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JP5778077B2

Mutant citrobacter freundii phytase polypeptide

Abstract

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JP5778077B2, drawing sheet 1
Sheet 1 of 19

Term

Projected expiry 17 May 2032.

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  5. Projected expiry

16 claims: 13 independent, 3 dependent

  1. 1
    A phytase comprising an amino acid sequence having at least 90% identity to SEQ ID NO:3, wherein the phytase is mutant D53N when numbered according to SEQ ID NO: 3./ D57Y / M152VPhytase, includingAndThePhytase has increased thermal stability compared to the polypeptide having the sequence set forth in SEQ ID NO: 3.。 配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、フィターゼであって、該フィターゼは、配列番号3に従って番号付けした場合の変異D53N/D57Y/M152Vを含む、フィターゼであって、該フィターゼが、配列番号3に示される配列を有するポリペプチドと比較して増加した熱安定性を有する、フィターゼ。
  2. 4
    Claim 1 ~3An isolated nucleic acid molecule encoding the phytase according to any one of the above. 請求項1~3のいずれか1項に記載のフィターゼをコードする単離された核酸分子。
  3. 5
    Claim 1 ~3A plasmid or vector system containing the nucleic acid encoding the phytase described in any one of the above. 請求項1~3のいずれか1項に記載されるフィターゼをコードする核酸を含むプラスミドまたはベクター系。
  4. 6
    Claim4Claimed, comprising an isolated nucleic acid molecule comprising the nucleic acid molecule set forth in the above or the sequence set forth in SEQ ID NO:2, or a sequence having at least 90% identity to these.5The plasmid or vector system described in. 請求項4に記載の核酸分子または配列番号2に示される配列を含む単離された核酸分子、あるいは、これらに対して少なくとも90%の同一性を有する配列を含む、請求項5に記載のプラスミドまたはベクター系。
  5. 7
    Claim that the plasmid or vector system is an expression vector for expression of the respective phytase enzyme or homolog, modified, functional equivalent or effective fragment thereof in a host cell or microorganism.5Or6The plasmid or vector system described in. 前記プラスミドまたはベクター系が、宿主細胞または微生物中において、それぞれのフィターゼ酵素またはそのホモログ、改変型、機能的な等価物もしくは有効なフラグメントの発現のための発現ベクターである、請求項5または6に記載のプラスミドまたはベクター系。
  6. 8
    Claim5~7Host cells transformed or transfected with any of the plasmids or vector systems described in. 請求項5~7のいずれかに記載のプラスミドまたはベクター系で形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞。
  7. 9
    Claim8The host cell described inTheThe host cell is B. subtilisandE.coliSelected from the group consisting ofBacteria, And, H.polymorpha, S.pombeandS. cerevisiaeSelected from the group consisting ofFungi containing yeastMicroorganisms includingThe host cell from which it is derived. 請求項8に記載の宿主細胞であって、該宿主細胞が、B.subtilisおよびE.coliからなる群より選択される細菌、ならびに、H.polymorpha、S.pombeおよびS.cerevisiaeからなる群より選択される酵母を含む真菌を含む微生物由来である、宿主細胞。
  8. 10
    Claim that the microorganism is a prokaryotic bacterial cell9The host cell according to. 前記微生物が原核生物細菌細胞である請求項9に記載の宿主細胞。
  9. 11
    Claim 1 that the prokaryotic bacterial cell is E. coli.0The host cell according to. 前記原核生物細菌細胞がE.coliである、請求項10に記載の宿主細胞。
  10. 12
    A method for producing phytase, wherein the method is claimed 1 to.3A method comprising the step of expressing the phytase according to any one of the above items in a host cell and the step of separating the phytase from the host cell culture medium. フィターゼを産生する方法であって、該方法は、請求項1~3のいずれか1項に記載のフィターゼを宿主細胞中で発現する工程と、該宿主細胞培養培地から該フィターゼを分離する工程とを包含する、方法。
  11. 13
    Claim 1 ~3A food or animal feed composition containing the phytase according to any one of the above. 請求項1~3のいずれか1項に記載されるフィターゼを含む食物または動物飼料組成物。
  12. 14
    Claim 1 ~ in food or animal feed3Use of the phytase according to any one of the above. 食物または動物の飼料中における請求項1~3のいずれか1項に記載のフィターゼの使用。
  13. 16
    Phytase having an amino acid sequence having at least 90% identity to SEQ ID NO:3 and having improved thermal stability compared to SEQ ID NO: 3 when determined by measuring the inactivation temperature. The inactivation temperature is a temperature at which the residual activity is 50% of the residual activity after incubation at room temperature under the same conditions for the same period of time, and the residual activity is a specific temperature. 2 mM phytase and 0.8 mM CaCl in 200 mM sodium acetate buffer pH 3.5 for 1 hour at2The reaction mixture was determined by incubating the reaction mixture, and after that time, measuring the phosphate released by adding 200 μl of freshly prepared AMM solution to the reaction mixture, the AMM solution being 1: 1 7.5NH with a ratio of: 22SO4, 15 mM ammonium molybate and acetone, where the absorbance at 390 nm was measured after 10 minutes and before 30 minutes after the addition of the AMM reagent, and the amount of phosphate. Determined by creating a calibration curve with a known concentration of phosphate solution、The phytase comprises the mutant D53N / D57Y / M152V when numbered according to SEQ ID NO: 3., Phytase. 配列番号3に対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を有し、不活性化温度を測定することによって決定した場合に、配列番号3と比較して向上された熱安定性を有するフィターゼであって、該不活性化温度は、残留活性が、室温で同じ条件下で同じ期間にわたってインキュベーションした後の残留活性と比較して50%である温度であり、 該残留活性は、特定の温度にて1時間、200mM 酢酸ナトリウム緩衝液pH3.5中の2mM フィチン酸塩および0.8mM CaCl2の反応混合物をインキュベートし、その時間の後、新たに調製したAMM溶液200μlを該反応混合物に添加することによって放出されたリン酸塩を測定することによって決定され、該AMM溶液は、1:1:2の比の7.5N H2SO4、15mM モリブデン酸アンモニウムおよびアセトンから構成され、 ここで、該AMM試薬の添加後、10分より後でかつ30分より前に、390nmでの吸光度が測定され、そして、リン酸塩の量が、既知濃度のリン酸塩溶液を用いて検量線を作成することによって決定され、該フィターゼは、配列番号3に従って番号付けした場合の変異D53N/D57Y/M152Vを含む、フィターゼ。
Independent claims13