Figura 24).

EJEMPLO 7: Ratones transgénicos y knock-out de PD-L3 O VISTA o VISTA

Usando la infección lentiviral de embriones, se produjeron cuatro ratones transgénicos que expresan omnipresentemente PD-L3 o VISTA o VISTA. Estos ratones expresan PD-L3 o VISTA o VISTA completo bajo el control del promotor del factor de elongación 1 humano. Estos ratones se generaron usando el vector lentiviral pWPT. Similar a otros miembros de la familia de PD-L1 (Appay, y otros (2002) J. Immunol. 168:5954-8), se contempla que PD-L3 o VISTA o VISTA funcionará como un regulador negativo in vivo funcionando mientras para coestimular la proliferación in vitro de células T aCD3. En cuanto a esto, se espera que estos ratones desarrollen espontáneamente autoinmunidad y respuestas inmunes in vivo en los ratones transgénicos de PD-L3 o VISTA o VISTA (es decir, respuestas inmunes humorales, cebando las células T, etc) se valoran para evaluar el crecimiento de enfermedad autoinmune sistémica.

Para los ratones knock-out, PD-L3 o VISTA o VISTA se inactiva por recombinación homologa. Un clon BAO que contiene la secuencia completa de PDL3 o VISTA o VISTA se adquirió de INVITROGEN™ (Carlsbad, CA). Un vector dirigido a PD-L3 o VISTA o VISTA se generó insertando un fragmento de 1.6 kb localizado en el lado 5' del segundo exón del gen de PD-L3 o VISTA o VISTA corriente arriba el gen de neomicina y el fragmento de 5 kb localizado en el lado 3' del tercer exón del gen de PD-L3 o VISTA o VISTA comente abajo del gen de la neomicina. Las células madres embrionarias (ES) derivadas de B6 se electroporan con el vector dirigido a PD-L3 o VISTA o VISTA y se seleccionan los clones recombinantes. Los clones seleccionados se inyectan después en los biastocitos C57BL/6 y las crías masculinas quiméricas resultantes se cruzan con ratones 173 £

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U1 supresores de FLP para eliminar el casete de neomicina. La transmisión del alelo dirigido en las crías se determina por POR a partir del ADN genómico. El segundo y el tercer exón contienen el dominio de PD-L3 o VISTA o VISTA, por lo tanto, los ratones resultantes tienen sólo la forma inactivada de la molécula de PD-L3 o VISTA o VISTA.

La capacidad inmune global de ratones deficientes de PD-L3 O VISTA o VISTA se determina como con otros ratones PD-L incluyendo la evaluación de las respuestas de células T al antígeno, respuestas inmunes humorales, autoinmunidad manifiesta (por ejemplo, Lupus Eritematoso Sistémico, enfermedad intestinal inflamatoria), y una susceptibilidad aumentada a la enfermedad autoimmune inducida (encefalomielitis autoinmune experimental) (Chen (2004) arriba).

EJEMPLO 8: Anticuerpos específicos a PD-L3 O VISTA o VISTA probados en el modelo animal de Artritis inducida por colágeno.

Como se muestra en los experimentos en la Figura 18, los ratones machos DBA/1J se inmunizaron en la base de su cola con 100 pl de emulsión que contiene 100 μg de colágeno de pollito tipo II (C-ll) en CFA (Mycobacterium tuberculosis 3.5 mg/ml) y reforzaron vía IP con 100 pg de CU acuoso en el día 21 después de la inmunización. Los ratones de cada grupo de tratamiento (n = 6) fueron ya sea sin tratar (NT- círculos negros), inyectados con 300 pg de IgG de hámster (Ig Hamcuadrados negros) o inyectados con 300 pg de anticuerpo monoclonal 7c9 (triángulo rojo) o 13F3 (triángulo verde), como se indica. Las inyecciones se administraron cada 2 días. El hinchamiento artrítico se puntuó en una escala de 0-4 para cada pata de cada ratón en los días indicados.

La puntuación de la artritis que se muestra es la puntuación total de todas las patas de los ratones en cada grupo de tratamiento dividido por el número de ratones en el grupo.

EJEMPLO 9: Bloqueo de VISTA por un anticuerpo monoclonal específico a VISTA mejora las respuestas in vitro de células T.

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U1

El AcM VISTA específico (13F3) se identificó que neutraliza la supresión mediada por VISTA (Figura 19). Las APC mieloides CD11b^hl se purificaron a partir de ratones vírgenes para estimular las células T CD4⁺ transgénicas OT-II en presencia o ausencia de 13F3. En consecuencia con su efecto neutralizante, 13F3 mejoró la proliferación de células T estimuladas por células mieloides CD11 b^hi, que se mostraron para expresar altos niveles de VISTA.

EJEMPL010: Anti-VISTA mejora la inmunidad antitumoral.

Debido a la capacidad de anti-VISTA para mejorar la activación de células T, evaluamos si el anti-VISTA puede mejorar la respuesta inmune protectora a un tumor inmunogénico. Un modelo en el que tenemos una gran cantidad de experiencia es el carcinoma de vejiga, MB49. El MB49 expresa el antígeno masculino, y así es modestamente inmunogénico en ratones hembras, aunque, crecerá y matará los ratones hembra si no hay intervención inmune. Para probar la eficacia de la terapia del VISTA, ratones hembras se administraron por vía subcutánea (s.q.) con células tumorales MB49 y se trató con VISTA. Días después de eso, se midió el tamaño del tumor hasta que los ratones tuvieron que ser sacrificados. Como se puede observar fácilmente en la Figura 20 la terapia antiVISTA deteriora en gran medida el crecimiento del tumor. Creemos que se debe a la capacidad de anti-VISTA para intensificar respuestas inmunes (CMI) mediadas por células.

EJEMPLO 11: Efecto de VISTA sobre la regresión del tumor en 4 modelos de tumor murino.

Los experimentos en el tumor inmunogénico de carcinoma de vejiga MB49 mostraron que el uso del AcM 13F3 neutraliza a VISTA y protege al huésped del crecimiento tumoral. Los datos indican que VISTA tiene un desempeño considerable como inmunoregulador negativo en el microambiente de un tumor debido a su expresión extremadamente alta de las MDSC. Los estudios que examinan el efecto del anti-VISTA de ratón en el crecimiento de los modelos de tumor inmunogénico (MB49) y altamente no inmunogénico (B16) confirmarán además la eficacia de una terapia de aVISTA, clarificarán sobre el mecanismo de

175 £

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U1 acción, y proporcionarán la base para seleccionar la dosis y tiempo óptimos. La justificación para cada modelo de tumor se detalla a continuación.

MB49 hembras:

en ratones

Ya

MU mostramos eficacia en este modelo murino.

Las MDSC en este modelo también expresan elevados niveles de VISTA (no mostrado). En este modelo, debido a la presencia del antígeno H-Y, el tumor MB49 es

Nombre del Tumor

MB49

MB49

B16.F10

ID8

Tipo tumor de

Huésped

Gnjpos

Ensayos

Carcinom

Hembra B6 vejiga de rVIST

Carcinom

Macho B6 de

Desarrollo de tumor vejiga ig control

Superviven cia

Melanoma

Cáncer de

Hembra macho B6

Ensayos inmune/ autoinmune

Hembra B6 modestamente ovario inmunogénico.

Desde que sabemos que lá terapia VISTA es eficaz, usaremos este modelo como un control positivo para determinar la dosificación (1-100 ug/ratón; y tiempo (día de inoculación del tumor, o 4, 7, 10 días después de tumor; intervención terapéutica) de la terapia anti-VISTA.

MB49 en ratones machos: Usando dosis y tiempo eficaces en los ratones hembras, se determina la eficacia de la terapia anti-VISTA en ratones machos (en los que el tumor es menos inmunogénico).

Melanoma B16: El AcM anti-CTLA-4 se mostró muy eficaz en este modelo, y representa un tumor no inmunogénico donde el modelo de ratón ha sido valioso para predecir ei éxito en seres humanos. Los regímenes de dosificación y tiempo serán similares a los que mostraron ser eficaces en el modelo MB49.

Carcinoma de ovario ID8: Es en este modelo, que la expresión VISTA se mostró ser extremadamente alta en las MDSC. Los ratones que tienen tumor se

176 £

IMPI o

en tratan con aVISTA en el momento de inoculación del tumor o en el día 5, 15, 25 después de la inoculación.

Métodos. Los ratones WT B6 se usan para determinar la dosis y tiempo óptimos del tratamiento anti-VISTA para la remisión de todos los modelos tumorales murinos indicados. Los modelos que se usan se enumeran en la tabla anterior.

La lectura de este ensayo de dosis y tiempo son la cinética de crecimiento tumoral. Para los estudios de MB49 y B16, todos los estudios de tumores se realizan a través de la vía de inoculación intradérmica (i.d.) y por lo tanto el tamaño de del tumor se puede medir fácilmente. Las mediciones tumorales se recogen cada 2-3 días con un calibrador. En cada uno de estos modelos, se probará el efecto de anti-VISTA o de anticuerpo control por su capacidad para retrasar el crecimiento tumoral o facilitar la regresión del tumor. El crecimiento de ID8 se seguirá usando una ID8 luciferasa transducida e imagimática de cuerpo entero usando una estación de trabajo IVIS. Además, se determinará también la supervivencia del huésped.

Los datos sobre el crecimiento del tumor se expresan como el volumen del tumor medio ± SEM y las diferencias entre los grupos se analizarán mediante ANOVA de dos colas. Los valores de probabilidad (p) menos de 0.05 se consideran estadísticamente significativos. Los datos de supervivencia se analizan usando el método de Kaplan-Meier con la prueba de escala de Wilcoxon y la prueba de escala logarítmica usada para verificar la importancia de la diferencia en la supervivencia entre los grupos. En los modelos B16, se determinan las frecuencias h de ratones que desarrollan vitÍligo.

Usando estos métodos se obtiene el crecimiento del tumor y/o regresión del tumor reducidos en los ratones tratados con AcM anti-VISTA en comparación con los ratones tratados con el Ac control en diversos de los modelos de tumores no inmunogénicos. Ya se había mostrado que el tratamiento anti-VISTA retarda el crecimiento tumoral en un modelo de tumor inmunogénico. Como cada uno de estos modelos tumorales tienen su propia cinética de crecimiento específico y dependencia anticipada sobre VISTA para conferir el crecimiento del tumor

177 o

σι

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL suprimir la Inmunidad, si AcM de ratón se administrará ya sea en el momento de inoculo del tumor o en momentos después de este. Además, al menos 3 concentraciones diferentes de un AcM VISTA se prueba para determinar la dosis óptima para el beneficio terapéutico.

Como se muestra en la Figura 21A-E, el tratamiento con el AcM VISTA redujo el crecimiento del tumor en todos estos 4 modelos de tumor en donde los ratones se inocularon ya sea por vía s.q. con células tumorales de A. MB49

B.MCA105, o C.EG7, o vía i.p. con células tumorales de D. ID8-luciferasa, y se trataron con AcM VISTA 13F3 en días altemos (300yg), comenzando el día +1. El crecimiento subcutáneo del tumor se monitoreó. Para el tumor de ID8-luciferasa, los ratones se les tomaron imágenes en día 30 usando IVIS Xenogen. E. La expresión de VISTA en los leucocitos mieloides en ratones que tienen tumor se determinó también. El LN de drenaje y tejidos tumorales (ascitls) se analizaron para la expresión de VISTA. Estos hallazgos muestran que VISTA expresada en MDSC es una molécula supresora mayor que interfiere con el desarrollo de la inmunidad protectora anti-tumor, y VISTA alivia esta actividad supresora permitiendo la intervención inmune y el crecimiento reducido del tumor. Estos resultados apoyan también la conclusión de que VISTA en las células mieloides en la enfermedad autoinmune desempeña una función fundamental en la regulación de la extensión de la inflamación.

EJEMPLO 12: Síntesis de VISTA oligomérica y proteínas de fusión de VISTA útiles para el tratamiento de la autoinmunidad.

VISTA-lg soluble in vitro no es supresora ni se puede detectar fácilmente su unión a las células. Por el contrario, esta molécula unida al plástico es profundamente supresora. Además, los estudios que usan VISTA-lg in vivo no mostraron actividad manifiesta (datos no mostrados). Con respecto a estos estudios, VISTA-lg que se creó tiene mutaciones en el dominio CH2-CH3 que excluye la unión a FcR, y por lo tanto no es citofílico in vivo. Estudios recientes mostraron que PD-L1 tetramérica se une 100X más (Kd 6x 10-8 M) que PD-L126 monómerica a PD-1, y cuya unión a las células fue fácilmente detectable. La PD-L1 tetramérica no se probó in vivo, pero in vitro mostró bloquear la supresión funcional 178

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL por la PD-L1 nativa. Usando métodos similares se prepararon los oligómeros que dirigirán la ruta de VISTA e inducirá una potente actividad inmunosupresora in vitro e in vivo.

Dichos oligómeros se construyen usando el dominio extracelular monomérico de VISTA o un fragmento de éste, por ejemplo, por lo menos 50, 75, 100, 125, 150, 175 ó 200 aminoácidos de largo cuyo dominio extracelular o una parte de éste se usa como bloques de construcción para el oligómero. En estos métodos, los inventores toman ventaja de las tecnologías del tetrámero MHC bien establecidas. En estos métodos, el constructo o un fragmento del ectodominio de VISTA se enlaza al N-terminal de una variedad de dominios de oligomerización (identificados arriba) para para generar una serie de complejos de Vista con valencias que abarcan desde la divalente hasta la heptavalente.

Así, una serie de oligómeros no covalentes se crea en función de la alta afinidad de los dominios enrollados en espiral que dirigen la formación estable del ensamblaje dímérico, trimérico, tetramérico, pentamérico y heptamérico. Estos constructos oligoméricos se expresan en una célula huésped, por ejemplo, E. coii. Cuando la expresión se lleva a cabo en E. coli los oligómeros expresados se repliegan entonces y purifican a partir de cuerpos de inclusión utilizando protocolos estándares de laboratorio. Este enfoque ha producido de forma rutinaria material de alta calidad para el análisis biológico y estructural, incluyendo los complejos de péptido-MHC y GITRL66 trimérico. Las proteínas oligoméricas aisladas se evalúan después mediante SDS-PAGE, filtración en gel analítica, ultracentrifugación *

analítica y espectrometría de masas. Estas medidas de control de calidad garantizan la disponibilidad de materiales homogéneos, bien caracterizados por estudios in vitro e in vivo. La organización en paralelo de estos constructos resulta en moléculas en las que la valencia es igual al estado oligomérico, ya que cada complejo VISTA individual se coloca para interactuar productivamente con la superficie celular unido al receptor de VISTA. Los constructos anteriores poseen estabilidad extrema y homogeneidad del estado oligomérico. (los dominios de oligomerización no-covalente enrollados en espiral presentan típicamente o

U1

179 £

IMPI o

σι temperaturas de fusión que exceden los 100 ’C, excepto para la secuencia del heptámero que presenta una temperatura de fusión de 95 °C.

Además el VISTA-lg dimérico se tetrameriza ya sea en citofílico o nocitofílico. Los constructos de fusión Fe de VISTA en el marco con el Fe de lgG1 (tanto IgGIde tipo salvaje como lgG1 que no se une a FcR existente) se modifican con un sitio N-temninal BirA para la biotinilación enzimática y se clonan en el vector plRES2-EGFP. La biotinilación enzimática permitirá la modificación de residuo único, específico, y orientación después de la multimerización con la avidina. Este enfoque se usó para la generación de numerosas proteínas de fusión Ig, que incluyen B7-1, PD-L1, PD-L2 y TIM-3. Las proteínas expresadas se biotinilan enzimáticamente in vitro después, purifican mediante exclusión de tamaño por

HPLC, y tetramerizan usando PE-avidina. Los tetrámeros resultantes que son citofílicos o no, se evalúan in vivo.

Estas proteínas VISTA multiméricas diseñadas por ingeniería son útiles en el tratamiento de la autoinmunidad y otras afecciones en donde que la intervención la ruta de VISTA y es terapéuticamente justificada en la inmunosupresión.

en

EJEMPLO 13: Vectores adenovirales de VISTA para inducir inmunosupresión.

La transferencia génica usando virus recombinante adeno-asociado (AAV) ha tenido gran desarrollo tecnológico en la terapia génica. Específicamente, la administración génica mediada por AAV del gen PD-L1, o CTLA4-lg y CD40-lg lograron la eficacia terapéutica en modelos de enfermedad autoinmune del lupus y trasplante cardíaco. Estos métodos serán usados para administrar ya sea VISTA completa, o ectodominios oligoméricos de VISTA, y sus efectos terapéuticos se evalúan en el modelo de EAE. El vector recombinante de adenovirus que expresa ya sea VISTA murina completa, o ectodominio oligomérico de VISTA se crea usando el sistema de expresión Adeno-XTM (Clontech) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. En resumen, VISTA se clona en un vector de expresión basado en pAdDEST, E1 y E3 suprimido, bajo el control del promotor de citomegalovirus humano (CMV). VISTA y control de adenovirus que expresan lacZ se purifican después a partir de Usados celulares. Para la sobreexpresión sistémica de VISTA, el adenovirus se administró a ratones por inyección intravenosa en la 180 £

IMPI o

en vena de cola (1 x 109 unidades formadoras de placas [Pfu]), ya sea antes de o poco después de la inducción de la enfermedad a través de la vacunación, o después del inicio de la enfermedad. Los ratones de control recibirán 100 pl de PBS. El desarrollo y alteraciones de la enfermedad se monitorean tanto en ratones SJL como en ratones C57BL/6, que presentan el patrón diferente progresión de la enfermedad, y que representan dos formas distintas de manifestación clínica de los pacientes MS humanos.

EJEMPLO 14: Estudios funcionales con proteínas diseñadas por ingeniería y vectores adenovirales.

Los ratones se administran también (5-100 ug de proteína/ratón 3 x semana) con VISTA diseñada por ingeniería y/o vectores adenovirales. A continuación de la administración, se determina la expansión, diferenciación de células T, así como el desarrollo de EAE.

EJEMPLO 15: Estudios estructurales en VISTA y determinación molecular de determinantes de la función de VISTA

La afinidad, especificidad, estado oligomérico, y la formación y la localización de los complejos de señalización organizados son contribuyentes decisivos de la función inmune. Todas estas características impactan en la señalización y regulación inmune, como la organización de los ectodominios del receptor-ligando controlan directamente el reclutamiento, organización y función de la señalización citoplásmica y moléculas estructurales asociadas de forma no covalente. La alta resolución de la estructura cristalina de VISTA se determina usando técnicas que incluyen sistemas de expresión de bacterias, insectos y mamíferos, así como la cristalización de alto rendimiento y enfoques de determinación de estructura. Para validar el patrón de enlace disulfuro cristalográficamente observado, explotaremos la espectrometría de masas de alta resolución usando enfoques que exitosamente apoyados con estudios publicados de TIM-3 y DcR359 humano. En función de estos resultados estructurales una serie de mutantes con propiedades oligoméricas alteradas se diseñan, así como mutantes en las proximidades de cualquiera de las regiones perturbadas del dominio IgV de VISTA. Estas proteínas mutantes proporcionarán entendimiento mecanicista directo y adicional en la 181 £

IMPI o

U1 función VISTA y deben ser útiles en la terapéutica en donde se desea la inmunosupresión, tales como las enfermedades autoinmunes, alérgicas inflamatorias identificadas en la presente descripción. Estos mutantes, los oligómeros especialmente se prueban in vitro en sistemas y se evalúan en modelos animales de enfermedades autoinmunes e inflamatorias para evaluar el efecto inmunosupresor sobre la progresión de la enfermedad, remisión de la enfermedad í o en proteger al animal de desarrollar la afección autoinmune o inflamatoria.

Estas proteínas VISTA oligoméricas activarán la ruta y función de VISTA como un objetivo de la intervención inmunológica en la autoinmunidad. Esta * intervención suprimirá la inmunidad y ejercerá un beneficio terapéutico en la enfermedad autoinmune y otras afecciones en donde se desea la supresión autoinmune. Esto se logra administrando las proteínas VISTA oligomerizadas en diferentes modelos autoinmune e inflamatorios tales como modelos animales de EAE y artritis inducida por colágeno. Además, como se discutió anteriormente, los vectores adenovirales que sobreexpresan a VISTA completa u oligómeros de VISTA se construyen y prueban in vivo. Estos estudios confirmarán los efectos inmunosupresores de los oligómeros de VISTA.

EJEMPLO 16: Experimentos usando la cepa condicional de ratón transgénico que sobre-expresa

VISTA (cepa ratón transgénico de VISTA:

R26StopFLVISTA (VISTA).

Un constructo dirigido que contiene el ADNc completo de VISTA precedido por un casete de terminación flanqueado por loxP, se dirigió dentro del locus

ROSA26 expresado omnipresente. Múltiples crías correctamente dirigidas

R26StopFL/-Vista nacieron, y criaron en la cepa60 supresora CMV-Cre. Los datos preliminares en el VISTA x CMV-cre confirma a GFP y la expresión VISTA intensificada. Los estudios sobre el estado inmunitario de estos ratones (respuestas de células T al antígeno, títulos de anticuerpos, etc) confirmarán un fenotipo supresor. La cepa VISTA se entrecruzará con CD4-cre, CD11c-cre, y Lys-Cre a determinar si la localización del linaje de expresión de VISTA influye en la supresión. El fenotipo y función de las células T se determinan también si la sobreexpresión de VISTA resulta en la generación de aTreg. En estos estudios de 182

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Tregs a partir de la cepa OVA-cre inmune x VISTA se transfiere adoptivamente a los huéspedes WT, para ver si inmunización de antígeno en presencia de VISTA sobre-expresada induce Tregs antígeno-específica. Esto debe verificar que VISTA impacta en la diferenciación de Treg.

Además, los estudios se realizan en el modelo de EAE por medio del cual se evalúa el impacto de las proteínas de VISTA sobre diferentes linajes (por entrecruzamiento con CD4-, CD11c-, Lys-cre) con respecto al desarrollo de la enfermedad. Dado que la enfermedad se puede suprimir por el linaje de sobreexpresión restringida de mutantes VISTA o en el muíante CMV x VISTA el control temporal del desarrollo de la enfermedad es usando también Cre-ERT2x

VISTA .

A través de la administración de tamoxifeno podemos inducir la sobreexpresión de VISTA antes de, o en el inicio de la enfermedad o en el pico de la enfermedad para determinar si VISTA puede tener un efecto sobre la inducción y/o fases efectoras de la inmunidad. Usando ratones quiméricos BM, la sobreexpresión temporalmente-restringida de VISTA se puede restringir al compartimento hematopoyético. Durante una apreciación de controlar la ventana de tiempo VISTA se sobreexpresa, VISTA se activa genéticamente, entonces con la administración del AcM anti-VISTA se apaga serológicamente. Estos estudios determinarán dónde y cuándo VISTA tiene que actuar para controlar el desarrollo progresión de la enfermedad autoinmune.

EJEMPLO 17. Efecto de anticuerpos anti-VISTA en la vacuna agonista

CD40/TLR

Como se muestra en la Figura 22, se realizaron experimentos que ensayaron el efecto de los anticuerpos anti-VISTA en la eficacia de la vacuna. Estos resultados muestran que anti-VISTA mejora la eficacia terapéutica de una vacuna

CD40/TLR. Ratones C57BL/6 se desafiaron con 1x105 células de melanoma metastásico B16.F10 cuadrados por vía s.q. Cuatro días después, los ratones se vacunaron con 100 pg del antígeno AV asociado al tumor, 100 pg de aCD40

FGK45 (Anticuerpo agonístico de CD40) y 100 pg S-27609 (agonista de TLR7) con o sin anti- VISTA (20 ug x 3/semana). El crecimiento de tumor se monitoreó mediante mediciones de calibrador.

o

U1

183 £

IMPI o en

Teniendo descrita la invención se proporcionan las siguientes reivindicaciones. Estas reivindicaciones pretenden cubrir todas las características genéricas y específicas descritas en la presente invención, y todas las declaraciones del alcance que, que en materia de lenguaje, se puede decir que caen entre las mismas.