Dll3 modulators and methods of use

The present application relates mainly to novel compounds, compositions and methods of their use in the diagnosis, prevention, treatment or alleviation of proliferative disorders and any their expansion, recurrence, relapse or metastasis. In a broad aspect, the present disclosure relates to the use of delta 3 like (DLL3) ligand modulators, including anti-DLL3 antibodies and fusion constructs, for the treatment, diagnosis or prophylaxis of neoplastic disorders. Selected examples of the present disclosure provide the use of such DLL3 modulators, including antibody-drug conjugates, for immunotherapeutic treatment of tumors, preferably involving a reduction in the frequency of tumor cell initiation.

BACKGROUND OF THE INVENTION [0002] Differentiation of stem cells and progenitor cells and cell proliferation are normal processes that work together to promote tissue growth during the organ formation process, as well as cell exchange and repair of most tissues throughout the life of all living organisms. In the normal course of events, cell differentiation and proliferation are controlled by many factors and signals, which are usually balanced to maintain the decision about cell fate and tissue structure. To a large extent it is a controlled microenvironment that regulates cell division and maturation of tissues, where signals are correctly generated based on the body's needs. Therefore, cell proliferation and differentiation normally occurs only when needed to replace damaged or dying cells or growth. Unfortunately, the disruption of cell proliferation and / or differentiation may result from a myriad of factors including, for example, deficiency or excess of various signaling chemicals, the presence of altered microenvironments, genetic mutations, or some combination thereof. When normal cell proliferation and / or differentiation are affected or somehow disrupted, this can lead to various diseases or disorders, including proliferative disorders such as cancer. a deficiency or excess of various signaling chemicals, the presence of altered microenvironments, genetic mutations or some combination thereof. When normal cell proliferation and / or differentiation are affected or somehow disrupted, this can lead to various diseases or disorders, including proliferative disorders such as cancer. a deficiency or excess of various signaling chemicals, the presence of altered microenvironments, genetic mutations or some combination thereof. When normal cell proliferation and / or differentiation are affected or somehow disrupted, this can lead to various diseases or disorders, including proliferative disorders such as cancer.

[0003] Conventional cancer therapies include chemotherapy, radiotherapy, surgery, immunotherapy (e.g., biological response modifiers, vaccines or targeted therapeutic agents) or combinations thereof. Unfortunately, for such therapies certain cancers do not react or react minimally. For example, in some patients, tumors display gene mutations that cause them to not respond despite the overall effectiveness of selected therapies. Furthermore, depending on the type of cancer and the form it adopts, some available therapies, such as surgery, may not be feasible alternatives. The limitations inherent in therapeutic measures that are consistent with the current standard of care are particularly evident when trying to treat patients who have undergone previous treatments and who have subsequently relapsed. In such cases, ineffective therapeutic regimes and the consequent deterioration of the patient's condition may contribute to resistant tumors, which often manifest themselves as a relatively aggressive disease, which ultimately turns out to be incurable. Although in recent years there has been a significant improvement in the diagnosis and treatment of cancer, the overall survival rates of patients with multiple solid tumors have remained largely unchanged due to the failure of existing therapies to prevent relapse, recurrence and metastasis. Therefore, the challenge is to develop more targeted and strong therapies for proliferative disorders. which often manifest themselves as a relatively aggressive disease that ultimately turns out to be incurable. Although in recent years there has been a significant improvement in the diagnosis and treatment of cancer, the overall survival rates of patients with multiple solid tumors have remained largely unchanged due to the failure of existing therapies to prevent relapse, recurrence and metastasis. Therefore, the challenge is to develop more targeted and strong therapies for proliferative disorders. which often manifest themselves as a relatively aggressive disease that ultimately turns out to be incurable. Although in recent years there has been a significant improvement in the diagnosis and treatment of cancer, the overall survival rates of patients with multiple solid tumors have remained largely unchanged due to the failure of existing therapies to prevent relapse, recurrence and metastasis. Therefore, the challenge is to develop more targeted and strong therapies for proliferative disorders. tumor recurrence and metastasis. Therefore, the challenge is to develop more targeted and strong therapies for proliferative disorders. tumor recurrence and metastasis. Therefore, the challenge is to develop more targeted and strong therapies for proliferative disorders.

EP 2 817 338 B1

WO2011 / 093097 relates to an anti-DLL3 antibody. An anti-cancer agent containing the antibody is provided.

SUMMARY OF THE INVENTION [0004] The invention is defined by the aid of the claims.

[0005] These and other objects are provided in the present disclosure, which broadly refers to methods, compounds, compositions and articles of manufacture that can be used to treat disorders associated with DLL3 (e.g., proliferative disorders or cancer disorders). Finally, the present disclosure provides new modulators similar to delta ligand 3 (i.e. DLL3) that are effectively targeted to cancer cells and / or cancer stem cells and can be used to treat patients suffering from a wide variety of cancers. As will be discussed in detail herein, there are at least two naturally occurring isoforms or DLL3 variants, and the disclosed modulators may include or selectively associate with one or other isoforms or both. Also, in certain embodiments, the disclosed DLL3 modulators may further react with one or more members of the DLL family (e.g., DLL1 or DLL4) or, in other embodiments, may be produced and selected to associate or respond only to one or more DLL3 isoforms. In any case, modulators may be any compound that recognizes, competes, agonizes, antagonizes, interacts with, binds to or binds to the genotypic or phenotypic determinant of DLL3 (or a fragment thereof) and modulates, adjusts, alters, regulates, alters or modifies the effects of protein. DLL3 on one or more physiological pathways and / or eliminates cells associated with DLL3. Thus, in broad terms, this disclosure typically relates to isolated DLL3 modulators and their uses. In preferred cases, the disclosure more specifically relates to isolated DLL3 modulators constituting antibodies (i.e., antibodies that immunopreferentially bind, react with or associate with at least one DLL3 isoform) that are in particular preferred to be bound or conjugated to one or more agents cytotoxic. In addition, as discussed further below, such modulators can be used to provide pharmaceutical compositions useful in the prophylaxis, diagnosis or treatment of proliferative disorders, including cancer. which in particularly advantageous cases are associated or conjugated with one or more cytotoxic agents. In addition, as discussed further below, such modulators can be used to provide pharmaceutical compositions useful in the prophylaxis, diagnosis or treatment of proliferative disorders, including cancer. which in particularly advantageous cases are associated or conjugated with one or more cytotoxic agents. In addition, as discussed further below, such modulators can be used to provide pharmaceutical compositions useful in the prophylaxis, diagnosis or treatment of proliferative disorders, including cancer.

[0006] In selected cases of the disclosure, DLL3 modulators may be a DLL3 polypeptide or fragments thereof, either in isolated form or fused or linked to other moieties (e.g., Fc-DLL3, PBG-DLL3 or DLL3 linked to a targeting moiety). In other selected cases, the DLL3 modulators may be DLL3 antagonists who for the purposes of the present application will be considered to designate any construct or compound that recognizes, competes, interacts with, binds to or binds to DLL3 and neutralizes, eliminates, reduces, sensitizes, reprograms, inhibits or controls the growth of cancer cells, including cancer-initiating cells. In preferred cases, the DLL3 modulators of the present disclosure are anti-DLL3 antibodies or fragments thereof, or derivatives thereof, surprisingly found to silence, they neutralize, reduce, deplete, deplete, alleviate, weaken, reprogram, eliminate or otherwise inhibit the ability of cancer-initiating cells to multiply, sustain, proliferate, proliferate or otherwise facilitate the survival, relapse, regeneration and / or metastasis of tumor cells. In particularly preferred cases, the antibodies or immunoreactive fragments may be joined or conjugated to one or more anti-cancer agents (e.g., a cytotoxic agent).

[0007] With respect to such modulators, it will be appreciated that compatible antibodies can take any number of forms including, for example, polyclonal and monoclonal antibodies, chimeric antibodies, CDR-grafted, humanized and human antibodies, and immunoreactive fragments, and or variants of each of the above. Preferred embodiments will include antibodies that are relatively non-immunogenic, such as humanized or fully human constructs. Of course, in the light of the present disclosure, those skilled in the art could easily identify one or more complementarity determining regions (CDRs) fused to the heavy and light chain variable regions of DLL3 modulators and use these CDRs to design or make chimeric antibodies, humanized or CDR-implanted without undue experimentation. Accordingly, in certain preferred cases, the DLL3 modulator is an antibody that combines one or more complementarity determining regions (CDRs) as defined in FIG. 11A and 11B and derived from the variable regions of mouse mouse light chains (FIG. 11A) or heavy chains (FIG. 11B) (SEQ ID NOS: 20-203) as shown therein. Such variable regions with CDR implanted are also shown in FIG. 11, comprising SEQ ID NO: 204-213. In preferred cases, such antibodies will be monoclonal antibodies, and even more preferably will be chimeric, CDR-grafted or humanized antibodies. in certain preferred cases, the DLL3 modulator is an antibody that combines one or more complementarity determining regions (CDRs) as defined in FIG. 11A and 11B and derived from the variable regions of mouse mouse light chains (FIG. 11A) or heavy chains (FIG. 11B) (SEQ ID NOS: 20-203) as shown therein. Such variable regions with CDR implanted are also shown in FIG. 11, comprising SEQ ID NO: 204-213. In preferred cases, such antibodies will be monoclonal antibodies, and even more preferably will be chimeric, CDR-grafted or humanized antibodies. in certain preferred cases, the DLL3 modulator is an antibody that combines one or more complementarity determining regions (CDRs) as defined in FIG. 11A and 11B and derived from the variable regions of mouse mouse light chains (FIG. 11A) or heavy chains (FIG. 11B) (SEQ ID NOS: 20-203) as shown therein. Such variable regions with CDR implanted are also shown in FIG. 11, comprising SEQ ID NO: 204-213. In preferred cases, such antibodies will be monoclonal antibodies, and even more preferably will be chimeric, CDR-grafted or humanized antibodies. 11A and 11B and derived from the variable regions of mouse mouse light chains (FIG. 11A) or heavy chains (FIG. 11B) (SEQ ID NOS: 20-203) as shown therein. Such variable regions with CDR implanted are also shown in FIG. 11, comprising SEQ ID NO: 204-213. In preferred cases, such antibodies will be monoclonal antibodies, and even more preferably will be chimeric, CDR-grafted or humanized antibodies. 11A and 11B and derived from the variable regions of mouse mouse light chains (FIG. 11A) or heavy chains (FIG. 11B) (SEQ ID NOS: 20-203) as shown therein. Such variable regions with CDR implanted are also shown in FIG. 11, comprising SEQ ID NO: 204-213. In preferred cases, such antibodies will be monoclonal antibodies, and even more preferably will be chimeric, CDR-grafted or humanized antibodies.

[0008] Exemplary nucleic acid sequences encoding each amino acid sequence shown in FIG. 11A and 11B are appended to the present sequence listing and include SEQ ID NOS: 220 to 413. In this context, it should be noted that the disclosure further comprises nucleic acid molecules (and associated constructs, vectors and host cells) encoding the disclosed amino acid sequences of the variable regions. antibodies, including those shown in the attached sequence list. More specifically, in selected cases, compatible DLL3 modulators may be an antibody having a light chain variable region and a heavy chain variable region,

EP 2 817 338 B1

SEQ ID NO: 135, SEQ ID NO: 137, SEQ ID NO: 139, SEQ ID NO: 141, SEQ ID NO: 143, SEQ ID NO: 145, SEQ ID NO: 147, SEQ ID NO: 149, SEC NO. ID: 151, SEQ ID NO: 153, SEQ ID NO: 155, SEQ ID NO: 157, SEQ ID NO: 159, SEQ ID NO: 161, SEQ ID NO: 163, SEQ ID NO: 165, SEQ ID NO: 167, SEQ ID NO: 169, SEQ ID NO: 171, SEQ ID NO: 173, SEQ ID NO: 175, SEQ ID NO: 177, SEQ ID NO: 179, SEQ ID NO: 181, SEQ ID NO: 183, SEQ ID NO: 185, SEQ ID NO: 187, SEQ ID NO: 189, SEQ ID NO: 191, SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 197, SEQ ID NO: 199, SEC NO. ID: 201 and SEQ ID NO: 203. In other preferred cases, the selected modulators will comprise heavy and light chain variable regions that have 65, 70, 75 or 80% identity with the above-mentioned mouse sequences. In still other cases, modulators will contain variable regions of the heavy and light chains,

[0009] In other preferred cases, the selected modulators will comprise one or more CDRs obtained from any of the above amino acid sequences of the light and heavy chain variable region. Accordingly, selected instances of disclosure include a DLL3 modulator comprising one or more CDRs from any of the SEQ ID NO; 20 to 203. In still other instances, the modulators of the present disclosure comprise any antibody or immunoreactive fragment thereof that competes for binding to any of the above modulators.

[0010] Another forfeiture of the disclosure includes modulators obtained or derived from SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, S16.15, Sic16. .18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35 .

SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52,

SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68,

SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103,

SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113,

SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123,

SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134,

SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143,

SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 and SC16.150. In other cases, the disclosure will include a DLL3 modulator having one or more CDRs from any of the above-mentioned modulators.

[0011] In yet other compliant cases, the present disclosure will comprise DLL3 implants with CDR grafted or humanized hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 and hSC16.56. Still other cases are directed to a DLL3 modulator comprising a humanized antibody, wherein the humanized antibody comprises a light chain variable region and a heavy chain variable region which light chain variable region comprises an amino acid sequence having at least 60% of the light chain variable region.

Identification with an amino acid sequence selected from the group consisting of amino acid sequences as set forth in SEQ ID NO: 204, SEQ ID NO: 206, SEQ ID NO: 208, SEQ ID NO: 210 and SEQ ID NO: 212 and wherein said heavy chain variable region comprises an amino acid sequence having at least 60% identity with an amino acid sequence selected from the group consisting of the amino acid sequences set forth in SEQ ID NO: 205, SEQ ID NO: 207, SEQ ID NO: 209, SEQ ID NO: : 211 and SEQ ID NO: 213. Furthermore, as described immediately above, the nucleic acid sequences encoding the humanized heavy and light chain variable regions are provided in the accompanying sequence listing as SEQ ID NOs: 404-413.

In addition to the above-mentioned aspects, other preferred embodiments of the disclosure will include DLL3 modulators linked to or conjugated with one or more drugs to provide modulator conjugates that may be particularly effective in the treatment of proliferative disorders (alone or in combination with other pharmaceutically active agents) . More generally, when the modulators of the disclosure have been made and selected, they can be fused to, fused from, conjugated with (e.g., covalently or non-covalently) or otherwise linked to pharmaceutically active or diagnostic moieties or biocompatible modifiers. As used herein, the term "conjugate" or "modulator conjugate" or "antibody conjugate" will be widely used and mean any biologically active or detectable molecule or drug linked to the disclosed modulators regardless of the combination method. In this context, it should be understood that such conjugates may, in addition to the disclosed modulators, comprise peptides, polypeptides, proteins, a prodrug that are metabolized to the active agent in vivo, polymers, nucleic acid molecules, small molecules, binding agents, mimetic agents, synthetic drugs, inorganic molecules, organic molecules and radioactive isotopes. Furthermore, as indicated above, the selected conjugate may be covalently or non-covalently linked to or associated with a modulator and exhibit different stoichiometric molar ratios depending on, at least in part, the method used to carry out the conjugation.

[0013] Particularly preferred aspects of the present invention include antibody-modulator conjugates or antibody-drug conjugates that can be used to diagnose and / or treat proliferative disorders. Such conjugates can be represented by the formula M- [LD] n, wherein M is a disclosed modulator or target binding moiety, L is an optional linker or linker unit, D is a compatible drug or prodrug, and n is an integer from about 1 to about 20. note that unless otherwise stated in the context, the terms "antibody-drug conjugate" or "ADC" or the formula M- [LD] n will include conjugates containing both therapeutic and diagnostic moieties. In such cases, the antibody-drug conjugates will typically contain anti-DLL3 as a modulator unit (M), a therapeutic or diagnostic moiety (D) and optionally a linker (L) that combines the drug and an antigen binding agent. In a preferred embodiment, the antibody is DLL3 mAb comprising at least one CDR from heavy and light chain variable regions as described above.

[0014] As previously indicated, one aspect of the invention may involve the unexpected therapeutic combination of DLL3 polypeptides with cancer stem cells. Thus, in some other cases, the disclosure will include a DLL3 modulator that reduces the frequency of cancer-initiating cells after administration to the patient. Preferably, the frequency reduction will be determined using in vitro or in vivo limited restriction analysis. In particularly preferred

In some cases, such analysis may be carried out using in vivo dilution analysis, which includes the transplantation of live human tumor cells to immune-compromised mice (e.g., see Example 17 below). Alternatively, limiting dilution analysis may be performed using in vitro dilution analysis, involving the deposition into limited dilutions of live human tumor cells under in vitro colony maintenance conditions. In both cases, the analysis, calculation or quantification of the frequency reduction will preferably include the use of Poisson distribution statistics to ensure accurate accounting. It should be noted that although such quantification methods are beneficial, other, less labor-intensive methodologies may also be used, such as flow cytometry or immunohistochemistry to provide desirable values ​​and are thus clearly considered to be within the scope of the present disclosure. In such cases, the frequency reduction may be determined using flow cytometric analysis or immunohistochemical detection of tumor cell surface markers known to enrich tumor-initiating cells.

[0015] As such, another preferred case according to the present disclosure includes a method of treating a DLL3 related disorder comprising administering to a patient in need thereof a therapeutically effective amount of the DLL3 modulator, thereby the frequency of the cancer initiating cell being reduced. Preferably, the disorder associated with DLL3 includes a neoplastic disorder. Again, reducing the frequency of cancer-initiating cells will preferably be determined using in vitro or in vivo dilution analysis.

In this context, it should be noted that the present invention is based, at least in part, on the discovery that DLL3 immunogens are therapeutically associated with tumor-fixing cells (i.e., cancer stem cells) that participate in the etiology of various proliferative disorders, including cancer . More specifically, the present application surprisingly shows that administration of various exemplary DLL3 modulators may mediate, reduce, deplete, inhibit or eliminate tumor signaling by tumor-initiating cells (i.e., reduce the frequency of cancer-initiating cells). This reduced signaling, whether by depleting, neutralizing, reducing, eliminating, reprogramming or silencing the cancer-initiating cells or by modifying the morphology of the tumor cells (e.g.

[0017] In addition to the aforementioned association with cancer stem cells, there is evidence that the DLL3 isoforms may be associated with an increase, recurrence or metastatic potential of tumors comprising or displaying neuroendocrine traits or determinants (genotypic or phenotypic). For purposes of the present invention, such tumors include neuroendocrine tumors and alleged neuroendocrine tumors. Intervention in the proliferation of such cancer cells using the new DLL3 modulators described herein can thus ameliorate or treat the disorder by more than one mechanism (e.g., reducing the number of tumor-initiating cells and disrupting the oncogenic signaling pathway) to provide an additive or synergistic effect. Still other beneficial cases may use cellular internalization of the DLL3 cell surface protein to provide an anti-cancer agent mediated by the modulator. In this context, it should be noted that the present disclosure is not limited by any specific disclosure

However, it encompasses a broad application of the disclosed modulators in the treatment of disorders associated with DLL3 (including various cancers).

[0018] Thus, in other instances, the present disclosure will involve the use of the disclosed modulators for the treatment of neuroendocrine neoplasms in a patient in need thereof. Of course, the same modulators can be used for prophylaxis, prognosis, diagnosis, theragnosis, inhibition or maintenance treatment of the same cancers.

[0019] Other aspects of the disclosure utilize the ability of the disclosed modulators to potentially interfere with oncogenic pathways (e.g., Notch), while at the same time quieting cancer-initiating cells. Such multi-active DLL3 modulators (e.g., DLL3 antagonists) can be particularly effective when used in combination with standard anticancer agents or tumor removers. Accordingly, the preferred cases of the present disclosure include the use of the disclosed modulators as anti-metastases for maintenance treatment after initial treatments. In addition, two or more DLL3 antagonists (e.g., antibodies specifically binding to two distinct epitopes on DLL3) may be used in a combination according to the teachings herein. In addition, as discussed in detail below, DLL3 modulators according to the present disclosure, can be used in a combined or unprescribed state and possibly as a sensitiser in combination with various chemical or biological anticancer agents. [0020] Accordingly, another preferred case according to the present disclosure includes a method for sensitizing a patient's tumor to treatment with an anti-cancer agent, comprising the step of administering to said patient a DLL3 modulator. Other cases include a method of reducing metastasis or tumor relapse following treatment comprising administering a DLL3 modulator to a patient in need thereof. In a particularly preferred embodiment, according to the disclosure, the DLL3 modulator will reduce the frequency of the tumor initiating cells as determined using in vitro or in vivo limiting dilution studies. they may be used in a combined or unprotected state and optionally as a sensitiser in combination with various chemical or biological anticancer agents. [0020] Accordingly, another preferred case according to the present disclosure includes a method for sensitizing a patient's tumor to treatment with an anti-cancer agent, comprising the step of administering to said patient a DLL3 modulator. Other cases include a method of reducing metastasis or tumor relapse following treatment comprising administering a DLL3 modulator to a patient in need thereof. In a particularly preferred embodiment, according to the disclosure, the DLL3 modulator will reduce the frequency of the tumor initiating cells as determined using in vitro or in vivo limiting dilution studies. they may be used in a combined or unprotected state and optionally as a sensitiser in combination with various chemical or biological anticancer agents. [0020] Accordingly, another preferred case according to the present disclosure includes a method for sensitizing a patient's tumor to treatment with an anti-cancer agent, comprising the step of administering to said patient a DLL3 modulator. Other cases include a method of reducing metastasis or tumor relapse following treatment comprising administering a DLL3 modulator to a patient in need thereof. In a particularly preferred embodiment, according to the disclosure, the DLL3 modulator will reduce the frequency of the tumor initiating cells as determined using in vitro or in vivo limiting dilution studies.

[0021] More generally, preferred embodiments of the disclosure include a method of treating a DLL3 related disorder in a patient in need thereof, including the step of administering to the patient a DLL3 modulator. In particularly preferred cases, the DLL3 modulator will be bound (e.g., conjugated) to the anti-cancer agent. In still other cases, the DLL3 modulator will internalize after connecting or binding to DLL3 on or near the cell surface. In addition, the preferred aspects of the present invention, including any signal transduction disruption and safety benefits, can be achieved whether the patient's tumor tissue under investigation exhibits elevated DLL3 levels or reduced or decreased DLL3 levels as compared to normal adjacent tissue.

[0022] In still another case, the present disclosure will comprise a method of treating a patient suffering from a neoplastic disorder, comprising the step of administering a therapeutically effective amount of at least one internalizing DLL3 modulator. Preferred cases will include the administration of internalizing antibody modulators, wherein the modulators are conjugated or bound to a cytotoxic agent.

[0023] Other cases are directed to a method of treating a patient suffering from a DLL3 related disorder comprising the step of administering a therapeutically effective amount of at least one depleting DLL3 modulator.

[0024] In still another case, the present disclosure provides methods of maintenance treatment in which the disclosed effectors or modulators are administered over a period of time after the initial treatment (e.g., administration of chemotherapeutics, irradiation or surgery), designed to remove at least one treatment. part of the tumor mass. Such therapeutic maintenance regimens may be administered over a period of weeks, a period of months or even years in which DLL3 modulators may act prophylactically to inhibit tumor metastasis and / or recurrence. In yet other cases, the disclosed modulators can be administered along with known schemes for complete tumor removal to prevent or delay metastasis, support or resumption of tumorigenesis.

[0025] As previously referred to the DLL3 modulators of the present disclosure, they may be produced and / or selected to react with both DLL3 isoforms or a single protein isoform, or vice versa, may include a pan-DLL modulator that reacts or associates with at least one one additional member of the DLL family in addition to DLL3. More specifically, preferred modulators, such as antibodies, can be produced and selected to react with domains (or epitopes located therein) that are only displayed by DLL3 or with domains that are at least partially conserved by many or all of them. members of the DLL family.

[0026] In yet other preferred cases, the modulators will connect to or bind to a particular epitope, part, motif or domain of DLL3. As will be discussed in more detail below, the DLL3 isoforms contain an identical extracellular region (see FIG 1F) containing at least a N-terminal domain, a DSL domain (Delta / Setrate / lag-2) and six EGF-like domains (i.e., EGF1-EGF6). Accordingly, in some cases the modulators will bind to or link to the N-terminal domain of DLL3 (i.e., amino acids 27-175 in the mature protein), while in other selected cases the modulators will bind to the DSL domain (i.e., amino acids 176 - 215) or with an epitope in it. Other instances of the present disclosure include modulators that bind to or bind to a particular epitope located in a specific EG3-like DLL3 domain. In this context, a particular modulator may combine to bind to an epitope located in EGF1 (amino acids 216-249), EGF2 (amino acids 274-310), EGF3 (amino acids 312-351), EGF4 (amino acids 353-389), EGF5 (amino acids 391 -427) or EGF6 (amino acids 429-465). Of course, it will be understood that each of the above-mentioned domains may contain more than one epitope and / or more than one group of epitopes (bin). In particularly preferred cases, the disclosure will comprise a modulator that binds, reacts to or binds to the DSL domain or to an epitope contained therein. In other preferred cases, the disclosure will include modulators that bind, react or associate with a specific EGF-like domain or epitope contained therein. In still other preferred cases, modulators will bind,

[0027] With reference to the "bin" modulator or antibody, it should be noted that the DLL3 antigen can be analyzed or mapped by competing antibody binding using techniques known in the art to determine specific epitope groups located on or along the protein . As discussed in more detail herein and shown in Examples 9 and 10 below, two antibodies (one of which may be referred to as "reference antibody", "bin delineating antibody" or "target antibody"). delineating antibody)) can be considered to be in the same epitope group if they compete with each other to bind to the target antigen.

In a linear sense, when they are separated by several amino acids or conformationally), so that both antibodies are sterically or electrostatically inhibited or excluded from binding to the antigen. Such defined groups of antibodies may be generally associated with certain DLL3 domains (e.g., the reference antibody will bind to an epitope contained within a particular domain), although the correlation is not always accurate (e.g., there may be more than one group of epitopes in the domain or group of epitopes may be be conformationally defined and contain more than one domain). It should be noted that those skilled in the art can easily determine the relationship between the DLL3 domains and the empirically defined epitope groups.

[0028] With reference to the present disclosure, a competitive binding analysis using techniques known in the art (e.g., ELISA, surface plasmon resonance or biospheric layer interferometry) determines at least nine different epitope groups each comprising a plurality of antibody modulators. For the purposes of this disclosure, nine epitope groups have been designated as a group of epitopes A to a group of epitopes I. In this case, in selected cases, the present disclosure will comprise a modulator residing in an epitope group selected from the group consisting of epitope group A, epitope group B, epitope group C , epitope group D, epitope group E, epitope group F, epitope group G, epitope group H and epitope group I.

SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29,

SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45,

SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62,

SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81,

SC16.94, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16. 113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16. 141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 and SC16.150. In still other cases, the disclosure will include modulators from the epitope group A, modulators from the epitope group B, modulators from the epitope group C, modulators from the epitope group D, modulators from the epitope group E, modulators from the epitope group F, modulators from the epitope group G, modulators from H epitope group or modulators from the epitope group I.

[0029] The term "competing" or "competing antibody" used in the context of the disclosed modulators means a competitive binding between antibodies as determined in an assay in which the reference antibody or immunologically functional fragment substantially prevents or inhibits (e.g., more than 40% 45% , 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85% or 90%) specific binding of the tested antibody to a common antigen. Compatible methods for determining such competition include techniques known in the art, such as, for example, biological layer interferometry, surface plasmon resonance, flow cytometry, competitive ELISA, etc.

[0030] In addition to the modulators mentioned above, in selected cases the disclosure includes a pan-DLL modulator that connects to DLL3 and at least one other member of the DLL family. In other selected cases, the disclosure includes a DLL3 modulator that immunospecifically combines with one

Or more with the DLL3 isoform, but do not immunospecifically bind to any other member of the DLL family. In yet other instances, the present disclosure includes a method of treating a patient in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of a pan-DLL modulator. Still other cases include a method of treating a patient in need thereof, comprising administering a therapeutically effective amount of a DLL3 modulator that immunospecifically binds to one or more DLL3 isoforms, but does not immunospecifically bind to any other member of the DLL family.

[0031] In addition to the therapeutic applications discussed above, it should also be appreciated that the modulators of the present disclosure can be used to detect, diagnose or classify disorders related to DLL3, in particular proliferative disorders. They can also be used in the prognosis and / or the therapy of such disorders. In some cases, the modulator may be administered to the patient and detected or monitored in vivo. Those skilled in the art will appreciate that such modulators may be labeled or combined with effectors, markers or reporters as disclosed below and detected using any of a variety of standard techniques (e.g., MRI, computed tomography, positron emission tomography, etc.).

[0032] Thus, in some instances, the disclosure will encompass a method for diagnosing, detecting or monitoring an in vivo DLL3 related disorder in a patient in need thereof, including the step of administering the DLL3 modulator.

[0033] In other cases, modulators may be used in in vitro diagnostics using procedures known in the art (e.g., immunohistochemistry, otherwise IHC). As such, the preferred case includes a method of diagnosing a hyperproliferative disorder in a patient in need thereof, comprising the steps of:

a. receiving a tissue sample from the patient;

b. contacting a tissue sample with at least one DLL3 modulator; and

c. detecting or quantifying the DLL3 modulator connected to the sample.

[0034] Such methods can be readily recognized in connection with the present application and can be easily performed using commonly available commercial technology such as automatic plate readers, dedicated reporter systems, etc. In selected cases, the DLL3 modulator will be associated with tumor immortalizing cells (e.g. cancer stem cells) present in the sample. In other preferred cases, the detecting or quantifying step will include reducing the frequency of the tumor-initiating cells that may be monitored as described herein.

[0035] In a similar form, the present disclosure also provides kits or devices and related methods useful for diagnosing and monitoring disorders related to DLL3, such as cancer. To this end, the present disclosure advantageously provides a factory article useful for detecting, diagnosing or treating disorders related to DLL3, comprising a container containing a DLL3 modulator and instructional materials for using said DLL3 modulator to treat, monitor or diagnose a DLL3 related disorder. In selected cases, the devices and associated methods will include a step of contacting at least one circulating cancer cell.

Other preferred embodiments of the disclosure also use the properties of the disclosed modulators as a tool useful for identifying, characterizing, isolating, cross-sectioning or enriching a population or subpopulation of cancer-initiating cells through such

Methods such as immunohistochemistry, flow cytometry analysis, including fluorescence activated cell sorting (FACS) or laser-mediated sectioning.

[0037] As such a further preferred example of the present disclosure relates to a method for identifying, isolating, forming sections, or enriching a population of cancer initiating cells comprising the step of contacting said cancer initiating cells with a DLL3 modulator.

[0038] The above is a summary and thus contains, by necessity, simplification, generalization and omission of details; in this regard, those skilled in the art will appreciate that the summary is merely illustrative and should not be limiting in any way. Other aspects, descriptions and advantages of the methods, compositions and / or devices and / or other items of the application described herein will become apparent in the instructions described herein. The summary is provided to introduce the concept selection in a simplified form, which is described in detail in the Detailed Description below. This summary is not intended to identify key features or essential features of proprietary objects, nor is it intended to be used to determine the scope of the claimed subject matter.

BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES [0039]

FIG. 1A-1F are different representations of DLL3, including nucleic acid or amino acid sequences, in which full-length mRNAs containing ORFs (underlining) encoding the DLL3 isoforms are shown in FIG. 1A and 1B (SEQ ID NO: 1 and 2), FIG. 1C and 1D provide the translation of the ORFs depicted in FIG. 1A and 1B (SEQ ID NOS: 3 and 4, respectively), with underlined indicative transmembrane spanning domains for each protein isoform, Fig. 1E shows the alignment of two protein isoforms to illustrate sequence differences at the cytoplasmic ends each of the isoforms, the re-underlined residues indicate the predicted transmembrane domain, and Figure 1F provides a schematic representation of the extracellular region of the DLL3 protein illustrating the positions of the different domains;

FIG. 2A and 2B are tabulated representations of percent identity at the protein level between DLL3 and other members of the Delta-like family in the human genome (FIG 2A), or the nearest human DLL3 isoform and rhesus monkey DLL3 proteins, mouse and rat (FIGURE 2B);

FIG. 3 schematically illustrates genetic interactions between several "major" genes relevant for the selection of cell fates leading to neuroendocrine or non-neuroendocrine phenotypes (arrows indicating gene expression promotion and arrows denoting inhibition of gene expression) in which expression of the ASCL1 transcription factor both initiates the gene cascade (open arrow) ), leading to the neuroendocrine phenotype, while activating DLL3, which in turn suppresses NOTCH1 and its HES1 effector, both of which are usually responsible for the suppression of ASCL1 and the activation of gene cascades leading to the non-neurotransmine phenotype;

FIG. 4A and 4B are tabular (FIG 4A) and graphic (FIGURE 4B) depictions of DLL3 gene expression levels, and in FIG. 4A, other Notch pathway genes or genes associated with the neuroendocrine phenotype, are measured using total transcriptome RNA (SOLiD) sequencing derived from a subpopulation of tumor cells or normal tissues;

EP 2 817 338 B1

FIG. 5 is a graphical representation of the relative expression levels of the DLL3 1 and 2 mRNA transcription variants, determined by whole transcriptome sequencing (SOLiD) in selected non-traditional xenograft (NTX) tumors derived from lung cancers;

In FIG. 6A-6D shows gene expression data and clustering of neuroendocrine tumors, wherein in FIG. FIG. 6A shows the clustering of unscreened microarray profiles for 46 tumor lines and 2 normal tissues comprising selected tumors and normal control tissues, in FIG. 6B and 6C are presented tabular normalized intensity values ​​corresponding to the relative expression levels of selected genes associated with the neuroendocrine phenotypes (FIGURE 6B) or the Notch signaling pathway (FIGURE 6C), wherein the non-conceived cells and relatively low numbers indicate little to no expression, and darker numbers cells and relatively high numbers indicate higher expression levels, and FIG. 6D is a graphical representation showing the relative levels of HES6 mRNA expression in various tumors and normal tissues,

FIG. 7 is a graphical representation showing the relative expression levels of DLL3 transcripts as measured by qRT-PCR in various RNA samples isolated from normal tissues, primary uninfected patient tumor samples (labeled "p0") or NTX mass tumors derived from lung, kidney and ovarian tumors. wherein specific NTX lung tumors are grouped as small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer (NSCLC) (designated p1, p2, p3 or p4 to reflect the number of passages in the mouse) wherein the tumor type is labeled using the abbreviations shown above;

In FIG. 8A-8C are graphical representations showing relative (Figure 8A) or absolute (Figure 8B) levels of human DLL3 gene expression as measured by qRTPCR in whole tumor samples (gray dot) or matched to normal adjacent tissue (NAT, white dot) from patients with one of eighteen different types of solid tumor, while in FIG. 8C depicts the relative expression of the human DLL3 protein as measured using an electrochiluminescent sandwich type ELISA;

In FIG. 9 are provided graphical representations of the expression of surface protein based on flow cytometry of different Notch receptors and ligands (e.g., DLL1, DLL4) in individual populations of human tumor cells derived from NTX kidney tumors, ovaries and small cell lung, presented as histogram (black line) plots relating to to fluorescence minus one (FMO) dyed population with isotype control (full gray) with indicated mean fluorescence intensities (MFI);

FIG. 10A-10D respectively provide the cDNA sequence (FIGURE 10A, SEQ ID NO: 5) and the amino acid sequence (FIGURE 10B, SEQ ID NO: 6) encoding the mature mouse DLL3 protein cloned into the lentiviral expression vector and cDNA sequence (FIGURE 10C, SEQ ID NO: 7) and the amino acid sequence (FIGURE 10D, SEQ ID NO: 8) encoding the Cynomolgus DLL3 mature protein cloned into a lentiviral expression vector, where the vectors are used to generate cells with mouse3 and Cynomolgus DLL3 overexpression;

In FIG. 11A and 11B are tabulated continuous amino acid sequences (SEQ ID NOs: 20-213) of the light and heavy chain variable regions of a series of mouse and humanized exemplary DLL3 modulators isolated, cloned and designed as described in the Examples herein;

EP 2 817 338 B1

In FIG. 12 shows the biochemical and immunological properties of exemplary modulators

DLL3 and their ability to kill KDX66 NTX cells in vitro as shown in a tabular format;

Figs. 13A-13C illustrate the binding characteristics of selected modulators, wherein in FIG. 13A and 13B show a comparative binding characteristic of a selected murine modulator and its humanized counterpart using surface plasmon resonance, while in Figure 13C some of the properties of humanized constructs are provided in tabulated form.

In FIG. 14A and 14B are schematic and graphically illustrated in the results of a domain level mapping analysis of exemplary DLL3 modulators isolated, cloned and designed as described in the Examples (Figure 14A) and correlation between the binding domain of selected modulators and the ability to kill the DLL3 expressing DLL3 KDX66 cells (FIGURE 14B);

FIG. 15A-15C are flow cytometry histograms expressing DLL3 using the exemplified anti-DLL3 SC16.56 modulator on naive 293 cells (FIGURE 15A), 293 cells engineered to overexpress human DLL3 proteins (h293-hDLL3, FIG 15B) or cells 293 modified for overexpression of the mouse DLL3 protein (h293-mDLL3, FIG. 15C);

FIG. 16A-16F are flow cytometry histograms (FIG 16A-16C) and immunohistochemical results in tabular form (FIGS 16D-16F) illustrating relatively high surface expression of DLL3, respectively, using the exemplified anti-DLL3 SC16.56 modulator on live human ovarian cells (OV26; FIG 16A), kidneys (KDY66, FIG. 16B) and neuroendocrine large cell lung carcinoma (LU37; FIG. 16C), NTX tumors and expression of the DLL3 protein in various NTX tumors (FIG. 16D) and tumor cells of the primary small-cell cancer (FIG 16F), showing that the normal tissue does not express the DLL3 (FIG 16E);

In FIG. 17A-17C illustrate the capability of disclosed modulators to effectively direct cytotoxic charges to cells expressing DLL3, wherein in FIG. 17A has demonstrated the ability of exemplary modulators to kill KDY66 NTX tumors or 293 cells overexpressing hDLL3, and in FIG. 17B and 17C depicts the ability of the disclosed modulators to deliver cytotoxic charges to OV26 (FIG 17B) and LU37 (FIGURE 17C), where the slope curve indicates the cell killing by the internalized cytotoxin;

Figs. 18A-18E illustrate various features of disclosed modulators, wherein in FIG. 18A and 18C were demonstrated by flow cytometry that the NS3 NSHP KDY66 and naive KDY66 express the DLL3, whereas the expression DLL3 was effectively knocked out in the KDY66 DLL3HP2 cells in FIG. 18B shows that the growth of DLL3HP2 tumor cells lags behind the naive KDY66 cells, and in FIG. 18D and 18B show that the combined embodiments of the present invention are immunospecifically targeted to and kill KDY66 tumor cells expressing DLL3, but not KDY66 with the DLL3 knockout;

In FIG. 19A-19C shows the ability of selected conjugated cases of the present disclosure to kill and / or inhibit the growth of exemplary cells with a potential to induce lung cancer in vivo;

EP 2 817 338 B1

Figs. 20A-20F illustrate the ability of conjugated modulators of the present invention to significantly eliminate tumors and prevent tumor resumption in vivo - resulting in sustained emission in immunodeficient mice implanted with exemplary ovarian tumors (FIG 20A), lung (FIG. 20D) and kidneys (FIGS. 20B and 20F); and

In FIG. 21A-21F shows that the conjugated modulators of the present disclosure reduce the incidence of cancer stem cells as determined by the limited dilution assay (LDA) for two exemplary small-cell lung tumors, LU95 (FIG 21A-21C) and LU64 (FIG 21D-FIG. 21F), wherein in FIG. 21A and 21D illustrate the effect of conjugates on tumor growth, in FIG. 21B and 21B show the results of the LDA, and in FIG. 21C and 21F are graphically depicted reducing the incidence of cancer stem cells caused by treatment with a selected anti-DLL3 antibody conjugate

DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

1. Introduction [0040] Although the present invention may be embodied in many different forms, specific illustrative embodiments are disclosed herein that illustrate the principles of the invention. It should be emphasized that the present invention is not limited to the illustrated specific embodiments. In addition, all section headings used in this document are intended for organizational purposes only and should not be construed as limiting the subjects in question. Finally, for the purposes of the present disclosure, all identifying sequences of accession numbers can be found in the NCBI Reference Sequence database (RefSeq) and / or the GenBank NCBI archived sequence database, unless otherwise indicated.

[0041] As mentioned above, it was surprisingly found that the genotypic and / or phenotypic DLL3 determinants are associated with various proliferative disorders, including neuroendocrine tumors, and DLL3 and variants or isoforms provide useful tumor markers that can be used to treat related diseases. Furthermore, as shown in the present application, it was surprisingly found that markers or DLL3 determinants, such as the cell surface DLL3 protein, are therapeutically associated with cancer stem cells (also known as tumor immortalizing cells) and can be effectively used to eliminate or suppress them. The ability to selectively reduce or eliminate cancer stem cells (e.g., using conjugated DLL3 modulators) is particularly surprising in that that such cells are known to be generally resistant to many conventional therapies. This means that the efficacy of traditional as well as more current targeted therapies is often limited by the existence and / or emergence of immune cancer stem cells that are capable of immortalizing tumor growth, even in the face of these diverse treatments. In addition, determinants associated with cancer stem cells are often poor therapeutic targets due to low or inconsistent expression, lack of cell-associated or absent cell-related effects. In sharp contrast to the prior art knowledge, the presently disclosed compounds and methods effectively overcome this natural resistance and specifically eliminate, deplete, silencing or promoting the differentiation of such cancer stem cells, thereby negating their ability to sustain or re-induce tumor growth. In addition, since the expression of the DLL3 protein was largely associated with intracellular sites such as the Golgi apparatus, it was not known that

The phenotypic determinants can be successfully used as a therapeutic target, as discussed herein.

It is particularly noteworthy that DLL3 modulators, such as those disclosed herein, can be advantageously used in the prognosis, diagnosis, treatment, treatment and / or prophylaxis of selected proliferative disorders (e.g., cancerous) in individuals who do so. they need. It should be noted that although the preferred embodiments of the disclosure will be extensively discussed below, particularly with respect to specific domains, regions or epitopes or in the context of cancer stem cells or neuroendocrine neoplasms and their interaction with the disclosed modulators, those skilled in the art will appreciate that the present disclosure is not limited to such exemplary cases.

[0043] For this purpose and as demonstrated in the present application, it has surprisingly been found that the disclosed DLL3 modulators can be effectively used to target and eliminate or otherwise dispose of proliferative or cancerous cells and treat disorders related to DLL3 (e.g., cancer). The term & quot; DLL3 related disorder & quot; as used herein means any disorder or disease (including proliferative disorders) that is labeled, recognized, detected or identified by phenotypic or genotypic aberration of DLL3 genetic components or expression ("DLL3 determinant") during or aetiology of a disease or disorder. In this context, the DLL3 phenotypic aberration or determinant may include, for example, elevated or decreased expression levels of the DLL3 protein, incorrect expression of the DLL3 protein on certain specific populations of cells or incorrect expression of the DLL3 protein in the wrong phase or stage of the cell cycle. Of course, it is understood that similar expression patterns of genotypic determinants (e.g., mRNA transcription levels) of DLL3 can also be used to classify, detect, or treat DLL3 disorders.

[0044] As used herein, the term "determinant" or "DLL3 determinant" means any detectable property, property, marker or agent that is identifi- cally associated or specifically located in or on a particular cell, cell population or tissue, including those identified in or on the tissue, cell or population of cells affected by the disease or disorder associated with DLL3. In selected preferred cases, DLL3 modulators can connect, bind or react directly to the DLL3 determinant (e.g., DLL3 cell surface protein or DLL3 mRNA) and thus mitigate the disorder. More generally, the determinants may be of morphological, functional or biochemical nature and may be genotypic or phenotypic. In other preferred embodiments, the determinant is a surface antigen or genetic component that is differentially or preferentially expressed (or not) by specific cell types (e.g., cancer stem cells) or cells under certain conditions (e.g., at certain points in the cell cycle or cells at a particular level). niche). In still other preferred cases, the determinant may be a gene or a genetic unit that is variously regulated (up or down) in a particular cell or separate cell population, a gene that is variously modified in terms of its physical structure and chemical composition or protein or collection. at specific points in the cell cycle or cells in a particular niche). In still other preferred cases, the determinant may be a gene or a genetic unit that is variously regulated (up or down) in a particular cell or separate cell population, a gene that is variously modified in terms of its physical structure and chemical composition or protein or collection. at specific points in the cell cycle or cells in a particular niche). In still other preferred cases, the determinant may be a gene or a genetic unit that is variously regulated (up or down) in a particular cell or separate cell population, a gene that is variously modified in terms of its physical structure and chemical composition or protein or collection.

Of proteins physically associated with a gene exhibiting various chemical modifications. The determinants contemplated herein are specifically considered positive or negative and can be a cell, a cell subpopulation or tissue (e.g., a tumor) by its presence (positive) or absence (negative).

[0045] In a similar manner, "DLL3 modulators" of the disclosure broadly include any compound that recognizes, reacts, competes, antagonizes, interacts, binds, agonizes or associates with a variant or DLL3 isoform (or its specific domains, regions or epitopes). or its genetic component. Through these interactions, DLL3 modulators can advantageously eliminate, reduce or inhibit the incidence, activity, resumption, metastasis or motility of tumor cells (e.g., tumor-immortalizing cells or cancer stem cells). Exemplary modulators disclosed herein include nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, peptides or polypeptides. In certain preferred cases, the selected modulators will be antibodies to the DLL3 protein isoform or immunoreactive fragments or derivatives thereof. Such antibodies may be inherently antagonistic or agonistic and may optionally be conjugated or bound to a therapeutic or diagnostic agent. In addition, such antibodies or antibody fragments can include extensive, neutralizing or internalizing antibodies. In other cases, modulators within the framework of the present disclosure will be a DLL3 construct comprising the DLL3 isoform or a reactive fragment thereof. It will be appreciated that such constructs may be fusion proteins and may contain reactive domains from other polypeptides, such as immunoglobulins or biological response modifiers. In still other instances, the DLL3 modulator will be a nucleic acid moiety (e.g., miRNA, siRNA, shRNA, antisense constructs, etc.) that exert desired effects at the genomic level. Still other modulators complying with these instructions will be discussed in detail below.

[0046] More generally, the DLL3 modulators of the present invention generally comprise any compound that recognizes, reacts, competes, antagonizes, interacts with, binds, agonizes or binds to the DLL3 determinant (genotypic or phenotypic), including the cell surface DLL3 protein. Regardless of which modulator form is finally selected, it will preferably be isolated and purified before being introduced into the subject. In this context, the term "isolated DLL3 modulator" or "DLL3 isolated antibody" should be interpreted in a broad sense and in accordance with standard pharmaceutical practice, mean any preparation or composition containing the modulator in a state substantially free of undesired contaminants (biological or otherwise). Also, these preparations can be purified and formulated as desired using various techniques known in the art. Of course, it is understood that such "isolated" formulations may be intentionally formulated or combined with inert or active ingredients as desired to improve the commercial aspects, manufacture or therapeutic of a finished product and to provide pharmaceutical compositions. In a broader sense, the same general remarks may be applied to the isoform or variant of the "isolated" DLL3 or the "isolated" nucleic acid encoding them. as desired to improve the commercial, manufacturing or therapeutic aspects of the finished product and the delivery of pharmaceutical compositions. In a broader sense, the same general remarks may be applied to the isoform or variant of the "isolated" DLL3 or the "isolated" nucleic acid encoding them. as desired to improve the commercial, manufacturing or therapeutic aspects of the finished product and the delivery of pharmaceutical compositions. In a broader sense, the same general remarks may be applied to the isoform or variant of the "isolated" DLL3 or the "isolated" nucleic acid encoding them.

[0047] Furthermore, it has surprisingly been found that modulators that interact, bind to or bind to specific domains, motifs or DLL3 epitopes are particularly effective in eliminating tumor cells and / or in silencing or attenuating the effects of cancer stem cells on tumor growth or dissemination. This means that modulators that react or connect to domains that are closer to the cell surface (e.g. one of the EGF-like domains) are effective in depletion

For example, or neutralizing tumor cells, it has surprisingly been found that modulators that link or bind to domains, motifs or regions that are relatively more distant from the cell surface are also effective in eliminating, neutralizing, depleting or silencing cancer cells. In particular, and as shown in the accompanying Examples, modulators that react, bind or bind to DSL or N-terminal regions of the DLL3 protein have been found to be surprisingly effective in eliminating or neutralizing tumor cells, including those exhibiting neuroendocrine features, and or cancer stem cells. This is especially true for conjugated modulators, such as, for example, anti-DLL3 antibody drug conjugates incl.wasting a cytotoxic agent. As such, it is noted that certain preferred embodiments of the present disclosure are directed to compounds, compositions and methods that include DLL3 modulators that link, bind or react with a relatively further portion of DLL3 including the DSL domain and the N-terminal region.

[0048] Although the present disclosure explicitly contemplates the use of any DLL3 modulator in the treatment of any DLL3 disorder, including any type of cancer, in particularly preferred cases, the disclosed modulators can be used to prevent, treat or diagnose neuroendocrine (genotype or phenotypic) tumors, including neuroendocrine tumors. Real or "canonical neuroendocrine tumors" (NETs) come from a dispersed endocrine system and are usually very aggressive. Neuroendocrine tumors occur in the kidneys, the urogenital tract (bladder, prostate, ovary, cervix and endometrium), the gastrointestinal tract (stomach, large intestine), thyroid (medullary thyroid carcinoma) and lung (small cell lung cancer and neuroendocrine carcinoma of large cells). In addition, the disclosed modulators can be advantageously used for the treatment, prevention or diagnosis of pseudo neuroendocrine tumors (pNET) that genotype or phenotype mimic, represent, resemble, or exhibit features consistent with canonical neuroendocrine tumors. "Probably neuroendocrine tumors" are tumors that originate from cells of the dispersed neuroendocrine system or cells in which the neuroendocrine differentiation cascade was improperly reactivated during the oncogenic process. Such pNETs usually have certain genotypic, phenotypic or biochemical traits with traditionally defined neuroendocrine tumors, including the ability to produce subgroups of biologically active amines, neurotransmitters and peptide hormones. Accordingly, for the purposes of the present invention, it is contemplated that the phrases "tumors comprising neuroendocrine features" or "neuroendocrine tumor" include both neuroendocrine tumors and rheumatoid neuroendocrine tumors, unless otherwise specified in the context.

[0049] In addition to the association with the tumors generally discussed above, there are also signs of a phenotypic or genotypic relationship between selected tumor-inducing cells (TICs) and DLL3 determinants. Accordingly, selected TICs (e.g., cancer stem cells) may express elevated levels of DLL3 protein as compared to normal tissue and non-tumor cells (NTG), which together generally constitute a large part of the solid tumor. Thus, DLL3 determinants may be a tumor-associated marker (or antigen or immunogen), and the disclosed modulators may provide effective means for detecting and suppressing TIC and associated cancers caused by altered protein levels on cell surfaces or in the tumor microenvironment. Therefore, DLL3 modulators, including immunoreactive antagonists and antibodies that bind,

The method prevents or limits the ability of these cancer-initiating cells to remain dormant and / or continue to support tumor growth, metastasis or recurrence in a patient. It will be appreciated by those skilled in the art that the present disclosure further provides DLL3 modulators and their use in reducing the incidence of cancer-initiating cells.

II. DLL3 Physiology The Notch signaling pathway, was first identified in C. elegans and Drosophila, and then demonstrated to be evolutionarily preserved from invertebrates to vertebrates, participates in a series of basic biological processes, including standard development embryonic tissue, adult tissue homeostasis and stem cell maintenance (D'Souza et al., 2010, Liu et al., 2010). Notch signaling is crucial for different cell types during specification, calibration and morphogenesis. It often occurs by means of a lateral inhibition mechanism in which cells expressing the Notch ligand (s) take the default fate of the cell, and simultaneously suppress this fate in neighboring cells by stimulating Notch signaling (Sternberg, 1988, Cabrera 1990). This double choice of cell fate, mediated by Notch signaling, plays a role in numerous tissues, including the developing nervous system (de la Pompa et al., 1997), hematopoietic and immune systems (Bigas and Espinosoa, 2012; Hoyne et al., 2011), intestine (Fre et al., 2005, Fre et al., 2009), endocrine pancreas (Ape lqvist et al., 1999, Jensen et al., 2000), pituitary gland (Raetzman et al., 2004) and dispersed neuroendocrine system ( Ito et al., 2000, Schonhoff et al., 2004). The generalized mechanism for implementing this dual switch seems to be conserved despite the wide range of developmental systems in which Notch plays a role - in cells where the default choice of cell fate is determined by the transcriptional regulators known as basic helix-loop-helix (bHLH) proteins, Notch signaling activates a class of genes corresponding to Notch, which in turn inhibits the activity of bHLH proteins (Ball, 2004). These double decisions take place in the broader context of developmental and signaling signals that allow Notch signaling to influence or inhibit proliferation, and also cause self-renewal or inhibition.

[0051] In Drosophila, Notch mediates mainly one Notch receptor gene and two ligand genes, known as Serrate and Delta (Wharton et al., 1985, Rebay et al., 1991). In humans, there are four known Notch receptors and five DSL ligands (Delta-Serrate LAG2) - two Serrate homologues, known as

Jagged1 and Jagged 2, and three Delta homologs, called delta-like Ugands or DLL1, DLL3 and DLL4. Typically, Notch receptors on the surface of the signal receiving cell are activated by interactions with ligands expressed on the opposite surface of the signal-sending cell (defined as trans interaction). These trans interactions lead to protease-primed protease cleavage sequences. Consequently, the intracellular domain of the Notch receptor is free to move from membrane to nucleus where it interacts with the CSL family of transcription factors (RBPJ in humans) and converts them from transcriptional repressors into gene activators responding to Notch.

[0052] Of the human Notch ligands, DLL3 differs in that it appears to be unable to activate the Notch receptor via trans interactions (Ladi et al., 2005). Notch ligands may also interact with Notch in cis receptors (on the same cell), which leads to inhibition of the Notch signal, although precise cis inhibition mechanisms are unclear and may vary depending on the ligand (for example, see Klein et al., 1997 , Ladi et al., 2005, Glittenberg et al., 2006). Two hypothetical inhibition modes include modulating Notch signaling on the cell surface by preventing trans interactions,

Or by reducing the amount of Notch receptor on the cell surface by interfering with receptor processing or by physically causing retention of the receptor in the endoplasmic reticulum or the Golgi apparatus (Sakamoto et al., 2002, Dunwoodie, 2009). It is clear, however, that the stochastic differences in the expression of Notch receptors and ligands on neighboring cells can be amplified by both transcriptional and non-transcriptional processes, and the subtle cis and trans interaction balance can result in a gentle tuning of divergent cell fates in Notch mediated tissues. (Sprinzak et al., 2010).

[0053] DLL3 (also known as Delta-like 3 or SCDO1) is a member of the Delta-like DSL Notch family of ligands. Representative orthologs of the DLL3 protein include, but are not limited to, human (Accession No. NP_058637 and NP_982353), chimpanzee (accession number XP_003316395), mouse (accession No. NP_031892) and rat (accession number NP_446118). In humans, the DLL3 gene consists of 8 exons with a length of 9.5 kBp located on the 19q13 chromosome. Alternative assembly within the last exon results in two processed transcripts, one of 2389 bases (accession number NM_016941, FIG 1A, SEQ ID NO: 1) and one of 2052 bases (accession number NM_203486, FIG 1B, SEQ ID NO: 2 ). The first transcript encodes a 618 amino acid protein (accession number NP_058637, FIG 1C, SEQ ID NO: 3), while the latter encodes a 587 amino acid protein (accession number NP_982353, FIG 1D, SEQ ID NO: 4). These two DLL3 protein isoforms have a total 100% identity in the extracellular domains and their transmembrane domains, differing only in that the debts behind the isoform contain an elongated cytoplasmic tail containing 32 additional residues at the carboxyl terminus of the protein (FIG 1E). The biological significance of isoforms is unclear, although both isoforms can be detected in tumor cells (FIGURE 5). The percent identity for each member of the delta-like family of proteins in humans is shown in FIG. 2A, as well as the cross identity of the species in FIG. 2B. that the length of the isoform contains an elongated cytoplasmic tail containing 32 additional residues at the carboxyl terminus of the protein (FIG 1E). The biological significance of isoforms is unclear, although both isoforms can be detected in tumor cells (FIGURE 5). The percent identity for each member of the delta-like family of proteins in humans is shown in FIG. 2A, as well as the cross identity of the species in FIG. 2B. that the length of the isoform contains an elongated cytoplasmic tail containing 32 additional residues at the carboxyl terminus of the protein (FIG 1E). The biological significance of isoforms is unclear, although both isoforms can be detected in tumor cells (FIGURE 5). The percent identity for each member of the delta-like family of proteins in humans is shown in FIG. 2A, as well as the cross identity of the species in FIG. 2B.

[0054] Typically, DSL ligands consist of a number of structural domains: the unique N-terminal domain followed by the conserved DSL domain, multiple epidermal growth factor (EGF) tandem repeats, transmembrane domain and cytoplasmic domain not highly conserved among ligands but which they contain many lysine residues, which are potential sites of ubiquitination by the unique E3 ubiquitin ligases. The DSL domain is a degenerate domain of EGF that is necessary but not sufficient to interact with Notch receptors (Shimizu et al., 1999). In addition, the first two EGF-like repeats for most DSL ligands contain a smaller protein sequence motif known as the DOS domain that interacts with the DSL domain when activating Notch signaling. [0055] In FIG. 1F provides a schematic diagram of the extracellular region of the DLL3 protein, illustrating a general listing of six EGF-like domains, a single DSL domain, and a N-terminal domain. Generally, EGF domains are recognized as having residues of about 216-249 amino acids (domain 1), 274-310 (domain 2), 312-351 (domain 3), 353-389 (domain 4), 391-427 (domain 5). ) and 429-465 (domain 6), with the DSL domain in amino acid residues about 176-215 and the N-terminal domain in about 27-175 hDLL3 amino acid residues (SEQ ID NOS: 3 and 4). As discussed in more detail herein and illustrated in Example 10 below, each of the EGF-like domains, the DSL domain, and the N-terminal domain comprise a portion of the DLL3 protein determined by a separate amino acid sequence. It should be noted that, for purposes of the present disclosure, suitable EGF-like domains may be referred to as EGF1 to EGF6 with EGF1 being the closest to the N-terminus of the protein. With regard to the structural composition of the protein, one important aspect of the present disclosure is that the disclosed DLL3 modulators can be produced, manufactured, designed or selected.

Thus, they react with the selected domain, motif or epitope. In some cases, such site-specific modulators may provide increased reactivity and / or efficacy depending on their primary mode of action.

[0056] It should be noted that as used herein, the terms "mature protein" or "mature polypeptide" refers to the form of the protein produced (s) by expression in a mammalian cell. In general, it is hypothesized that after starting the export of the growing protein chain through the rough endoplasmic mesh, the proteins secreted by the mammalian cells have a signal peptide sequence (SP) that is cleaved from the full polypeptide to obtain a "mature" form of the protein. In both DLL3 isoforms, the mature protein contains a 26 amino acid signal peptide that can be truncated prior to cell surface expression. Thus, in mature proteins, the N-terminal domain will extend from position 27 in the protein up to the start of the DSL domain. Of course, if the protein is not processed in this way,

[0057] Of the various Delta-like ligands, the DLL3 is the most deviated from the others in the family because it contains a degenerate DSL domain, no DOS motifs, and an intracellular domain that lysine residues lack. Degenerate DSL and lack of DOS themes are compatible with the inability of DLL3 to trigger Notch in trans signaling (between cells), suggesting that DLL3, unlike DLL1 or DLL4, only works as an inhibitor of Notch signaling (Ladi et al., 2005). Studies have shown that DLL3 may be resident mainly in the Golgi GI site (Geffers et al., 2007), which would be consistent with the hypothetical ability to retain Notch receptor or interfere with Notch receptor processing, preventing cell surface export and replacing referral to the lysosome (Chapman et al., 2011). Some DLL3 proteins may appear on the cell surface, however, when the protein is artificially over-expressed in model systems (Ladi et al., 2005), but it is not obvious that this would occur under normal biological conditions, or in tumors in which the transcript DLL3 mRNA is elevated; somewhat surprisingly, the protein levels detected in the tumor types disclosed herein indicate that an important DLL3 protein is mined on the surface of cells of different tumors.

[0058] Defects in the DLL3 gene have been associated with spinal-ribbital bone dysplasia in humans, a severe congenital birth defect causing abnormal spinal formation and rib abnormalities (Dunwoodie, 2009). This is related to the changes in Notch signaling that are known to play a key role in determining polarity and somite calibration, embryonic precursors that require a precisely regulated oscillatory interaction between Notch, Wnt and FGF signaling pathways for normal development (Kageyama et al. , 2007, Goldbeter and Pourquie, 2008). Although DLL1 and DLL3 are usually expressed at similar locations in the developing mouse embryo, experiments with transgenic mice have shown that DLL3 does not compensate for DLL1 (Geffers et al., 2007). The DLL1 knockout mice die in the germ phase, but the mutant DLL3 mice survive, however, exhibit a phenotype similar to that which occurs in humans with spine-rib bone dysplasia (Kusumi et al., 1998; Shinkal et al., 2004). These data are consistent with the subtle interaction of trans and cis interactions critical for normal development.

[0059] Furthermore, as discussed above, Notch signaling plays a role in the development and maintenance of neuroendocrine cells and neuroendocrine tumors. Therefore, Notch signaling is involved in a number of decisions regarding the fate of cells in normal endocrine and

EP 2 817 338 B1 in a dispersed neuroendocrine system. For example, in the pancreas, Notch signaling is required to suppress the development of a false endocrine phenotype mediated by the bHLH NGN3 transcription factor (Habener et al., 2005). Similar suppression of Notch mediated endocrine events occurs in enteroendocrine cells (Schonhoff et al., 2004), thyroid parodular cells (Cook et al., 2010) in determining the relative ratios of pituitary-neuroendocrine cell types (Dutta et al., 2011 ) and is likely involved in cellular decisions in the lungs to adopt a neuroendocrine or non-neuroendocrine phenotype (Chen et al., 1997; Ito et al., 2000, Sriuranpong et al., 2002). Hence, it is obvious

[0060] Inadequate reactivation of developmental signaling pathways or dysregulation of normal signaling pathways are commonly observed in tumors, and in the case of Notch signaling have been associated with many types of tumors (Koch and Radtke, 2010, Harris et al., 2012). The Notch pathway has been studied as an oncogene in lymphomas, colon cancer, pancreas and some types of non-small cell lung cancer (see Zarenczan and Chen, 2010 and references in it). In contrast, Notch is reported to act as a tumor suppressor in cancers with neuroendocrine traits (see Zarenczan and Chen, 2010 above). Neoplasms with neuroendocrine features appear rarely in a wide range of primary sites, and while their exhaustive classification remains problematic (Yao et al., 2008, Klimstra et al., 2010, Kloppel, 2011), they can be classified into four main types: benign low-grade carcinoids, well-differentiated low-grade neuroendocrine tumors, mixed neuroendocrine and epithelial neoplasms, and poorly differentiated high-grade neuroendocrine carcinomas. Of these classifications, poorly differentiated neuroendocrine carcinomas, which include small cell lung cancer (SCLC) and non-small cell lung cancer subgroup (NSCLC), are types of cancer with poor prognosis. It has been postulated that SCLC is of bronchial origin, arising partly from pulmonary neuroendocrine cells (Galluzzo and Bocchetta, 2011). Regardless of the particular cellular source from which each of these cancers having a neuroendocrine phenotype is derived, it can be expected that suppression of Notch signaling, either by direct changes in the Notch pathway genes itself, or by activating other genes that suppress Notch signaling, it can lead to the neuroendocrine phenotype of these tumors. By extension, genes that lead to perturbation of the Notch pathway may provide therapeutic targets for the treatment of tumors with neuroendocrine phenotypes, particularly for indications that currently have poor clinical results.

[0061] ASCL1 is one of such genes that appears to interact with the Notch via DLL3 signaling pathway. It is evident that many neuroendocrine tumors exhibit poorly differentiated (i.e., partially complete) endocrine phenotype; for example, clearly elevating or expressing various endocrine proteins and polypeptides (e.g., chromogranin A, CHGA, calcitonin, CALCA, propiomelanocortin, POMC, somatostatin, SST), proteins associated with secretory vesicles (e.g., synaptophysin, SYP) and genes involved in the pathways biochemical responsible for the synthesis of bioactive amines (e.g. dopa decarboxylase, DDC). Perhaps, unexpectedly, these cancers often overexpress ASCL1 (also known as mASH1 in mice or hASH1 in humans), a transcription factor known to that it plays a role in coordinating the cascades of genes that lead to neuronal and neuroendocrine phenotypes. Although the specific molecular details of the cascade remain fixed by III, it is increasingly evident that for certain types of cells, especially paraffin cells

Thyroid gland (Kameda et al., 2007), chromaffinic cells in the adrenal medulla (Huber et al., 2002) and cells found in the dispersed pulmonary neuroendocrine system (Chen et al., 1997; Ito et al. 2000, Sriuranpong et al., 2002), ASCL1 is part of a carefully matched regulatory development loop in which the balance of AS22 and Notch mediated gene expression cascades is the choice of cell fate (FIG 3). For example, ASCL1 was found to be expressed in normal murine pulmonary neuroendocrine cells, whereas the Notch signaling effector, HES1, was expressed in non-neuroendocrine cells of the lungs (Ito et al., 2000). The fact that these two cascades are in good balance with the potential for cross-regulation is increasingly appreciated. The Notch effector, HES1, has been shown to reduce the expression of ASCL1 (Chen et al., 1997; Sriuranpong et al., 2002). These results clearly indicate that Notch signaling can suppress neuroendocrine differentiation. However, demonstration that binding of ASCL1 to the DLL3 promoter activates the expression of DLL3 (Henke et al., 2009) and the observation that DLL3 weakens Notch signaling (Ladi et al., 2005) closes the genetic circuit for the choice of cell fates between neuroendocrine and non-hemiglitocrine phenotypes.

[0062] Considering the fact that Notch signaling appears to have evolved to increase subtle differences between neighboring cells to allow a clear reduction of tissue domains with different differentiation paths (e.g., "lateral inhibition" as described above), this data together, they suggest that the carefully tuned regulatory development loop (Figure 3) has been reactivated and disrupted in cancers with neuroendocrine phenotypes. Although it is not evident that the DLL3 would provide a suitable target on the cell surface for the development of therapeutic agents with antibodies, given that its normal residence in the internal membrane compartment of the cell (Geffers et al., 2007) and the supposed interaction with Notch in this place . it is possible that the resulting increase in DLL3 expression in neuroendocrine tumors may offer a unique therapeutic target for tumors with a neuroendocrine phenotype (eg, NET and pNET). It is widely observed that the huge overexpression of proteins in laboratory systems may result in inappropriate placement of the protein overexpressed within the cell. Thus, a reasonable hypothesis is, but not evident, without experimental verification that the overexpression of DLL3 in tumors can lead to some cell-surface protein expression and thus presents the goal of developing therapeutic agents with antibodies. that the huge overexpression of proteins in laboratory systems may cause inappropriate placement of the protein overexpressed within the cell. Thus, a reasonable hypothesis is, but not evident, without experimental verification that the overexpression of DLL3 in tumors can lead to some cell-surface protein expression and thus presents the goal of developing therapeutic agents with antibodies. that the huge overexpression of proteins in laboratory systems may cause inappropriate placement of the protein overexpressed within the cell. Thus, a reasonable hypothesis is, but not evident, without experimental verification that the overexpression of DLL3 in tumors can lead to some cell-surface protein expression and thus presents the goal of developing therapeutic agents with antibodies.

III. Cancer stem cells [0063] As mentioned above, it was surprisingly found that aberrant expression of DLL3 (genotypic and / or phenotypic) is associated with various subpopulations of tumor cells. In this context, the present disclosure provides DLL3 modulators that may be particularly useful in targeting such cells, and in particular on tumor immortalizing cells, thereby facilitating the treatment, management or prevention of neoplastic disorders. Thus, in preferred cases, modulators of DLL3 determinants (phenotypic or genotypic) can be advantageously used to reduce the incidence of cancer-initiating cells as described herein, and thus facilitate treatment or guided proliferative disorders.

For the purposes of the present application, the term "tumor-inducing cell" (TIC) includes both "tumor immortalizing cells" (TPCs, i.e., cancer stem cells or CSCs) and highly proliferative "tumor progenitor cells" (called TProg) that together typically they constitute a unique subpopulation (i.e. 0.1-40%) of a tumor of large mass or mass. For the purposes of this disclosure, the terms "tumor immortalizing cells" and "cancer stem cells" or "cancerous cells."

"TPC" is equivalent and may be used interchangeably herein. TPC differs from

TProg in that TPC can completely recapitulate the tumor cell composition existing within the tumor and have an unlimited ability to self-renew, as demonstrated by serial transplantation (two or more passages in mice) of a small number of isolated cells, while TProg does not show unlimited capability self-renewal.

[0065] Those skilled in the art will appreciate that fluorescence activated cell sorting (FACS) using appropriate cell surface markers is a reliable method of isolating highly enriched cancer cell subpopulations (e.g.> 99.5% purity), at least in part, due to its ability to differentiate between single cells and cell groups (i.e., doublets, etc.). Using such techniques, it has been shown that when small numbers of cells of highly purified TProg cells are transplanted into immune-compromised mice, they can increase tumor growth in the primary transplant. However, unlike purified TPC subpopulations, tumors made from TProg did not completely reflect the parent tumor in the phenotypic heterogeneity of the cells and are clearly ineffective to re-initiate serial tumorigenesis in subsequent transplants. In contrast, TPC subpopulations completely reproduce cellular heterogeneity of parent tumors and can effectively initiate tumors during serial isolation and transplantation. Thus, those skilled in the art will understand that the ultimate difference between TPC and TProg, although both may be tumors in primary grafts, is the unique ability of TPC to continuously support heterogeneous tumor growth during serial transplantation at low cell numbers. Other popular approaches to characterizing TPC include morphology and the study of cell surface markers,

Accordingly, for the purposes of the present invention, cancer immortalizing cells, like normal stem cells that support the cellular hierarchy in normal tissue, are preferably determined by their ability to self-renew for an indefinite period while maintaining the ability to differentiate multiple lines. The cancer immortalizing cells are therefore capable of generating both progeny causing cancer (i.e., tumor-initiating cells: TPC and TProg) and non-tumorigenic progeny (NTG). As used herein, a "no-tumor formation" (NTG) refers to a cancer cell that arises from cancer-initiating cells, but she herself has no ability to self-renew or generate heterogeneous tumor cell lines that constitute a tumor. Experimentally, NTG cells are not able to reproduce tumors in mice even when transplanted in an excess number of cells.

[0067] As indicated, TProg are also classified as tumor-initiating cells (or TICs) due to their limited ability to form tumors in mice. TProg are descendants of TPC and are usually capable of finite numbers of non-self-renewing cell divisions. In addition, TProg cells can be further subdivided into early tumor progenitor cells (ETP) and late tumor progenitor cells (LTPs), each of which can be distinguished by phenotype (e.g., cell surface markers) and various abilities to restore tumor cell structure. Despite such technical differences, both ETP and LTP are functionally different from TPC because they are generally less able to serially regenerate tumors during transplantation at low cell numbers and usually do not reflect the heterogeneity of the parent tumor.

It is also known that different populations of TProg can in rare cases acquire the ability to self-renew, which is usually attributed to stem cells and become themselves TPC (or CSC). In each case, both types of tumor-initiating cells are likely represented in the typical tumor mass of a single patient and are treated with modulators as disclosed herein. This means that the disclosed compositions are typically effective in reducing the frequency or chemical sensitivity of such DLL3 positive tumor-initiating cells, regardless of the particular embodiment or mixture represented in the tumor.

In the context of the present invention, TPCs are more tumorigenic, relatively more resting and often more chemoresistant than TProg (both ETP and LTP), NTG cells and tumor-infiltrating cells not derived from TPC (e.g., fibroblasts / stroma, endothelial and hematopoietic cells) ), which constitute the mass of the tumor. Considering that conventional therapies and diagrams have been largely designed both to reduce tumor mass and to attack rapidly proliferating cells, TPCs may be more resistant to conventional therapies and regimens than faster proliferating TProgs and other tumor cell mass populations. In addition, TPC often have other properties that make them relatively chemoresistant to conventional therapies, such as increased expression of multi-drug cell transporters, increased DNA repair mechanisms and antiapoptotic proteins. These properties, each of which contribute to tolerance of the drug by TPC, are a key reason for the failure of standard oncological treatment regimens to provide long-term benefits for the majority of patients with advanced stage of cancer; ie the lack of proper targeting and eradication of those cells that cause constant tumor growth and recurrence (ie TPC or CSC).

[0069] In contrast to many prior art therapies, the novel compositions of the present invention preferably reduce the incidence of cancer-initiating cells upon administration to a subject regardless of the form or specific purpose (e.g., genetic material, antibody fusion construct or DLL ligand) of the selected modulator. As mentioned above, a reduction in the incidence of cancer initiating cells may occur as a result of a) elimination, depletion, sensitization, attenuation or inhibition of cancer initiating cells; b) controlling the growth, expansion or recurrence of cancer initiating cells; c) disrupting the initiation, proliferation, maintenance or proliferation of cancer-initiating cells; or d) otherwise hindering the survival, regeneration and / or metastasis of cells that cause tumor formation. In some embodiments, the reduction in the frequency of occurrence of cancer-initiating cells occurs by altering one or more physiological pathways. Change of pathway, whether by reducing or eliminating cancer-initiating cells or modifying their potential (eg induced differentiation, disruption of the niche) or otherwise interfering with their ability to affect the tumor or other cell environment, in turn allows more effective treatment of disorders related to DLL3 by inhibiting tumor growth, tumor maintenance and / or metastasis and recurrence.

[0070] Among the methods recognized in the art that can be used to assess such a decrease in the frequency of occurrence of cancer initiating cells is an analysis of limited dilutions either in vitro or in vivo, preferably followed by counting using Poisson distribution statistics or estimating the prevalence of predefined events such as the ability to form tumors in vivo or lack thereof. While such limited dilution analysis includes advantageous methods for calculating the reduction in the incidence of cancer-initiating cells, other, less-than-normal, other, less-effective, methods may also be used to effectively determine the desired levels.

These methods require a method, albeit somewhat less accurate, and are entirely consistent with the guidelines described in this document. Thus, as will be appreciated by one of skill in the art, it is also possible to determine a reduction in the frequency of occurrence by well-known flow cytometric or immunohistochemical means. For all of the above-mentioned methods, see, for example, Dylla et al. 2008, PMID: 18560594 and Hoey et al. 2009, PMID: 19664991. [0071] With respect to limited dilution analysis, an in vitro count of cellular frequency can be achieved. tumor-initiating by deposition of either fractionated or unfractionated human tumor cells (e.g., from treated and untreated tumors) under in vitro growth conditions that promote colony formation. In this way, colony forming cells can be counted by simply counting and characterizing the colonies or by analyzing consisting of, for example, the deposition of human tumor cells on plates in serial dilutions and scoring each well as positive or negative for colony formation of at least 10 days. after seeding on the plate. Experiments or analyzes of limited in vivo dilutions, which are generally more accurate in their ability to determine the incidence of cancer-initiating cells, include human tumor cell transplantation, either untreated control or from treated populations, for example, mice with a compromised immune system. in serial dilutions, and then scoring each mouse as positive or negative for tumor formation at least 60 days after transplantation. Determining the frequency of cell occurrence by analysis of limited dilutions in vitro or in vivo is preferably carried out by using Poisson distribution statistics to a known frequency of positive and negative events, thus ensuring the frequency of events meeting the definition of a positive event; in this case the formation of a colony or tumor, respectively. thus ensuring the frequency of events meeting the definition of a positive event; in this case the formation of a colony or tumor, respectively. thus ensuring the frequency of events meeting the definition of a positive event; in this case the formation of a colony or tumor, respectively.

[0072] With respect to other methods in accordance with the present invention that can be used to calculate the frequency of occurrence of cancer initiating cells, the most commonly used are quantitative flow cytometry techniques and immunohistochemical staining procedures. Although not as thorough as the limited dilution analysis techniques described above, these procedures are much less labor intensive and provide reasonable values ​​in a relatively short period of time. Thus, it will be appreciated that one of skill in the art may use a cell surface marker profile by flow cytometry using one or more antibodies or reagents that bind cell surface protein known in the art that are known to enrich tumor-initiating cells (e.g. potentially compatible markers as outlined in PCT WO2012 / 031280), and thus measure TIC levels from different samples. In yet another compatible method, the skilled person can calculate the incidence of TIC in situ (e.g., tissue section) by immunohistochemistry using one or more antibodies or reagents that are capable of binding to cell surface proteins that are thought to define these cells.

[0073] Those skilled in the art recognize that numerous markers (or the lack thereof) are associated with different populations of cancer stem cells and used to isolate or characterize a subpopulation of tumor cells. In this context, exemplary markers of cancer stem cells include OCT4, Nanog, STAT3, EPCAM, CD24, CD34, NB84, TrkA, GD2, CD133, CD20, CD56, CD29, B7H3, CD46, transferrin receptor, JAM3, carboxypeptidase M, ADAM9, oncostatin M, Lgr5, Lgr6, CD324, CD325, nestine, Sox1, Bmi-1, eed, easyh1, easyh2, mf2, yy1, smarcA3, smarckA5, smarcD3, smarcE1, mllt3, FZD1, FZD2, FZD3, FZD4, FZD6, FZD7, FZD8, FZD9, FZD10, WNT2, WNT2B, WNT3, WNT5A, WNT10B, WNT16, AXIN1, BCL9, MYC,

(TCF4) SLC7A8, IL1RAP, TEM8, TMPRSS4, MUC16, GPRC5B, SLC6A14, SLC4A11, PPAP2C, CAV1,

CAV2, PTPN3, EPHA1, EPHA2, SLC1A1, CX3CL1, ADORA2A, MPZL1, FLJ10052, C4.4A, EDG3,

RARRES1, TMEPAI, PTS, CEACAM6, NID2, STEAP, ABCA3, CRIM1, IL1R1, OPN3, DAF, MUC1, MCP,

CPD, NMA, ADAM9, GJA1, SLC19A2, ABCA1, PCDH7, ADCY9, SLC39A1, NPC1, ENPP1, N33, GPNMB,

LY6E, CELSR1, LRP3, C20orf52, TMEPAI, FLVCR, PCDHA10, GPR54, TGFBR3, SEMA4B, PCDHB2,

ABCG2, CD166, AFP, BMP-4, β-catenin, CD2, CD3, CD9, CD14, CD31, CD38, CD44, CD45, CD74, CD90, CXCR4, decoration, EGFR, CD105, CD64, CD16, CD16a, CD16b, GLI1, GLI2, CD49b, and CD49f. See, for example, Schulenburg et al., 2010, PMID: 20185329, USPN 7,632,678 and USPN 2007/0292414, 2008/0175870, 2010/0275280, 2010/0162416 and 2011/0020221.

[0074] It will further be appreciated that each of the aforementioned markers may also be used as a secondary target antigen in the context of bispecific or multispecific antibodies of the present disclosure.

[0075] Similarly, non-limiting examples of cell surface phenotypes associated with cancer stem cells of some tumor types include CD44^tallCD24^short, ALDH⁺, CD133⁺, CD123⁺, CD34⁺CD38^-, CD44⁺CD24^-, CD46^hiCD324⁺CD66c^-, CD133⁺CD34⁺CD10^-CD19^-, CD138^-CD34^-CD19⁺.

CD133 + RC2 +, CD44 + a2 ei^hiCD133 +, CD44 + CD24 + ESA +, CD271 +, ABCB5 + as well as other phenotypes of cancer stem cell surface that are known in the art. See, for example, Schulenburg et al., 2010, supra, Visvader et al., 2008, PMID: 18784658 and USPN 2008/0138313.

Those skilled in the art will appreciate that marker phenotypes such as those illustrated immediately above may be used in conjunction with standard flow cytometric analysis and cell sorting techniques to characterize, isolate, purify or enrich TIC and / or TPC cells. or a population of cells for further analysis. The CD46, CD324 and, optionally, CD66c of interest in the present invention are either highly or heterogeneously expressed on the surface of many human colorectal cancer ("CR"), breast ("BR"), non-small cell lung cancer (NSCLC), small cell carcinoma cells lung cancer (SCLC), pancreas (PA), melanoma ("Mel"), ovarian cancer ("OV"), head and neck cancer ("HN"), regardless of

[0077] Using any of the above-mentioned methods and selected markers known in the art (and shown in Example 17 below), a reduction in the frequency of TIC (or TPC in them) provided by the disclosed DLL3 modulators (including those conjugated with cytotoxic agents) can be quantified. ) in accordance with the instructions of this document. In some cases, the compounds of the present disclosure may reduce the incidence of TIC or TPC (using the various mechanisms described above, including elimination, inducible differentiation, niche disruption, silencing, etc.) by 10%, 15%, 20%, 25%, 30%. % or even 35%. In other cases, the reduction in the prevalence of TIC or TPC may be in the order of 40%, 45%, 50%, 55%, 60% or 65%. In some cases, the disclosed compounds may reduce the incidence of TIC or TPC by 70%, 75%, 80%, 85%, 90% or even 95%. Of course, it is understood that any reduction in the prevalence of TIC or TPC probably leads to an adequate reduction in carcinogenicity, persistence, recurrence and aggressiveness of the tumor.

IV. DLL3 modulators

[0078] In any case, the present disclosure relates to the use of DLL3 modulators, including antagonists

DLL3, for the diagnosis, diagnosis, treatment and / or prophylaxis of various disorders, including one of many malignant neoplasms associated with DLL3. The disclosed modulators can be used alone or in combination with a wide range of anti-cancer compounds, such as chemotherapeutic or immunotherapeutic agents (e.g., therapeutic antibodies) or biological response modifiers. In other selected cases, two or more separate DLL3 modulators may be used in combination to provide enhanced anti-tumor effects or may be used to generate multispecific constructs.

[0079] In some cases, the DLL3 modulators of the present invention will include nucleotides, oligonucleotides, polynucleotides, peptides or polypeptides. More specifically, exemplary modulators of the disclosure may include antibodies and fragments or derivatives thereof, proteins, peptides, glycoproteins, glycopeptides, glycolipids, polysaccharides, oligosaccharides, nucleic acids, antisense constructs, siRNAs, miRNAs, bioorganic molecules, peptidomimetics, pharmacological agents and theirs. metabolites, transcriptional and translational control sequences, and the like. In some cases, modulators will include soluble DLL3 (sDLL3) or a form, variant, derivative or fragment thereof, including, for example, DLL3 fusion constructs (e.g., DLL3-Fc, targeting DLL3, etc.) or DLL3 conjugates (e.g. DLL3-PEG, DLL3-cytotoxic agent, DLL3-brm etc.). In other preferred cases, the DLL3 modulators include antibodies or immunoreactive fragments or derivatives thereof. In particularly preferred cases, the modulators of the present disclosure will include neutralizing, comprehensive or internalizing antibodies or derivatives or fragments thereof. Furthermore, as with the above-mentioned fusion constructs, such antibody modulators may be conjugated, linked or otherwise associated with selected cytotoxic agents, polymers, biological response modifiers (BRMs) or the like to provide targeted immunological therapies with various (and possibly many) mechanisms of action. As suggested above, such antibodies can be pan-DLL antibodies and bind to two or more members of the DLL family or, alternatively, include antigen binding molecules that selectively react with one or both of the DLL3 isoforms. In still other preferred cases, the modulators may act at the genetic level and may include the compounds as antisense constructs, siRNAs, miRNAs and the like that interact with or bind to the genotypic component of the DLL3 determinant.

[0080] It will further be appreciated that the disclosed DLL3 modulators may exhaust, attenuate, neutralize, eliminate or inhibit the growth, proliferation or survival of tumor cells, including TPC and / or associated cancer through various mechanisms, including agonizing or antagonizing selected pathways or eliminating specific cells depending, e.g. on the form of the DLL3 modulator, any associated payload or dosing, and the delivery method. Thus, although the preferred cases disclosed herein are directed to the depletion, inhibition or silencing of specific subpopulations of tumor cells, such as tumor-immortalizing cells or modulators that interact with a particular epitope or domain, it should be emphasized that such embodiments are merely illustrative and are not limiting in any sense. On the contrary, as set forth in the appended claims, the present disclosure generally relates to DLL3 modulators and their use in treating, managing or preventing various disorders associated with DLL3 regardless of any particular mechanism, binding region or target tumor cell population.

[0081] Regardless of the chosen form of the chosen modulator, it should be noted that the selected compound may be antagonistic. As used herein, an "antagonist" refers to a molecule capable of neutralizing, blocking, inhibiting, suppressing, reducing or interfering with the activity of a specific or specific target (e.g., DLL3), including binding to receptors with ligands or enzyme interactions with substrates. In this context, it should be noted that the DLL3 antagonists of the present disclosure may comprise any ligand, polypeptide, peptide, fusion protein, antibody or immunologically active fragment or derivative thereof that recognizes, reacts, binds, binds, competes, associates or otherwise interacts with the DLL3 protein or its fragment and eliminates, silences, reduces, inhibits, hinders, limits or controls the growth of cancer-initiating cells or other cancer cells, including tumor mass or NTG cells. Compatible antagonists may further include small molecule inhibitors, aptamers, antisense constructs, siRNAs, miRNAs and the like, receptor or ligand molecules and their derivatives that recognize or associate with the genotypic or phenotypic determinant of DLL3 thereby altering expression patterns or sequestering their binding or interaction with a substrate, receptor or ligand.

[0082] As used herein, in reference to two or more molecules or compounds, the terms "recognize" or "associate" are intended to indicate a reaction, binding, specific binding, combination, interaction, association, binding, unification, coalescence , fusion or junction, covalent or non-covalent, of molecules, as a result of which one molecule acts on the other molecule.

[0083] Furthermore, as demonstrated in the examples herein (e.g., see FIG 2B), some human DLL3 modulators may in some cases cross-react with DLL3 from a non-human (e.g., mouse) species. In other cases, exemplary modulators may be specific for one or more human DLL3 isoforms and will not show cross-reactivity with the DLL3 orthologs from other species. Of course, in connection with such teachings herein, such cases may include pan-DLL antibodies that bind to two or more members of the DLL family of one species or antibodies that only bind to DLL3.

[0084] In each case, and as will be discussed in more detail below, those skilled in the art will appreciate that the disclosed modulators can be used in conjugated or unconjugated form. That is, the modulator may be bound or conjugated (e.g., covalently or non-covalently) with pharmaceutically active compounds, biological response modifiers, anti-cancer agents, cytotoxic or cytostatic agents, diagnostic moieties or biocompatible modifiers. In this context, it should be understood that such conjugates may include peptides, polypeptides, proteins, fusion proteins, nucleic acid molecules, small molecules, mimetic agents, synthetic drugs, inorganic molecules, organic molecules and radioactive isotopes. In addition, as indicated in this text,

V. Manufacture and provision of modulators

A. Antibody modulators

1. Overview

[0085] As previously referred to the particularly preferred cases of the present disclosure, they include DLL3 modulators in the form of antibodies that preferably bind to one or more domains of the DLL3 protein isoform and, optionally, other members of the DLL family. Those skilled in the art will appreciate a well-developed knowledge base of antibodies as shown, for example, in Abbas et al., Cellular and

Molecular Immunology, ed. 6, WB Saunders Company (2010) or Murphey et al., Janeway's Immunobiology, ed. 8, Garland Science (2011).

[0086] The term "antibody" is intended to include polyclonal antibodies, multiclocal antibodies, monoclonal antibodies, chimeric antibodies, humanized and primatized antibodies, human antibodies, recombinantly produced antibodies, intrabodies, multispecific antibodies, bispecific antibodies, monovalent antibodies, multivalent antibodies, anti-idiotypic antibodies, synthetic antibodies, including muteins and variants thereof; antibody fragments, such as Fab fragments, F (ab ') fragments, single-chain FvFc, single-chain Fv; and their derivatives, including Fc fusions and other modifications, and any other immunologically active molecule, as long as they exhibit the desired biological activity (i.e., antigen binding or binding). Also, the term further includes all classes of antibodies (i.e., IgA, IgD, IgE, IgG and IgM) and all isotypes (i.e., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 and IgA2) as well as variants thereof, unless the context dictates otherwise. The heavy chain constant domains corresponding to the different classes of antibodies are designated by the corresponding lower Greek letter α, δ, ε, γ and μ. Light chains of antibodies from any vertebrate species can be assigned to one of two clearly distinct types, called kappa (κ) and lambda (λ), based on the amino acid sequences of their constant domains.

[0087] Although all such antibodies are included within the scope of the present invention, preferred embodiments including the immunoglobulin IgG class will be discussed in detail herein for purposes of illustration only.

[0088] As is well known, the variable domains of both parts of the light (VL) and heavy (VH) chains determine antigen recognition and specificity, and the constant light (CL) and heavy chain (CH1, CH2 or CH3) domains give and regulate important properties biological, such as secretion, transplacental mobility, circulating half-life, complement fixation and the like.

[0089] The "variable" region includes hypervariable sites that manifest in three segments, commonly referred to as complementarity determining regions (CDRs) in both the light chain and heavy chain variable domains. More highly conserved portions of the flanking variable CDR domains are referred to as framework regions (FRs). For example, in naturally occurring monomeric antibodies - immunoglobulin G (IgG), the six CDRs present on each "Y" arm are short, discontinuous amino acid sequences that are specifically positioned to create an antigen-binding site because the antibody assumes its three-dimensional configuration in water environment. Thus,

[0090] It should be noted that the position of the CDR can be easily identified by a person skilled in the art using standard techniques. Also known to those skilled in the art is the numbering system described in Kabat et al. (1991, NIH Publication 91-3242, National Technical Information Service, Springfield,

Va.). In this regard, Kabat et al. Have defined a numbering system for variable domain sequences that applies to any antibody. A specialist of ordinary skill in this field can clearly assign this "Kabat numbering" system to any variable domain sequence, without

To rely on any experimental data other than the sequence itself. Unless otherwise indicated, references to the numbering of particular positions of amino acid residues in the antibody are consistent with the Kabat numbering system.

[0091] Thus, according to Kabat, in VH, residues 31-35 are CDR1, residues 50-65 form CDR2, and 95-102 constitute CDR3, whereas in VL, residues 24-34 are CDR1, 50-56 are CDR2, and 89-97 make up CDR3. For the context, in VH, FR1 corresponds to the domain of the variable region encompassing amino acids 1-30; FR2 corresponds to the variable region domain comprising amino acids 36-49; FR3 corresponds to the domain of the variable region comprising amino acids 66-94, and FR4 corresponds to the variable region domain from amino acid 103 to the end of the variable region. The FRs for the light chain are similarly separated by each of the CDRs of the light chain variable region.

[0092] It should be noted that CDRs differ significantly between antibodies (and, by definition, will not show homology with the consensus sequences according to Kabat). In addition, the identity of certain individual residues at any Kabat site number can vary between the antibody chains due to interspecies or allelic discrepancies. An alternative numbering is given in Chothia et al., J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987) and MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262: 732745 (1996), although as in Kabat, the FR boundaries are separated by the appropriate CDR ends as described above. See also Chothia et al., Nature 342, pp. 877-883 (1989) and S. Dubel, ed. Handbook of Therapeutic Antibodies, ed. 3, WILEY-VCH Verlag GmbH and Co. (2007), where the definitions include overlapping or subsets of amino acid residues compared to each other.

[0093] Amino acid residues that contain binding regions or CDRs as defined in each of the above cited references and are provided below for purposes of comparison.

CDR definitions

<td></td><td>Undercoat¹</td><td>Chothia²</td><td>MacCallum³</td>

<td>Vh CDR1</td><td>31-35</td><td>26-32</td><td>30-35</td>

<td>Vh CDR2</td><td>50-65</td><td>50-58</td><td>47-58</td>

<td>Vh CDR3</td><td>95-102</td><td>95-102</td><td>93-101</td>

<td>Vl CDR1</td><td>24-34</td><td>23-34</td><td>30-36</td>

<td>Vl CDR2</td><td>50-56</td><td>50-56</td><td>46-55</td>

<td>Vl CDR3</td><td>89-97</td><td>89-97</td><td>89-96</td>

<td colspan="4">¹The numbering of residues is in accordance with the nomenclature according to Kabat et al., Supra ²The numbering of residues is consistent with the nomenclature according to Chothia et al., Supra³ The numbering of residues is consistent with the nomenclature according to MacCallum et al., Supra</td>

In the context of the present disclosure, it should be noted that any CDRs of the light and heavy chains disclosed from the mouse variable region amino acid sequences depicted in FIG. 11A or FIG. 11B may be combined or rearranged to provide optimized anti-DLL3 antibodies (e.g., humanized or chimeric anti-hDLL3) according to the present instructions. That is, one or more CDRs derived from the continuous light chain variable region amino acid sequences shown in FIG. 11A (SEQ ID NOS: 20 - 202, even numbers) or continuous sequences

The heavy chain variable region amino acid sequences shown in FIG. 11B (SEQ ID NOs: 21203, odd numbers) may be included in DLL3 modulator, and in particularly preferred cases in a CDR or humanized implanted antibody that immunospecifically combines with one or more DLL3 isoforms. Examples of the amino acid sequences of the light chain variable regions (SEQ ID NO: 204 - 212, even numbers) and heavy of such humanised modulators are shown in FIG. 11A and 11B. Taken together, these novel amino acid sequences represent ninety-two mouse and five humanized exemplary modulators according to the present disclosure. Also, the corresponding nucleic acid sequences of each of the ninety-two exemplary mouse modulators and the five humanized modulators shown in FIG. 11A and 11B are included in the sequence list attached to this application (SEQ ID NO: 220-413). [0095] In FIG. 11A and 11B, the CDRs described are defined using Chothia numbering. However, as discussed herein and illustrated in Example 8 below, one skilled in the art would readily define, identify, calculate and / or replace a CDR as determined in Kabat et al., Chothia et al. Or MacCallum et al. For each the corresponding heavy and light chain sequence depicted in FIG. 11A or FIG. 11B. According to this, each of the subject CDRs and antibodies comprising the CDRs determined by such nomenclature are expressly included within the scope of the present disclosure. More generally, the terms "variable region CDR amino acid residue" or more simply "CDRs" include amino acids in the CDRs identified using any sequence or structure based method as outlined above.

2. Preparation of an antibody modulator

a. Polyclonal antibodies [0096] The production of polyclonal antibodies in various host animals, including rabbits, mice, rats etc. is well known in the art. In some cases, the serum containing the anti-DLL3 polyclonal antibody is obtained by exsanguining or killing the animal. The serum may be used for research purposes in the form obtained from the animal or, optionally, the anti-DLL3 antibodies may be partially or completely purified to provide immunoglobulin fractions or homogeneous antibody preparations.

[0097] Briefly, the selected animal is immunized with the DLL3 immunogen (e.g., soluble DLL3 otherwise sDLL3), which may, for example, include selected isoforms, domains and / or peptides, or live cells or cell preparations expressing DLL3 or fragments thereof immunoreactive. Adjuvants known in the art that can be used to enhance the immune response, depending on the inoculated species include, but are not limited to, Freund's adjuvant (complete and incomplete), mineral gels such as aluminum hydroxide, surfactants, such as lysolecithin, pluronic polyols, polyanions, peptides, oil emulsions, keyhole limpet hemocyanins, dinitrophenol and potentially useful human adjuvants, such as BCG (Bacille Calmette-Guerin) and Corynebacterium parvum. Such adjuvants can protect the antigen from rapid dispersal, by sequestration in the local depository, or contain substances that stimulate the host to secrete chemotactic factors for macrophages and other components of the immune system. Preferably, the immunization schedule will comprise two or more administrations of the selected immunogen distributed over time for a predetermined time.

[0098] The amino acid sequence of the DLL3 protein as shown in FIG. 1C or 1D can be analyzed to select specific regions of the DLL3 protein for antibody production. For example, the hydrophobicity and hydrophilicity analyzes of the DLL3 amino acid sequence are used to identify hydrophilic regions in the DLL3 structure. The regions of DLL3 proteins that exhibit immunogenic structure as well as other regions and domains can be easily identified using a variety of other methods known in the art, such as Chou-Fasman, Garnier-Robson, Kyte-Doolittle, Eisenberg, Karplus-Schultz or Jameson-Wolf. Profiles of medium elasticity can be generated using the method of Bhaskaran R., Ponnuswamy PK, 1988, Int. J. Pept. Protein Res. 32: 242-255. The beta turn profiles can be generated using the Deleage, G. method, Roux B., 1987, Protein Engineering 1: 289-294. Thus, any DLL3 region, domain or motif identified by any of these programs or methods is within the scope of the present disclosure and may be isolated or modified to provide immunogens that give modulators containing desirable properties. Preferred methods for producing DLL3 antibodies are further illustrated by the Examples provided herein. Methods for producing a protein or polypeptide for use as an immunogen are well known in the art. Methods for producing immunogenic protein-carrier conjugates, such as BSA, KLH, or other carrier protein, are also well known. In some instances, direct conjugation is used using, for example, carbodiimide reagents; in other cases, linking reagents are effective. Administration of the immunogenic DLL3 is often carried out by injection at a suitable time and using a suitable adjuvant, as is well understood in the art. During the immunization schedule, antibody titers can be taken as described in the Examples below to determine the adequacy of antibody formation.

b. Monoclonal Antibodies. [0099] Furthermore, the disclosure relates to the use of monoclonal antibodies. As known in the art, the term "monoclonal antibody" (or mAb) refers to an antibody obtained from a population of substantially homogeneous antibodies, i.e. the individual population antibodies are identical except for possible mutations (e.g., naturally occurring mutations) that may occur in small amounts . In certain instances, such a monoclonal antibody comprises an antibody comprising a polypeptide sequence that binds to or links to an antigen, wherein the antigen-binding polypeptide sequence is obtained by a process comprising selecting a single polypeptide sequence that binds a single target from a plurality of polypeptide sequences.

[0100] More generally and as shown in Example 6 herein, monoclonal antibodies can be produced using a wide variety of techniques known in the art, including hybridomas, recombinant techniques, phage display technologies, transgenic animals (e.g., XenoMouse®), or their combination. For example, monoclonal antibodies can be produced using hybridomas and biochemical and genetic engineering techniques recognized in the art, such as described in more detail in An, Zhigiang (ed.) Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, John Wileynd Sons, first edition. 2009; Shire et al. (Ed.) Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Springer Science + Business Media LLC, first edition 2010; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Press Harbor Laboratory Press, Second Edition 1988; Hammerling, et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, NY, 1981.) It should be understood that the chosen binding sequence can be further altered, for example, to improve target affinity, humanize the target the binding sequence, improving it

In cell culture, reduce its immunogenicity in vivo, form a multispecific antibody, etc., and an antibody comprising an altered target binding sequence is also an antibody of the present disclosure.

c. Chimeric Antibodies [0101] In another instance, an antibody of the disclosure may comprise chimeric antibodies derived from covalently linked protein segments from at least two different species or types of antibodies. The term "chimeric" antibodies known in the art is directed to constructs in which part of the heavy and / or light chain is identical to or homologous to the corresponding sequences in antibodies from a particular species or belonging to a particular class or subclass of the antibody, while the rest of the chain ( s) is identical or homologous with the appropriate sequences in antibodies from another species or belonging to another class or subclass of the antibody, as well as fragments of such antibodies,

[0102] In one embodiment, the chimeric antibody according to the instructions herein may comprise murine V H and V L amino acid sequences and constant regions derived from human sources. In other compliant cases, the chimeric antibody of the present disclosure may be a humanised antibody as described below. In another embodiment, the so-called "CDR-grafted" antibody contains one or more CDRs from a particular species or belonging to a particular class or subclass of the antibody, while the rest of the antibody chain (s) is / are identical to or homologous with the corresponding sequence in the antibodies derived from another species or belonging to another antibody class or subclass. For use in humans, the rodent CDRs selected can be implanted in a human antibody, replacing one or more naturally occurring variable regions or CDRs of a human antibody. These constructs usually have the advantages of providing full-value modulator functions (e.g., CDC (complement-dependent cytotoxicity), ADCC (antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), etc.), while reducing the patient's undesirable immune responses to the antibody.

d. Humanized antibodies [0103] Similar to a CDR-grafted antibody is a "humanized" antibody. As used herein, "humanized" forms of non-human (e.g., mouse) antibodies are chimeric antibodies that contain a minimal sequence derived from one or more non-human immunoglobulins. In one embodiment, the humanized antibody is a human immunoglobulin (acceptor or acceptor antibody) in which residues from the recipient CDRs are replaced by residues from the CDR of the non-human species (donor antibody), such as a mouse, rat, rabbit, or non-human primate. having the desired specificity, affinity and / or ability. In certain preferred embodiments, the residues in one or more FRs in the variable domain of the human immunoglobulin are replaced with the corresponding non-human residues from the donor antibody to help maintain the appropriate three-dimensional configuration of the implanted CDRs, thereby improving affinity. In addition, humanized antibodies may contain residues that are not found in the recipient antibody or donor antibody, for example, to further refine antibody performance.

[0104] CDR-grafted and humanized antibodies are described, for example, in USPN 6,180,370 and

5,693,762. The humanized antibody may optionally also contain at least a portion of an immunoglobulin Fc, typically a human immunoglobulin. For further details, see, e.g., Jones et al., Nature 321: 522-525 (1986); and USPN, 6,982,321 and 7,087,409. Yet another method is referred to as "humaneering", which is described, for example, in USPN 2005/0008625. In addition, the non-human antibody may also be modified by specific removal of human T cell epitopes or "deimmunization" by methods disclosed in WO 98/52976 and WO 00/34317.

[0105] Humanized antibodies can also be bioengineered using commonly used molecular biology techniques, such as isolating, manipulating and expressing nucleic acid sequences that encode all or part of the immunoglobulin variable regions from at least one heavy or light chain. In addition to the sources of such nucleic acid noted above, human germline sequences as disclosed, e.g., in Tomlinson, IA et al. (1992) J. Mol are available. Biol. 227: 776-798; Cook, GP et al. (1995) Immunol. Today 16: 237242; Chothia, D. et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799-817; and Tomlinson et al. (1995) EMBO J 14: 4628-4638. In the V-BASE catalog (VBASE2 - Retter et al., Nucleic Acid Res. 33, 671-674, 2005) provides an extensive catalog of human immunoglobulin variable region sequences (developed by Tomlinson, IA et al., MRC Center for Protein Engineering, Cambridge, United Kingdom). Consensus human FRs may also be used, e.g. as described in USPN 6,300,064.

[0106] In selected embodiments and as specifically described in Example 8 below, at least 60%, 65%, 70%, 75% or 80% of the amino acid or amino acid residues of a heavy or light chain variable region of a CDR-grafted antibody will correspond to this the FR and CDR sequences of human recipients. In other embodiments, at least 85% or 90% of the variable region residues of the humanized antibodies will correspond to those of the FR and CDR recipients. In a further preferred embodiment, more than 95% of the variable region regions of the humanized antibody will correspond to those of the FR and CDR recipient sequences.

e. Human Antibodies [0107] In another embodiment, the antibodies can be fully human antibodies. The term "human antibody" refers to an antibody that has an amino acid sequence corresponding to a human-made antibody sequence and / or produced using any of the techniques for making human antibodies.

[0108] Human antibodies can be made using various techniques known in the art. One of the techniques is phage display in which a library of (preferably human) antibodies is synthesized on phages, the library is screened with the antigen of interest or its antibody binding portion, and the phage that binds to the antigen is isolated from which immunoreactive fragments can be obtained . Methods for preparing and screening such libraries are well known, and kits for producing phage display libraries are commercially available (e.g., the Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Catalog No. 27-9400-01 and Stratagene SurfZAP ™ phage display kit, catalog number 240612 ). There are also other ways and reagents,

[0109] In one case, the recombinant human antibodies can be isolated by screening a recombinant co-library of antibodies prepared as above. In one case, the library is a library of scFv phage display, produced using human VL and VH cDNA generated from mRNA isolated from B cells.

[0110] Antibodies produced by naive (or natural or synthetic) libraries may have moderate affinity (Ka of about 10⁶ up to 10⁷ M^-1), but affinity maturation can also be mimicked in vitro by constructing and reselecting from secondary libraries as described in the art. For example, the mutation can be introduced randomly in vitro using error prone polymerase (described in Leung et al, Technique, 1: 11-15 (1989)). Additionally, affinity maturation can be performed by randomly mutating one or more CDRs, e.g. by using PCR with primers carrying a random sequence comprising the CDRs of interest in selected individual Fv clones and screening for higher affinity clones. WO 9607754 describes a method for inducing mutagenesis in the CDR of an immunoglobulin light chain to form a light chain gene library. Another effective approach is the recombination of VH or VL domains selected by phage display, with repertoires of naturally occurring V domain variants obtained from non-immunized donors and for screening for greater affinity in several rounds of chain shuffling, as described in Marks et al., Biotechnol. 10: 79-783 (1992). This technique allows the production of antibodies and antibody fragments with a KD dissociation constant (koff / kon) of about 10^-9 M or smaller.

[0111] In other cases, similar procedures may be used using libraries containing e. E. Cross-sectional cells (e.g., yeast) that express binding pairs on their surface. See, for example, USN 7,700,302 and USSN 12 / 404,059. In one instance, the human antibody is selected from a phage display library, wherein said phage library expresses human antibodies (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14: 309-314 (1996): Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 6157 -6162 (1998). In other cases, human binding pairs can be isolated from combinatorial libraries of antibodies produced in eukaryotic cells, such as yeast. See, e.g., USPN 7.,700,302, such techniques preferably allow a large number of modulators to be screened and provide relatively easy manipulation of sequences. candidates (e.g.

[0112] Human antibodies can also be produced by introducing human immunoglobulin loci into transgenic animals, e.g., mice in which endogenous immunoglobulin genes have been partially or completely inactivated, and human immunoglobulin genes have been introduced. After challenge, the production of a human antibody is observed, which is very similar to that observed in humans in all aspects, including gene rearrangement, assembly and antibody repertoire. This approach is described, for example, in USPN 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016 and USPN 6,075,181 and 6,550,584 with respect to XenoMouse® technology; and Lonberg and Huszar, Intern. Rev Immunol. 13: 65-93 (1995). Alternatively, the human antibody can be prepared by immortalizing human B-lymphocytes producing an antibody directed against a target antigen (such B-lymphocytes can be recovered from a subject suffering from a cancerous disease or could be immunized in vitro). See, e.g., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Immunol, 147 (1): 86-95 (1991); and USPN 5,750,373.

EP 2 817 338 B1

3. Further processing [0113] Regardless of how obtained, the cells that produce modulators (e.g., hybridoma, yeast colonies, etc.) can be selected, cloned and screened to achieve the desired properties, including, for example, a strong growth, high production of antibodies and, as discussed in more detail below, the desired properties of the antibody. Hybridomas can be propagated in vivo in syngenic animals, in animals that have no immune system, e.g., nude mice or in vitro in vitro collial culture. Methods for selecting, cloning and multiplying hybridomas and / or colonies, each of which produces distinct species of antibodies, are well known to those skilled in the art.

B. Generation of a recombinant modulator

1. Review [0114] Once the source has been refined, the DNA encoding the desired DLL3 modulators can be easily isolated and sequenced using conventional procedures (e.g., using oligonucleotide probes capable of specifically binding to genes coding for antibody heavy and light chains). Isolated and subcloned hybridoma cells (or phage or yeast derived colonies) can serve as a preferred source of such DNA if the modulator is an antibody. If desired, the nucleic acid can be further manipulated as described herein to prepare agents, including fusion proteins or chimeric, humanized or fully human antibodies. More specifically, isolated DNA (which can be modified) can be used to sequentially and variable regions for antibody production.

[0115] Accordingly, in exemplary cases, antibodies can be produced recombinantly, using conventional procedures (such as those shown in Al-Rubeal, An and Shire et al., All above and Sambrook J. and Russell D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Press Harbor Press Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (2000), Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John &amp; Sons, Inc. (2002)), in which isolated and subcloned hybridoma cells (or phage or yeast derived colonies) serve as a preferred source of nucleic acid molecules.

[0116] The term "nucleic acid molecule" as used herein, includes DNA molecules and RNA molecules and their artificial variants (e.g., peptide nucleic acids), whether single-stranded or double-stranded. The nucleic acids may encode one or both of the antibody chains of the disclosure or a fragment or derivative thereof. The nucleic acid molecules of the disclosure also include sufficient polynucleotides for use as hybridization probes, PCR primers or sequencing primers to identify, analyze, mutate or amplify a polynucleotide encoding a polypeptide; antisense nucleic acids for inhibiting expression of a polynucleotide, as well as complementary sequences. The nucleic acids may be of any length. They may have, for example, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 750, 1000, 1500, 3000, 5000 or more nucleotides, and / or may comprise one or more additional sequences, e.g. regulatory sequences and / or be part of a larger nucleic acid, for example, a vector. It will be appreciated that such nucleic acid sequences may be further manipulated to produce modulators including chimeric, humanized or fully human antibodies. In particular, isolated nucleic acid molecules (which can be modified) can be that such nucleic acid sequences can be further manipulated to produce modulators including chimeric, humanized or fully human antibodies. In particular, isolated nucleic acid molecules (which can be modified) can be that such nucleic acid sequences can be further manipulated to produce modulators including chimeric, humanized or fully human antibodies. In particular, isolated nucleic acid molecules (which can be modified) can be

For use in the sequencing of constant and variable region sequences for the production of antibodies described in USPN 7,709,611.

[0117] The term "isolated nucleic acid" means that the nucleic acid has been (i) amplified in vitro, e.g. by polymerase chain reaction (PCR), (ii) recombinantly produced by cloning, (iii) purified, for example, by cleavage and electrophoretic fractionation in a gel, or (iv) synthesized, for example, by chemical synthesis. The isolated nucleic acid is a nucleic acid that is available for manipulation by recombinant DNA techniques.

[0118] Whether the nucleic acid source encoding the desired immunoreactive portion of the antibody is obtained whether it is from phage display technology, yeast libraries, hybridoma or synthetic technology, it is to be understood that the present disclosure includes nucleic acid molecules and sequences encoding antibodies or their binding fragments. antigen or derivatives thereof. Furthermore, the present disclosure relates to vectors and host cells comprising such nucleic acid molecules.

2. Hybridisation and Sequence Identity [0119] As indicated, the disclosure further provides nucleic acids that hybridize with other nucleic acids under specific hybridization conditions. More specifically, the disclosure includes nucleic acid molecules that hybridize under conditions of moderate or high stringency hybridization (e.g., as defined below) to the nucleic acid molecules of the invention. Methods for nucleic acid hybridization are well known in the art. As is well known, moderately stringent hybridization conditions include a pre-rinse solution containing 5x sodium chloride / sodium citrate (SSC), 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA (pH 8.0), hybridization buffer with about 50% formamide. , 6xSSC and annealing temperature of 55 ° C (or other similar hybridization solutions, such as containing about 50% formamide, hybridization temperature of 42 ° C), and rinsing conditions: 60 ° C, in 0.5xSSC, 0.1% SDS. By way of comparison, hybridization under very stringent hybridization conditions involves washing 6xSSC at 45 ° C followed by one or more washes in 0.1x SSC, 0.2% SDS at 68 ° C. In addition, those skilled in the art may manipulate the hybridization and / or lavage conditions to increase or decrease the stringency of hybridization, so that nucleic acids constituting nucleotide sequences that are at least about 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, 98% or 99% identical to each other usually remain hybridized with each other. 2% SDS at 68 ° C. In addition, those skilled in the art may manipulate the hybridization and / or lavage conditions to increase or decrease the stringency of hybridization, so that nucleic acids constituting nucleotide sequences that are at least about 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, 98% or 99% identical to each other usually remain hybridized with each other. 2% SDS at 68 ° C. In addition, those skilled in the art may manipulate the hybridization and / or lavage conditions to increase or decrease the stringency of hybridization, so that nucleic acids constituting nucleotide sequences that are at least about 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% , 95%, 98% or 99% identical to each other usually remain hybridized with each other.

[0120] The disclosure also includes nucleic acid molecules that are "substantially identical" to the described nucleic acid molecules. In one instance, the term "substantially identical" with respect to medium nucleic acid sequences can be understood as a sequence of nucleic acid molecules exhibiting at least about 65%, 70%, 75%, 80%, 85% or 90% sequence identity. In other cases, the nucleic acid molecules exhibit 95% or 98% sequence identity with a reference nucleic acid sequence.

[0121] The basic parameters influencing the choice of hybridization conditions and guidelines for developing the appropriate conditions are defined, for example, in: Sambrook, Fritsch and Maniatis (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, chapters 9 and 11 and Current Protocols in Molecular Biology, 1995, Ausubel et al., ed. John Wiley &amp; Sons, Inc., sections 2.10 and 6.36.4) and can be readily determined by those of ordinary skill in the art, e.g. based on the length and / or basic composition of the nucleic acid.

[0122] Sequence similarity for polypeptides, also referred to as sequence identity, is typically measured using sequence analysis software. Protein analysis software matches similar sequences using similarity measures assigned to various substitutions, deletions and other modifications, including conservative amino acid substitutions. For example, the GCG sequence analysis tool (Accelrys Software Inc.) includes programs such as "GAP" and "BEST-FIT" that can be used with default parameters to determine sequence homology or sequence identity between tightly linked polypeptides, such as as homologous polypeptides from various species of organisms or between wild-type protein and its mutein. (See, e.g., GCG version 6.1 or Durbin et al.

[0123] Polypeptide sequences may also be compared using FASTA using the default or recommended parameters of the GCG program version 6.1. FASTA (e.g., FASTA2 and FASTA3) providing matches and percent sequence identity of the regions that best overlap between the query sequence and the search sequence (Pearson (2000)). Another preferred sequence comparison algorithm according to the disclosure with a database containing a large number of sequences from different organisms is the BLAST computer program, in particular blastp or tblast, using default parameters. See, e.g., Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403 410 and Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389 402.

[0124] Accordingly, the disclosure also includes nucleic acid molecules that encode polypeptides that are "substantially identical" to the antibody variable polypeptide sequence (e.g., either a light or heavy chain variable region or light chain acceptor variable region; heavy). With respect to such polypeptides, the terms "basic ideality" or "substantially ideal" mean that two peptide sequences, optimally matched, as in the GAP or BEST-FIT programs using the default gap weights, have at least 60% or 65% sequence identity, preferably at least 70%, 75%, 80%, 85% or 90% sequence identity, even more preferably at least 93%, 95%, 98% or 99% sequence identity. preferably, residue positions that are not identical differ by conservative amino acid substitutions. A "conservative amino acid substitution" is one in which the amino acid residue is substituted by another amino acid residue having a side chain (group R) with similar chemical properties (e.g., charge or hydrophobicity). In general, a conservative amino acid substitution will not substantially change the functional properties of the protein. In cases where two or more amino acid sequences differ from each other by conservative substitutions, the percent sequence identity or degree of similarity may be adjusted upward to improve the conservative nature of the substitution. wherein the amino acid residue is substituted with another amino acid residue having a side chain (R group) with similar chemical properties (e.g., charge or hydrophobicity). In general, a conservative amino acid substitution will not substantially change the functional properties of the protein. In cases where two or more amino acid sequences differ from each other by conservative substitutions, the percent sequence identity or degree of similarity may be adjusted upward to improve the conservative nature of the substitution. wherein the amino acid residue is substituted with another amino acid residue having a side chain (R group) with similar chemical properties (e.g., charge or hydrophobicity). In general, a conservative amino acid substitution will not substantially change the functional properties of the protein. In cases where two or more amino acid sequences differ from each other by conservative substitutions, the percent sequence identity or degree of similarity may be adjusted upward to improve the conservative nature of the substitution.

3. Expression [0125] Differentiated recombinant expression processes, i.e. RNA or RNA and protein / peptide production, are well known, as shown in Berger and Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology vol 152 Academic Press, Inc., San Diego, California; Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual (3rd edition), vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, (2000); and Current Protocols in Molecular Biology, FM Ausubel et al., ed., Current Protocols, joint

EP 2 817 338 B1 project between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley &amp; Sons, Inc. (supplemented to

2006).

[0126] Certain terms of interest include an "expression control sequence" that includes promoters, ribosome binding sites, enhancers, and other controls that regulate gene transcription or mRNA translation. As is well-known, a "pro motor" or "promoter region" refers to a nucleic acid sequence that is usually above (5 ') to the expressed nucleic acid sequence and controls the expression of the sequence by providing a recognition and binding site for the RNA polymerase.

[0127] Exemplary promoters according to the invention include the SP6, T3 and T7 polymerase promoters, human U6 RNA promoter, CMV promoter and their artificial hybrid promoters (e.g. CMV), where part or parts are fused with parts or portions of gene promoters of other cellular proteins such as, e.g., human GAPDH (3-phosphate dehydrogenase) and including or not including additional introns.

[0128] In certain instances, the nucleic acid molecule may be present in the vector, as appropriate, with a promoter that controls the expression of the nucleic acid. The well-known term "vector" includes any intermediate nucleic acid carrier that allows, for example, the introduction of nucleic acid into prokaryotic and / or eukaryotic cells and, where appropriate, for integration into the genome. Methods for transforming mammalian cells are well known in the art. See, for example, USPN 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 and 4,959,455. Vectors may include a nucleotide sequence encoding an antibody of the disclosure (e.g., a whole antibody, antibody heavy or light chain, VH or VL, or a portion thereof, or CDRs of a heavy or light chain,

[0129] Various host expression vector systems are available in the art, many of which are as described herein and may be used to express the modulators of the invention. Such systems include, but are not limited to, microorganisms, such as bacteria (e.g., E. coli, B. subtilis, Streptomyces) transformed with recombinant bacteriophage DNA, plasmid DNA, or expression vectors - DNA cosmids containing coding sequences of the modulator; yeast (e.g., Saccharomyces, Pichia) transfected with recombinant yeast expression vectors containing coding sequences of the modulator; insect cell systems infected with recombinant virus expression vectors (e.g., baculovirus) containing coding sequences of the modulator; plant cell systems (e.g. Nicotiana, Arabidopsis, eyelash, maize, wheat, potato etc.) infected with recombinant virus expression vectors (e.g., cauliflower mosaic virus, tobacco mosaic virus) or transfected with recombinant plasmid expression vectors (e.g., a Ti plasmid) containing coding sequences of the modulator; or mammalian cells (e.g., COS, CHO, BHK, 293, 3T3 cells, etc.) carrying recombinant expression constructs containing promoters derived from the genome of mammalian cells (e.g., metallothionein promoter) or mammalian viruses (e.g., adenovirus late promoter, promoter 7.5 K virus of vaccinia).

[0130] As used herein, the term "host cell" includes any type of cellular system that can be engineered to produce the polypeptides and antigen-binding molecules of the present disclosure. In one case, the host cell is designed to allow production of the antigen-binding molecule with the modified

Glycoforms. In a preferred embodiment, the antigen binding molecule or variant of the antigen binding molecule is an antibody, an antibody fragment or a fusion protein. In some instances, the host cells have been further manipulated to express increased levels of one or more polypeptides with N-acetylglutaminyltransferase III (GnT111) activity. Compatible host cells include cultured cells, e.g. cultured mammalian cells such as CHO cells, BHK cells, NSO cells, SP2 / 0 cells, YO myeloma cells, P3X63 mouse myeloma cells, PER cells, PER.C6 cells or hybridoma cells, cells. yeast, insect cells and plant cells, to name but a few, but also cells contained in a transgenic animal, transgenic plant or cultured plant or animal tissue.

[0131] For stable long-term production of recombinant proteins, stable expression is preferred. Accordingly, cell lines that stably express the selected modulator may be designed using standard techniques known in the art. Instead of using expression vectors that contain a viral origin of replication, host cells can be transformed with DNA controlled by appropriate expression control elements (e.g., promoter, enhancer, sequences, transcription terminators, polyadenylation sites, etc.) and a selection marker. Any of the selection systems well known in the art may be used, including a glutamine synthetase gene (GS system) expression system that provides an effective approach for enhancing expression under certain conditions.

[0132] Another preferred expression system, the Freedom ™ CHO-S Kit is commercially available from Life Technologies (catalog number A13696-01) also allows the development of stable cell lines that can be used to produce the modulator.

[0133] Such host expression systems represent carriers with which interesting coding sequences can be made and then purified, but also cells that can, when transformed or transfected with the appropriate nucleotide coding sequences, express the molecule of the in situ disclosure. The host cell may be co-transfected with two expression vectors of the invention, e.g., a first vector encoding a heavy chain derived polypeptide and a second vector encoding a light chain derived polypeptide.

[0134] Thus, in some cases, the present disclosure provides recombinant host cells that allow the expression of antibodies or portions thereof. Antibodies generated by expression in such recombinant host cells are referred to herein as recombinant antibodies. The present disclosure also provides progeny of such host cells and the antibodies they produce.

C. Chemical Synthesis [0135] In addition, modulators can be synthesized chemically using techniques known in the art (e.g., see Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, WH Freeman &amp; Co., NY and Hunkapiller, M., et al. , 1984, Nature 310: 105-111). In addition, if desired, non-classical or chemical amino acid analogs (such as the D-isomers of common amino acids, 2,4-diaminobutyric acid, α-aminoisobutyric acid, 4-aminobutanoic acid, etc.) can be introduced as a substitution or addition to the polypeptide sequence.

D. Transgenic systems

[0136] In other instances, modulators may be produced transgenically by producing a mammal or plant that is transgenic to recombinant molecules, such as heavy and light chains of the immunoglobulin and which produce the desired compounds in a recoverable form. This includes, for example, the production of protein modulators (e.g., antibodies) in, and recovery from, goat's milk, cow's milk or other mammals. See, e.g., USPN 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 and 5,741,957. In some cases, transgenic non-human animals that contain human immunoglobulin loci are immunized to produce antibodies.

[0137] Other transgenic techniques are shown in Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual 2 ed., Cold Spring Harbor Press (1999); Jackson et al., Mouse Genetics and Transgenics: A Practical Approach, Oxford University Press (2000); and Pinkert, Transgenic Animal Technology: A Laboratory Handbook, Academic Press (1999) and USPN 6,417,429. In some cases, non-human animals are mice, rats, sheep, pigs, goats, cattle or horses, and the desired product is produced in blood, milk, urine, saliva, tears, mucus and other body fluids from which it is easy to obtain using known cleaning techniques.

[0138] Other compatible production systems include methods for producing antibodies in plants, such as described, for example, in USPN 6,046,037 and 5,959,177.

E. Isolation / Purification [0139] When the modulator of the disclosure was produced by recombinant expression or any other of the disclosed techniques, it can be purified by any method known in the art for the purification of immunoglobulins or proteins. Therefore, the modulator can be "isolated", which means it has been identified and separated and / or recovered from the component from its natural environment. Ingredients of environmental pollution are substances that could interfere with the diagnostic or therapeutic use of the polypeptide and may include enzymes, hormones and other proteins or non-proteinaceous solutes. Isolated modulators include an in-situ modulator within recombinant cells, since at least one component of the polypeptide's natural environment will not be present.

[0140] If the desired molecule is produced intracellularly, particulate fragments, either host cells or lysed fragments, for example, by centrifugation or ultrafiltration, can be removed as a first step. When the modulator is secreted into the medium, the supernatants from such expression systems are usually first concentrated using a commercially available protein concentration filter, for example, an Amicon or Pellicon ultrafiltration unit (Millipore Corp.). After removal of the insoluble impurities, the modulator preparation can be further purified using standard techniques, such as, for example, hydroxylapatite chromatography, gel electrophoresis, dialysis and affinity chromatography, with particular affinity chromatography being the subject of interest. In this context, protein A can be used to purify antibodies that are based on human IgG1, IgG2 or IgG4 heavy chains (Lindmark, et al., J Immunol Meth 62: 1 (1983)), while G protein is recommended for all isotypes mouse and human IgG3 (Guss, et al., EMBO J 5: 1567 (1986)). Other protein purification techniques such as ion exchange column fractionation, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, silica gel chromatography, heparin chromatography, sepharose chromatography on an anion or cation exchange resin (such as a poly aspartic acid column), focusing chromatography, SDS-PAGE and ammonium sulfate precipitation are while G protein is recommended for all mouse isotypes and for human IgG3 (Guss, et al., EMBO J 5: 1567 (1986)). Other protein purification techniques such as ion exchange column fractionation, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, silica gel chromatography, heparin chromatography, sepharose chromatography on an anion or cation exchange resin (such as a poly aspartic acid column), focusing chromatography, SDS-PAGE and ammonium sulfate precipitation are while G protein is recommended for all mouse isotypes and for human IgG3 (Guss, et al., EMBO J 5: 1567 (1986)). Other protein purification techniques such as ion exchange column fractionation, ethanol precipitation, reverse phase HPLC, silica gel chromatography, heparin chromatography, sepharose chromatography on an anion or cation exchange resin (such as a poly aspartic acid column), focusing chromatography, SDS-PAGE and ammonium sulfate precipitation are

Also available are depending on the antibody to be recovered. In particularly preferred cases, the modulators of the present disclosure will be purified, at least in part, by affinity chromatography for protein A or protein G.

VI. Fragments and derivatives of the DLL3 modulator [0141] Regardless of the methodology of manufacture and production chosen, the modulators of the present disclosure will react, bind, fuse, complex, fuse, join, join, interact with, or otherwise associate with a target determinant (e.g., antigen) and thus provide desired results. Where the modulator is an antibody or a fragment, construct or derivative thereof, such combinations may be through one or more "binding sites" or "binding members" expressed on the antibody, wherein the binding site is a polypeptide region that is responsible for the selective binding to the target molecule or an antigen of interest. Binding domains contain at least one binding site (e.g. the intact IgG antibody will have two binding domains and two binding sites). Exemplary binding domains include an antibody variable domain, a ligand receptor domain, a ligand binding domain or an enzyme domain.

A. Antibodies [0142] As mentioned above, the term "antibody" is intended to include at least polyclonal antibodies, multi-clonal antibodies, chimeric antibodies, CDR-grafted antibodies, humanized and primatized antibodies, antibodies, human antibodies, recombinantly produced antibodies, intrabodies, multispecific antibodies. , bispecific antibodies, monovalent antibodies, multivalent antibodies, anti-idiotypic antibodies, as well as synthetic antibodies.

B. Fragments [0143] Regardless of which modulator form (e.g., chimeric, humanized, etc.) is chosen to apply the disclosure in practice, it is understood that its immunoreactive fragments may be used in accordance with the present instructions. An "antibody fragment" contains at least a portion of an intact antibody. As used herein, the term "fragment" of an antibody molecule includes antigen-binding antibody fragments, and the term "antigen-binding fragment" refers to a fragment of a polypeptide immunoglobulin or antibody that immunospecifically binds or reacts with a selected antigen or its immunogenic determinant or competes with the intact antibody from which the fragments for specific antigen binding originate.

[0144] Exemplary fragments include: VL fragment, VH, scFv, F (ab ') 2, Fab fragment, Fd fragment, Fv fragment, single domain antibody fragments, diabodies, linear antibodies, single chain antibody molecules and multispecific antibodies formed from fragments antibodies. In addition, the active fragment contains a fragme nt of an antibody that retains its ability to interact with antigen / substrates or receptors and modifies them in a manner similar to the antibody intact (although with slightly lower efficacy).

[0145] In other embodiments, the antibody fragment is one that comprises an Fc region and that retains at least one of the biological functions normally associated with the Fc region, if present in the Fc region.

Intact antibodies, such as FcRn binding, modulation of antibody half-life,

ADCC and complement binding. In one embodiment, the antibody fragment is a monovalent antibody that has an in vivo half-life that is substantially similar to the intact antibody. For example, such an antibody fragment may comprise an antigen binding arm linked to an Fc sequence capable of conferring the fragment of stability in vivo.

[0146] As is well known to those skilled in the art, fragments can be obtained by chemical or enzymatic treatment (such as papain or pepsin) of an intact or complete antibody antibody chain or recombinant means. See, for example, Fundamental Immunology, WE Paul, ed. Raven Press, NY (1999), for a more detailed description of antibody fragments.

C. Derivatives [0147] The disclosure further includes derivatives of immunoreactive modulators and antigen binding molecules comprising one or more modifications.

1. Multivalent Antibodies [0148] In one embodiment, the modulators of the disclosure may be monovalent or polyvalent (e.g., divalent, trivalent, etc.). The term "valence", as used herein, refers to the number of candidate binding sites associated with the antibody. Each target binding site specifically binds a target molecule or a specific position or locus on the target molecule. When the antibody is monovalent, each binding site will specifically bind to a single antigen position or epitope. Where the antibody contains more than one target binding site (it is multivalent), each target binding site can specifically bind to the same or different molecules (e.g. it may bind to different ligands or different antigens or different epitopes or positions on the same antigen). See, for example, USPN 2009/0130105. In any case, at least one of the binding sites will include an epitope, motif or domain associated with the DLL3 isoform.

[0149] In one embodiment, the modulators are bispecific antibodies in which the two chains have different specificities as described in Millstein et al., 1983, Nature, 305: 537-539. Other embodiments include antibodies with additional specificities, such as trispecific antibodies. Other more sophisticated compatible multispecific constructs and methods for their preparation are set forth in USPN 2009/0155255 as well as in WO 94/04690; Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology, 121; 210; and WO96 / 27011.

[0150] As mentioned above, polyvalent antibodies can immunospecifically bind to different epitopes of a desired target molecule or they can immunospecifically bind to both a target molecule and a heterologous epitope, such as a heterologous polypeptide or a solid carrier material. Although preferred embodiments of anti-DLL3 antibodies bind only two antigens (i.e. they are bispecific antibodies), antibodies with additional specificities, such as trispecific antibodies, are also included in the present invention. Bispecific antibodies also include cross-linked or "heteroconjugate" antibodies. For example, one of the antibodies in a heteroconjugate may be conjugated with avidin and the other with biotin. Such antibodies, for example, have been proposed to target cells of the immune system to unwanted cells (USN 4,676,980) and to treat HIV infection (WO 91/00360, WO 92/200373 and EP 03089). Antibodies in the heteroconjugate can be 43

They can be prepared using any convenient cross-linking methods. Suitable crosslinking agents are well known in the art and are disclosed in USPN 4,676,980 along with a number of crosslinking techniques.

[0151] In yet other embodiments, the antibody variable domains with the desired binding specificities (antibody-antigen combining sites) are fused to immunoglobulin constant domain sequences, such as an immunoglobulin heavy chain constant domain comprising at least a portion of the hinge, CH2 and / or CH3 region, using methods well known to those skilled in the art.

2. Modifications of the Fc region [0152] In addition to the various modifications, substitutions, additions or deletions of the variable or binding region of the disclosed modulators (e.g., Fc-DLL3 or anti-DLL3 antibodies) described above, those skilled in the art will appreciate that selected examples of the present disclosure may also include include substitutions or modifications of a constant region (i.e., Fc region). More specifically, it is believed that the DLL3 modulators of the disclosure may include, but are not limited to, one or more additional substitutions, mutations and / or modifications of amino acid residues that yield a compound with advantageous features, including but not limited to: altered pharmacokinetics, increased serum half-life, increased binding affinity, reduced immunogenicity, increased production, altered binding of the Pc ligand to the Fc receptor (FcR), increased or decreased "ADCC" (antibody-dependent cytotoxicity) or "CDC" (complement-dependent cytotoxicity), altered glycosylation and / or disulphide bonds and modified binding specificity. In this context, it should be noted that these Fc variants can be advantageously used to increase the effective and neoplastic properties of the disclosed modulators.

For this purpose, some embodiments of the invention may include substitutions or modifications of the Fc region, e.g., the addition of one or more minor amino acid residues, substitutions, mutations and / or modifications to produce a compound with enhanced or beneficial Fc effector functions. For example, changes in amino acid residues involved in the interaction between the Fc domain and Fc receptor (e.g., FcγRI, FcγRIIA and B, FcγRIII and FcRn) can lead to increased cytotoxicity and / or altered pharmacokinetics, such as an increase in serum half-life (see, e.g. for breeding, Ravetch and Kinet, Annu Rev. Immunol 9: 457-92 (1991), Capel et al., Immu no methods 4: 25-34 (1994), and de Haas et al., J. Lab Clin Med 126: 330-41 (1995)).

[0154] In selected embodiments, antibodies with increased in vivo half-lives can be produced by modifying (e.g., substitution, deletion or addition) of amino acid residues identified as involved in interaction between the Fc domain and the FcRn receptor (see, e.g., International Publication No. WO 97 / 34631; WO 04/029207, USPN 6,737,056 and USPN 2003/0190311). With respect to such embodiments, the Fc variants may provide half-lives in a mammal, preferably a human, greater than 5 days, longer than 10 days, longer than 15 days, preferably longer than 20 days, longer than 25 days, longer than 30 days, longer than 35 days, longer than 40 days, longer than 45 days, longer than 2 months, longer than 3 months, longer than 4 months or longer than 5 months. The elongated half-life results in higher serum titer, which reduces the frequency of antibody administration and / or reduces the concentration of antibodies to be administered. Binding to human FcRn in vivo and the serum half-life of human polypeptides with high FcRn binding affinity can be tested, for example, in transgenic mice or transfected human lines

Cells expressing human FcRn or primate which are administered polypeptides with a variant Fc region. WO 2000/42072 describes antibody variants with improved or reduced binding to

FcRn. See also, for example, Shields et al. J. Biol. Chem. 9 (2): 6591-6604 (2001).

[0155] In other embodiments, the Fc changes may lead to an increase or decrease in ADCC or CDC activity. As is known in the art, the CDC refers to lysis of the target bone in the presence of complement, and ADCC refers to the form of cytotoxicity in which the secreted Ig bound to the FcRs present on some cytotoxic cells (e.g., natural killer, neutrophil and macrophage capsules) ) enables these cytotoxic effector cells to specifically bind to the target target bearing the antigen, and then kill the target cell with cytotoxins. In the context of the present invention, antibody variants are provided with an "altered" affinity of FcR binding, which is either an increased or decreased binding compared to a parental or unmodified antibody or an antibody comprising a native FcR sequence. Such variants that exhibit reduced binding may show little or no binding, e.g. 0-20% binding to FcR compared to the native sequence, e.g. as determined by techniques well known in the art. In other embodiments, the variant will exhibit enhanced binding compared to the Fc domain of the native immunoglobulin. It should be noted that these types of Fc variants can be advantageously used to enhance the effective anti-tumor properties of the disclosed antibodies. In still other embodiments, such changes lead to increased binding affinity, reduced immunogenicity, increased production, altered glycosylation and / or disulfide bonds (e.g., for conjugation sites), modified binding specificity, increased phagocytosis; and / or downregulation of cell surface receptors (e.g., B cell receptor, BCR), etc.

3. Altered glycosylation [0156] Yet other examples include one or more engineered glycoforms, i.e. a DLL3 modulator comprising an altered glycosylation pattern or an altered carbohydrate composition that is covalently linked to the protein (e.g., in the Fc domain). See, for example, Shields, RL et al. (2002) J. Biol. Chem. 277: 26733-26740. Engineered glycoforms may be useful for a variety of purposes, including, but not limited to, enhancing or reducing effector functions, enhancing the affinity of the modulator for a target, or facilitating the production of a modulator. In certain embodiments in which a reduced effector function is desired, the molecule may be designed to express the aglycosylated form. substitutions, which can eliminate one or more glycosylation sites of the variable region framework to eliminate glycosylation at this site are well known (see, e.g., USPN 5,714,350 and 6,350,861). In contrast, enhanced effector functions or improved binding may be conferred to a molecule comprising Fc through engineering at one or more additional glycosylation sites.

[0157] Other embodiments include an Fc variant that has an altered glycosylation composition, such as a hypofucosylated antibody having reduced amounts of fucosyl residues or an antibody having an increased number of dividing GlcNAc structures. It has been shown that such altered glycosylation patterns increase the ADCC capacity of the antibodies. Engineered glycoforms may be prepared by any method known to the person skilled in the art, using cells designed or variant expression strains, by coexpression with one or more enzymes (e.g., N-acetylglucosaminyltransferase III (GnTIII)), by expressing a molecule containing the Fc region in different

From organisms or cell lines from various organisms or by modifying the carbohydrate nucleus after expression of a molecule comprising an Fc region (see, for example, WO 2012/117002).

4. Additional Processing [0158] Modulators can be variously modified during or after preparation, for example, by glycosylation, acetylation, phosphorylation, amidation, derivatization by known protecting / blocking groups, proteolytic cleavage, binding to an antibody molecule or other cellular ligand, etc. Any of numerous chemical modifications can be carried out by known methods, including, but not limited to, specific cyanogen bromide chemical cleavage, trypsin, chymotrypsin, papain, V8 protease, NaBH4, acetylation, formylation, oxidation, reduction, metabolic synthesis in the presence of tunicamycin, etc.

[0159] Various post-translational modifications also encompassed by the invention include, for example, bonded or O-linked carbohydrate chains, N-terminal or C-terminal treatment, attachment of chemical moieties to the amino acid backbone, chemical modifications of N-linked or linked carbohydrate chains, and addition or deletion of the N-terminal methionine residue by expression of the prokaryotic host cell. In addition, modulators can also be modified with a detectable label, such as an enzymatic, fluorescent, radioisotope or affinity tag to allow detection and isolation of the modulator.

VII. Characteristics of the modulator [0160] Regardless of how the modulator obtained or of the above-mentioned embodiments, different cases of disclosed modulators may exhibit certain characteristics. In selected cases, antibody-producing cells (e.g., hybridomas or yeast colonies) can be selected, cloned and further screened for beneficial properties, including, e.g., strong growth, high modulator production and, as discussed in more detail below, desirable characteristics characteristic modulator. In other cases, the modulator's characteristics may be transmitted or influenced by selecting a particular antigen (e.g., a specific DLL3 isoform) or an immunoreactive fragment of a target antigen to inoculate the animal.

A. Modulatory neutralizujące [0161] W pewnych przypadkach modulatory będą obejmować przeciwciała "neutralizujące" lub ich pochodne lub fragmenty. Oznacza to, że niniejsze ujawnienie może obejmować cząsteczki przeciwciał, które wiążą określone domeny, motywy lub epitopy i są zdolne do blokowania, zmniejszania lub hamowania aktywności biologicznej DLL3. Bardziej ogólnie określenie "przeciwciało neutralizujące" odnosi się do przeciwciała, które wiąże się z lub oddziałuje z docelową cząsteczką lub ligandem i zapobiega związaniu lub skojarzeniu cząsteczki docelowej z partnerem wiążącym, takim jak receptor lub substrat, przerywając w ten sposób odpowiedź biologiczną, która inaczej wynikłaby z oddziaływania cząsteczek.

[0162] It should be noted that competitive binding assays known in the art can be used to assess the binding and specificity of an antibody or a functional fragment thereof or a derivative thereof. In relation to the present invention, the antibody or fragment will be intended to inhibit or reduce the binding of DLL3 to the binding partner or substrate when the excess antibody reduces

The amount of binding partner associated with DLL3 by at least about 20%, 30% 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 99% or more, as measured, for example, by Notch receptor activity or in an in vitro competitive binding assay. In the case of antibodies directed against DLL3, for example, a neutralizing antibody or antagonist will preferably change Notch receptor activity by at least about 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% , 95%, 97%, 99% or more. It should be noted that this modified activity can be measured directly using techniques recognized in the art or can be measured by the effect of altered activity on a lower level (e.g., oncogenesis, cell survival or activation or suppression of Notch-responsive genes). preferably,

B. Internalizing modulators [0163] There is evidence that a significant portion of the expressed DLL3 protein remains bound to the surface of tumor cells, which allows the localization of disclosed modulators. In preferred cases, such modulators may be associated with, or conjugated to, anticancer agents, such as cytotoxic moieties that kill the chip after internalization. In particularly preferred cases, the modulator will be a conjugate antibody internalizing the antigen.

[0164] As used herein, a modulator that "internalizes" is one that is picked up by a bone (along with any charge) when bound to a combined antigen or receptor. It is understood that the internalizing modulator may, in a preferred embodiment, be an antibody, including antibody fragments and derivatives thereof, as well as antibody conjugates. Internalisation may occur in vitro or in vivo. In therapeutic applications, internalization will preferably occur in the individual in need thereof. The number of internalized antibody molecules internalized may be sufficient or adequate to kill the antigen-expressing cell, especially the antigen-expressing cancer stem cells. In some cases, depending on the strength of the antibody or antibody conjugate, the uptake of a single antibody molecule into a cell is sufficient to kill the target cell to which the antibody binds. For example, certain toxins are so strong that the internalization of several toxin-conjugated toxin molecules is enough to kill the cancer cell. Whether the antibody is internalized during binding to a mammalian cell can be determined by various tests, including those described in the examples below (e.g., Examples 12 and 15-17). Methods for detecting whether an antibody internalizes into a cell are also described in USPN 7,619,068. that the internalization of several toxin molecules conjugated with the antibody is enough to kill the cancer cell. Whether the antibody is internalized during binding to a mammalian cell can be determined by various tests, including those described in the examples below (e.g., Examples 12 and 15-17). Methods for detecting whether an antibody internalizes into a cell are also described in USPN 7,619,068. that the internalization of several toxin molecules conjugated with the antibody is enough to kill the cancer cell. Whether the antibody is internalized during binding to a mammalian cell can be determined by various tests, including those described in the examples below (e.g., Examples 12 and 15-17). Methods for detecting whether an antibody internalizes into a cell are also described in USPN 7,619,068.

C. Exhaustive Modulators [0165] In other embodiments, the antibodies will be exhaustive antibodies or derivatives thereof or fragments thereof. The term "exhaustive" antibody refers to an antibody that preferably binds to or links to an antigen on or near a cell surface and induces, promotes or causes death or elimination of a cell (e.g., by CDC, ADCC or the introduction of a cytotoxic agent). In some embodiments, selected exhaustive antibodies will be bound or conjugated to a cytotoxic agent.

[0166] Preferably, the exhaustive antibody will be capable of removing, exhausting, eliminating or killing at least 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90% , 95%, 97% or 99% of DLL3 cells that cause tumor formation in a particular cell population. In some embodiments, the cell population may be enriched, divided, purified, or isolated cancer immortalizing cells. In other embodiments, the cell population can be whole tumor samples or heterogeneous tumor extracts that contain tumor immortalizing cells. Those skilled in the art will appreciate that standard biochemical techniques as described in the Examples below (e.g.

D. Grouping and binding of the epitope [0167] It will further be appreciated that the disclosed anti-DLL3 antibody modulators will be associated with or associated with distinct epitopes or immunogenic determinants presented by the selected target or fragment thereof. In certain embodiments, the epitopes or immunogenic determinants include chemically active surface groupings of molecules, such as amino acids, sugar side chains, phosphoryl or sulfonyl groups, and in certain embodiments may have specific three-dimensional structural features and / or specific charge characteristics. Thus, as used herein, the term "epitope" includes any determinant protein that is capable of specifically binding to an immunoglobulin receptor or T cell or otherwise interacting with a molecule. In certain embodiments, an antibody specifically binds (or immunospecifically binds or reacts) to an antigen when it preferentially resolves its target antigen in a complex mixture of proteins and / or macromolecules. In preferred embodiments, it is said that the antibody specifically binds the antigen when the dissociation equilibrium constant (KD) is less than or equal to 10.^-6M or less or equal to 10^-7M, more preferably when the dissociation equilibrium constant is less than or equal to 10^-8M, and even more preferably, when the dissociation constant is less than or equal to 10^-9M [0168] More directly, the term "epitope" is used in its common biochemical sense and refers to that portion of a target antigen capable of being recognized and specifically bound by a particular modulator that is an antibody. When the antigen is a polypeptide, such as DLL3, epitopes can generally be formed from both contiguous amino acids and non-contiguous amino acids assembled by tertiary protein folding ("conformational epitopes"). In such conformational epitopes, the interaction points are between the residues and the amino acids on the protein, which are linearly separated from each other. Epitopes created from adjacent amino acids (sometimes referred to as "linear" or "continuous" epitopes) are usually preserved during protein denaturation, whereas epitopes formed by tertiary folding are usually lost during protein denaturation. In each case, the antibody epitope typically includes at least 3, and most often at least 5 or 810 amino acids in a unique spatial configuration.

[0169] In this context, it should be noted that in some cases the epitope may be associated with or located in one or more regions, domains or motifs of the DLL3 protein (e.g., amino acids 1618 of the isoform 1). As discussed in more detail herein, the extracellular region of the DLL3 protein contains a number of generally recognized domains, including six EGF-like domains and a DSL domain. For the purposes of this disclosure, the term "domain" will be used in accordance with its generally accepted

It will refer to an identifiable or definable conserved structural unit in a protein that exhibits a characteristic secondary structure content. In many cases, homologous domains with common functions will typically show sequence similarity and are found in many different proteins (e.g., EGF-like domains are reportedly found in at least 471 different proteins). Likewise, the term "motif" known in the art will be used in accordance with its common meaning and will generally refer to a short, conserved region of a protein that is typically from ten to twenty contiguous amino acid residues. As discussed, selected cases are modulators that associate with or bind to an epitope in specific regions, domains or DLL3 themes.

[0170] In any case, when determining the desired epitope on an antigen, it is possible to generate antibodies against this epitope, e.g. by immunization with an epitope-containing peptide using the techniques described in the present invention. Alternatively, during the detection process, the production and characterization of antibodies can explain information about desirable epitopes located in specific domains or motifs. From this information, the antibody screening can then be performed based on competition for binding to the same epitope. The approach to achieve this is to conduct competitive studies to find antibodies that competitively bind to each other, i.e. the antibodies compete for binding to the antigen. A high bandwidth process for grouping antibodies with respect to an epitope based on their cross-competition is described in WO 03/48731. Other grouping methods due to the epitope or domain level or epitope mapping involving competition of modulators or expression of antigen fragments on yeast are provided below in Examples 9 and 10.

[0171] As used herein, the term "epitope grouping" refers to methods used to group or classify antibodies based on their antigen binding and competition characteristics. Although the techniques are useful for defining and classifying modulators of the present disclosure, epitopic groups are not always directly correlated with epitopes, and such preliminary epitope binding assays can be further analyzed and confirmed in another method known in the art as described herein. However, as discussed and shown in the Examples below, the empirical association of antibody modulators to individual epitope groups provides information that may indicate the therapeutic potential of the disclosed modulators.

[0172] More specifically, it can be determined whether the selected reference antibody (or fragment thereof) binds to the same epitope or cross-competes for binding to the second test antibody (i.e., in the same epitope group) using methods known in the art. and specified in the Examples herein. In one case, the reference antibody modulator is bound to the DLL3 antigen at saturation conditions and the ability of the modulator secondary or test antibody to bind to DLL3 using standard immunochemical techniques is determined. If the test antibody can essentially bind to DLL3 at the same time as the reference anti-DLL3 antibody, then the secondary or test antibody binds to a different epitope than the primary or reference antibody. However, if the test antibody is not able to bind significantly to DLL3 at the same time, then the test antibody binds to the same epitope, overlapping the epitope or epitope at a short distance (at least sterically) with the antibody-bound epitope.

Primary. This means that the test antibody competes for antigen binding and is in the same epitope group as the reference antibody.

[0173] The term "competing" or "competing antibody" when used in the context of the disclosed modulators means competition between the antibodies as defined in the assay in which the test antibody or immunologically functional fragment to be tested prevents or inhibits the specific binding of the reference antibody to the common antigen. Typically, such an assay involves the use of a purified antigen (e.g., DLL3 or a domain or fragment thereof) bound to a solid surface or cells harboring any of the unlabeled test immunoglobulin and the labeled reference immunoglobulin. Competitive inhibition is measured by determining the amount of label bound to a solid surface or cells in the presence of a test immunoglobulin. Typically, the test immunoglobulin is present in excess and / or may bind first. Antibodies identified in the competitive test m (competing antibodies) include antibodies that bind to the same epitope as the reference antibody and antibodies that bind to a neighboring epitope close enough to the epitope bound by the reference antibody to the onset of steric hindrance. Additional details on methods for determining competitive binding are provided in the Examples herein. Typically, when the competing antibody is present in excess, it will inhibit the specific binding of the reference antibody to the common antigen by at least 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% or 75%. In some cases, the binding is inhibited by at least 80%, 85%, 90%, 95% or 97% or more.

[0174] Conversely, when the reference antibody is bound, it preferably inhibits the binding of a subsequently added test antibody (i.e., a DLL3 modulator) of at least 30%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 70% or 75%. In some instances, the binding of the test antibody is inhibited by at least 80%, 85%, 90%, 95% or 97% or more.

[0175] With reference to the present invention, as set out in Examples 9 and 10 below, the (via surface plasmon resonance or biosphere interferometry) was determined that the extracellular domain of DLL3 defines at least nine epitope groups by competitive binding termed "epitope group A". to "epitope group I". Considering the distribution provided by the modulator grouping techniques due to the epitope, it is believed that these nine epitope groups constitute the majority of epitope groups present in the extracellular region of the DLL3 protein.

[0176] In this regard, and as is known in the art and detailed in the following Examples, the desired grouping data due to the epitope or competitive binding can be obtained by direct or indirect solid radioimmunoassay (RIA), direct or indirect immunoenzymatic assay in phase constant (EIA or ELISA), sandwich competitive test, Biacore ™ 2000 system (ie surface plasmon resonance - GE Healthcare), ForteBio® analyzer (ie, biological layer interferometry - ForteBio, Inc.) or flow cytometry methodology. The term "surface plasmon resonance" as used herein refers to an optical phenomenon, which allows the analysis of specific interactions in real time by detecting changes in protein concentrations in the biosensor matrix. The term "biological layer interferometry" refers to an optical analytical technique that analyzes the interference pattern of white light reflected from two surfaces: a layer of immobilized protein on the biosensor end and an internal reference layer. Any change in the number of molecules associated with the biosensor tip changes the interference pattern, which can be measured in real time. In particularly preferred examples layer of immobilized protein on the biosensor end and internal reference layer. Any change in the number of molecules associated with the biosensor tip changes the interference pattern, which can be measured in real time. In particularly preferred examples layer of immobilized protein on the biosensor end and internal reference layer. Any change in the number of molecules associated with the biosensor tip changes the interference pattern, which can be measured in real time. In particularly preferred examples

In doing so, the analysis (either surface plasmon resonance, biological layer interferometry or flow cytometry) is carried out using a Biacore or ForteBio instrument or a flow cytometer (e.g., FACSAria II), as illustrated in the Examples below.

[0177] To further characterize the epitopes with which the DLL3 antibody modulators disclosed, mate or bind, epitope mapping at domain level was performed using a modification of the protocol described by Cochran et al. (J Immunol Methods. 287 (1-2): 147- 158 (2004)).

[0178] Briefly, individual DLL3 domains containing specific amino acid sequences were expressed on the yeast surface, and binding by each DLL3 antibody was determined by flow cytometry. The results are discussed below in Example 10 and shown in FIG. 14A and 14B. [0179] Other compatible epitope mapping techniques include alanine scanning mutants, peptide blots (Reineke (2004) Methods Mol Biol 248: 443-63) or peptide cleavage analysis. In addition, methods such as epitope excision, epitope extraction and chemical modification of antigens can be used (Tomer (2000) Protein Science 9: 487-496). In other embodiments, Modification-Assisted Profiling (MAP), also known as antigen-specific antibody profiling (ASAP) Antigen Structure-based Antibody Profiling) provides a method for classifying a large number of monoclonal antibodies (mAbs) directed against the same antigen according to the similarities in the binding profile of each antibody to chemically or enzymatically modified antigen surfaces (USPN 2004/0101920). Each category may reflect a unique epitope clearly different from or partially overlapping with an epitope represented by another category. This technology allows the rapid filtering of genetically identical antibodies, so that the characteristics can be focused on genetically distinct antibodies. It should be noted that MAP can be used for the sorting of hDLL3 antibody modulators of the invention into antibody groups binding different epitopes [0180] Agents useful for altering the structure of immobilized antigen include enzymes such as proteolytic enzymes (e.g. trypsin, Glu-C endoproteinase, Asp-N endoproteinase, chymotrypsin , etc.). Agents useful for changing the structure of the immobilized antigen may also be chemical agents, such as succinimidyl esters and their derivatives, primary amine-containing compounds, hydrazines and carbohydrazines, free amino acids and the like.

[0181] The proteinaceous antigen may be immobilized on either the surfaces of a biosensor chip or polystyrene beads. The latter can be processed using, for example, a test such as the LUMINEX ™ Multiplex Luminex detection test (Luminex Corp.). Due to the ability of LUMlNEX to support multiplex analysis of up to 100 different types of beads, LUMINEX provides almost unlimited surfaces of antigen with various modifications, which gives better resolution in the profiling of antibody epitopes against the biosensor test.

E. Binding properties of the modulator [0182] In addition to the specificity of the epitope, the disclosed antibodies can be characterized using physical properties, such as, for example, binding affinity. Accordingly, the present disclosure further comprises the use of antibodies that have a high binding affinity for one or more DLL3 isoforms or in the case of pan-antibodies of more than one member of the DLL family.

[0183] The term "KD" as used herein is intended to refer to the dissociation constant of a specific antibody-antigen interaction. An antibody of the invention immunospecifically binds its target antigen to a KD dissociation constant (koff / kon) of &lt;10^-7M. The antibody specifically binds the antigen with high affinity when the KD is &lt;5x10^-9M, and with very high affinity when KD is &lt;5x10^-10In one embodiment of the invention, the antibody has a K D of &amp; lt; 10^-9M and a dissociation rate of about 1x10^-4/knot. In one embodiment of the invention, the dissociation rate is &amp; lt; 1 x 10^-5/knot. In other embodiments of the invention, the antibodies will bind to DDL3 with a K D of between about 10^-7M and 10^-10M, and in yet another embodiment it will be associated with KD &lt;2x10^-10M. Still other selected instances of the present disclosure include antibodies that have a dissociation constant, otherwise

KD (koff / kon), of less than 10^-2M, less than 5x10^-2M, less than 10^-3M, less than 5x10^-3M, less than 10⁴M, less than 5x10^-4M, less than 10^-5M, less than 5x10^-5M, less than 10^-6M, less than 5x10^-6M, less than 10⁷M, less than 5x10^-7M, less than 10^-8M, less than 5x10^-8M, less than 10^-9M, less than 5x10^-9M, less than 10¹⁰M, less than 5x10^-10M, less than 10^-11M, less than 5x10^-11M, less than 10^-12M, less than 5x10^-12M, less than 10^-13M, less than 5x10^-13M, less than 10^-14M, less than 5x10^-14M, less than 10^-15M or less than 5x10^-15M. [0184] In specific cases, an antibody of the disclosure that immunospecifically binds to DDL3 has an association rate constant, or CAT (or ka) (DLL3 (Ab) + antigen (Ag)).^ko .- &lt;Ab-Ag) amounting to c ή ή c Ί Ί c Ί Ί G11 at least 10⁵M^-1s^-1at least 2x10⁵M^-1s^-1at least 5x10⁵M^-1s^-1at least 10⁶M^-1s^-1at least 5x10⁶M^-1s^-1at least 10⁷M^-1s^-1at least 5x10⁷M^-1s^-1or at least 10⁸M^-1s^-1.

[0185] In another instance, an antibody of the disclosure that immunospecifically binds to DDL3 has a dissociation rate constant, otherwise k_off (or k_d) (DLL3 (Ab) + antigen (Ag)^k:::: fAb-Ag) of less than

-1 -1 -1 -1 -2 -1 -2 -1 -3 -1 -3 -1

10^-1s^-1less than 5x10^-1s^-1, less than 10^-2s^-1less than 5x10^-2s^-1, less than 10^-3s^-1less than 5x10^-3s^-1, less than 10^-4s^-1less than 5x10^-4s^-1, less than 10^-5s^-1less than 5x10^-5s^-1, less than 10^-6s^-1less than 5x10^-6s^-1 less than

-7 -1 -7 -1 -8 -1 -8 -1 -9 -1 -9 -1

10^-7s^-1less than 5x10^-7s^-1, less than 10^-8s^-1less than 5x10^-8s^-1, less than 10^-9s^-1less than 5x10^-9s^-1 or less _{than 10}^-10s^-1.

[0186] In other selected embodiments of the present invention, anti-DDL3 antibodies will have an affinity constant, i.e. Ka (kon / koff) of at least 10.²M^-1at least 5x10²M^-1at least 10³M^-1at least 5x10³M^-1at least 10⁴M^-1at least 5x10⁴M^-1at least 10⁵M^-1at least 5x10⁵M^-1at least 10⁶M^-1at least 5x10⁶M^-1at least 10⁷M^-1at least 5x10⁷M^-1, What

-1 8 -1 9 -1 9 -1 10 -1 at least 10⁸M^-1at least 5x10⁸M^-1at least 10⁹M^-1at least 5x10⁹M^-1at least 10¹⁰M^-1at least 5x10¹⁰M^-1at least 10¹¹M^-1at least 5x10¹¹M^-1at least 10¹²M^-1at least 5x10¹²M^-1at least 10¹³M^-1at least 5x10¹³M^-1at least 10¹⁴M^-1at least 5x10¹⁴M^-1at least 10¹⁵ M ¹ or at least 5x10¹⁵M^-1.

[0187] In addition to the above-mentioned properties of antibody-modulators, the antibodies of the disclosure may be further characterized using additional physical properties including thermal stability (i.e., melting point, T m) and isoelectric points. (See, e.g., Bjellqvist et al., 1993, Electrophoresis 14: 1023, Vermeer et al., 2000, Biophys J. 78: 394-404, Vermeer et al., 2000, Biophys J. 79: 2150-2154).

VIII. Conjugated modulators

A. Overview

[0188] When the modulators of the disclosure have been generated and / or made and selected in accordance with the present description, they may be fused, fused with, conjugated to (e.g. covalently or non-covalently) or otherwise combined with pharmaceutically active or diagnostic moieties or biocompatible modifiers. As used herein, the term "conjugate" or "modulator conjugate" or "antibody conjugate" will be widely used and will mean any biologically active or detectable molecule or drug associated with the disclosed modulators regardless of the association method. In this context, it should be understood that such conjugates may, in addition to the disclosed modulators, include peptides, polypeptides, proteins, prodrugs, which are metabolized to the active agent in vivo, polymers, nucleic acid molecules, small molecules, binding agents, miamic agents, synthetic drugs, inorganic molecules, organic molecules and radioactive isotopes. In addition, as indicated above, the selected conjugate may be covalently or non-covalently associated with a modulator or linked to a modulator and exhibits different stoichiometric molar ratios depending, at least in part, on the method used to perform the conjugation.

[0189] Particularly preferred aspects of the present invention include antibody modulator conjugates or antibody-drug conjugates that can be used to diagnose and / or treat proliferative disorders. It should be noted that, unless otherwise stated in the context, the term "antibody-drug conjugate" or "ADC" or the formula M- [LD] n is intended to include conjugates comprising both therapeutic and diagnostic moieties. In such cases, the antibody-drug conjugate compounds will contain a DLL3 modulator (typically an anti-DLL3 antibody) as a modulator or cell binding unit (herein abbreviated CBA, M or Ab), a therapeutic agent (e.g., an anti-cancer agent) or a diagnostic moiety ( D) and optionally a linker (L) that connects the drug and the antigen binding agent.

[0190] Those skilled in the art will appreciate that various reactions are available for the attachment or association of therapeutic or diagnostic moieties and / or linkers with binding agents. In selected cases, this can be achieved by reacting amino acid residues of a binding agent, e.g. an antibody molecule, including lysine amino groups, free carboxylic acid groups of glutamic and aspartic acid, sulfhydryl groups of cysteine ​​and various aromatic amino acid moieties. One of the most commonly used nonspecific methods of covalent attachment is a carbodiimide reaction to combine the carboxyl (or amine) group with a compound with amino (or carboxyl) groups of the antibody. In addition, bifunctional agents were used to combine the amino group of the compound with the amino groups of the antibody molecule, such as dialdehydes or imido esters. Also available for binding drugs to binders is the Schiff base reaction. This method involves the oxidation with a periodate drug that contains glycol or hydroxyl groups, thereby forming an aldehyde which then reacts with the binder. The attachment occurs by forming a Schiff base with amino groups of the binder. Isothiocyanates and azlactones can also be used as conjugating agents for the covalent attachment of drugs to binders. [0191] In other cases, the disclosed modulators of the disclosure may be conjugated or bound to proteins, polypeptides or peptides that confer to them selected properties (e.g., biotoxins, biomarkers, purification tags, etc.). In certain preferred cases, this Also available for binding drugs to binders is the Schiff base reaction. This method involves the oxidation with a periodate drug that contains glycol or hydroxyl groups, thereby forming an aldehyde which then reacts with the binder. The attachment occurs by forming a Schiff base with amino groups of the binder. Isothiocyanates and azlactones can also be used as conjugating agents for the covalent attachment of drugs to binders. [0191] In other cases, the disclosed modulators of the disclosure may be conjugated or bound to proteins, polypeptides or peptides that confer to them selected properties (e.g., biotoxins, biomarkers, purification tags, etc.). In certain preferred cases, this Also available for binding drugs to binders is the Schiff base reaction. This method involves the oxidation with a periodate drug that contains glycol or hydroxyl groups, thereby forming an aldehyde which then reacts with the binder. The attachment occurs by forming a Schiff base with amino groups of the binder. Isothiocyanates and azlactones can also be used as conjugating agents for the covalent attachment of drugs to binders. [0191] In other cases, the disclosed modulators of the disclosure may be conjugated or bound to proteins, polypeptides or peptides that confer to them selected properties (e.g., biotoxins, biomarkers, purification tags, etc.). In certain preferred cases, this This method involves the oxidation with a periodate drug that contains glycol or hydroxyl groups, thereby forming an aldehyde which then reacts with the binder. The attachment occurs by forming a Schiff base with amino groups of the binder. Isothiocyanates and azlactones can also be used as conjugating agents for the covalent attachment of drugs to binders. [0191] In other cases, the disclosed modulators of the disclosure may be conjugated or bound to proteins, polypeptides or peptides that confer to them selected properties (e.g., biotoxins, biomarkers, purification tags, etc.). In certain preferred cases, this This method involves the oxidation with a periodate drug that contains glycol or hydroxyl groups, thereby forming an aldehyde which then reacts with the binder. The attachment occurs by forming a Schiff base with amino groups of the binder. Isothiocyanates and azlactones can also be used as conjugating agents for the covalent attachment of drugs to binders. [0191] In other cases, the disclosed modulators of the disclosure may be conjugated or bound to proteins, polypeptides or peptides that confer to them selected properties (e.g., biotoxins, biomarkers, purification tags, etc.). In certain preferred cases, this The attachment occurs by forming a Schiff base with amino groups of the binder. Isothiocyanates and azlactones can also be used as conjugating agents for the covalent attachment of drugs to binders. [0191] In other cases, the disclosed modulators of the disclosure may be conjugated or bound to proteins, polypeptides or peptides that confer to them selected properties (e.g., biotoxins, biomarkers, purification tags, etc.). In certain preferred cases, this The attachment occurs by forming a Schiff base with amino groups of the binder. Isothiocyanates and azlactones can also be used as conjugating agents for the covalent attachment of drugs to binders. [0191] In other cases, the disclosed modulators of the disclosure may be conjugated or bound to proteins, polypeptides or peptides that confer to them selected properties (e.g., biotoxins, biomarkers, purification tags, etc.). In certain preferred cases, this [0191] In other cases, the disclosed modulators of the disclosure may be conjugated or bound to proteins, polypeptides or peptides that confer to them selected properties (e.g., biotoxins, biomarkers, purification tags, etc.). In certain preferred cases, this [0191] In other cases, the disclosed modulators of the disclosure may be conjugated or bound to proteins, polypeptides or peptides that confer to them selected properties (e.g., biotoxins, biomarkers, purification tags, etc.). In certain preferred cases, this

The disclosure includes the use of modulators or fragments thereof recombinantly fused or chemically conjugated (including covalent and non-covalent conjugations) with a heterologous protein or peptide, wherein the protein or peptide comprises at least 10, at least 20, at least 30, at least 40, at least 50, at least 60, at least 70, at least 80, at least 90, or at least 100 amino acids. The construct may not necessarily be directly linked, but may exist through amino acid linker sequences. For example, antibodies can be used to target heterologous polypeptides to specific types of cells expressing DLL3, either in vitro or in vivo, by fusing or conjugating modulators of the present disclosure to antibodies specific for specific cell surface receptors to provide bispecific constructs. In addition, modulators fused or conjugated to heterologous polypeptides may also be used in in vitro immunoassays and may be particularly compatible with purification methodology (e.g., his tags) as is known in the art. See, e.g., International Publication No. WO 93/21232; European Patent No. 439.095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39: 91-99; U.S. Patent No. 5,474,981; Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432; and Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446-2452. In addition, modulators fused or conjugated to heterologous polypeptides may also be used in in vitro immunoassays and may be particularly compatible with purification methodology (e.g., his tags) as is known in the art. See, e.g., International Publication No. WO 93/21232; European Patent No. 439.095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39: 91-99; U.S. Patent No. 5,474,981; Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432; and Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446-2452. In addition, modulators fused or conjugated to heterologous polypeptides may also be used in in vitro immunoassays and may be particularly compatible with purification methodology (e.g., his tags) as is known in the art. See, e.g., International Publication No. WO 93/21232; European Patent No. 439.095; Naramura et al., 1994, Immunol. Lett. 39: 91-99; U.S. Patent No. 5,474,981; Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432; and Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446-2452. Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432; and Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446-2452. Gillies et al., 1992, PNAS 89: 1428-1432; and Fell et al., 1991, J. Immunol. 146: 2446-2452.

B. Linkers [0192] In addition to the peptide linkers or spacer mentioned above, it should be noted that several other variations or types of linkers may be used to combine the disclosed modulators with pharmaceutically active or diagnostic moieties or biocompatible modifiers. In some embodiments, the linker is susceptible to cleavage under intracellular conditions such that cleavage of the linker releases the drug unit from the antibody in an intracellular environment. In still other embodiments, the linker is not susceptible to cleavage and the drug is released, for example, by degradation of the antibody.

[0193] ADC linkers are preferably extracellular stable, prevent aggregation of ADC molecules, and maintain ADC freely soluble in aqueous media and in the monomeric state. The antibody-drug conjugate (ADC) is preferably stable and remains intact prior to transport or delivery to the device, i.e. the antibody remains attached to the drug moiety. The linkers are stable outside the target cell and can be cut at an effective rate within the cell. The effective linker will: (i) retain the specific binding properties of the antibody; (ii) allowing the intracellular delivery of a conjugate or drug moiety; (iii) remained stable and intact, i.e. not cut, until the conjugate is delivered or transported to the target site; and (iv) retain a cytotoxic effect, cell killing or cytostatic effect of the PBD drug moiety. ADC stability can be measured by standard analytical techniques such as mass spectroscopy, HPLC and LC / MS separation / analysis technique. The covalent attachment of the antibody and drug moiety requires that the linker has two reactive functional groups, i.e. bivalence in the reactive sense. Known are divalent linker reagents that are useful for attaching two or more functional or biologically active moieties, such as peptides, nucleic acids, drugs, toxins, antibodies, haptens and reporter groups, and describes methods and resulting conjugates (Hermanson, GT (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, pp. 234-242). ADC stability can be measured by standard analytical techniques such as mass spectroscopy, HPLC and LC / MS separation / analysis technique. The covalent attachment of the antibody and drug moiety requires that the linker has two reactive functional groups, i.e. bivalence in the reactive sense. Known are divalent linker reagents that are useful for attaching two or more functional or biologically active moieties, such as peptides, nucleic acids, drugs, toxins, antibodies, haptens and reporter groups, and describes methods and resulting conjugates (Hermanson, GT (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, pp. 234-242). ADC stability can be measured by standard analytical techniques such as mass spectroscopy, HPLC and LC / MS separation / analysis technique. The covalent attachment of the antibody and drug moiety requires that the linker has two reactive functional groups, i.e. bivalence in the reactive sense. Known are divalent linker reagents that are useful for attaching two or more functional or biologically active moieties, such as peptides, nucleic acids, drugs, toxins, antibodies, haptens and reporter groups, and describes methods and resulting conjugates (Hermanson, GT (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, pp. 234-242). that the linker has two reactive functional groups, i.e. a divalent in a reactive sense. Known are divalent linker reagents that are useful for attaching two or more functional or biologically active moieties, such as peptides, nucleic acids, drugs, toxins, antibodies, haptens and reporter groups, and describes methods and resulting conjugates (Hermanson, GT (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, pp. 234-242). that the linker has two reactive functional groups, i.e. a divalent in a reactive sense. Known are divalent linker reagents that are useful for attaching two or more functional or biologically active moieties, such as peptides, nucleic acids, drugs, toxins, antibodies, haptens and reporter groups, and describes methods and resulting conjugates (Hermanson, GT (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, pp. 234-242). GT (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, pp. 234-242). GT (1996) Bioconjugate Techniques; Academic Press: New York, pp. 234-242).

[0194] For this purpose, some embodiments of the invention include the use of a linker that is susceptible to cleavage by the cutting agent present in the intracellular environment (e.g., within the lysosome

EP 2 817 338 B1 or endosome or caveolae). The linker may be, for example, a peptidyl linker that is cleaved by the enzyme intracellular peptidase or protease, including, but not limited to, the lysosomal or endosomal protease. In some embodiments, the peptidyl linker has at least two amino acids in length or at least three amino acids in length. The cutting means may include cathepsins B and D, and plasmin known to hydrolyze the derivatives of the dipeptide drugs, causing the release of the active drug inside the target cells. Exemplary peptidyl linkers that are susceptible to cleavage by the thiol-dependent protease-cathepsin-B protease are Phe-Leu-containing peptides because it has been found that cathepsin-B is strongly expressed in cancerous tissue. Other examples of such linkers are described, for example, in USP

[0195] In a particular preferred embodiment, the peptidyl linker susceptible to cleavage by the intracellular protease is a Val-Cit linker, Ala-Val linker or Phe-Lys linker, such as described in USPN 6,214,345. One advantage of using the intracellular release of the proteolytic therapeutic agent is that the agent is usually attenuated when conjugated and the serum stability of the conjugates is usually high.

[0196] In other embodiments, the cutable linker is pH sensitive i.e. sensitive to hydrolysis at certain pH values. Typically, the pH-sensitive linkage is susceptible to hydrolysis under acidic conditions. For example, an acid-labile linker can be used that can be hydrolyzed in lysosomes (e.g., hydrazone, oxime, semicarbazone, thiosemicarbazone, cis-aconite amide, orthoester, acetal, ketal, or the like) (See, e.g., USPN 5,122,368, 5,824,805 5,622,929). Such linkers are relatively stable under conditions of neutral pH such as those in the blood, but are unstable at a pH below 5.5 or 5.0, an approximate pH of the lysosome.

[0197] In yet other embodiments, the linker is susceptible to cleavage under reducing conditions (e.g., a disulfide linker). Numerous disulphide linkers are known, including, for example, those that can be prepared using SATA (N-succinimidyl-S-acetylthioacetate), SPDP (N-succinimidyl-3- (2-pyridyl) propionate), SPDB (N-succinimidyl). -3- (2-pyridyl-nicithioate) butyrate) and SMPT (N-succinimidyl-oxycarbonyl-alpha-methyl-alpha- (2-pyridyl-dimethyl) toluene). In yet other specific embodiments, the linker is a malonate linker (Johnson et al., 1995, Anticancer Res. 15: 1387-93), maleimidobenzoyl linker (Lau et al., 1995, Bioorg-Med-Chem., 3 (10): 1299-1304), or a 3'-N-amide analogue (Lau et al., 1995, BioorgMed-Chem. 3 (10): 305-12). In still other embodiments, the connecting unit is not prone to cut, and the drug is released by the degradation of the antibody. (See US Publication No. 2005/0238649).

[0198] More specifically, in preferred embodiments (illustrated in USPNr 2011/0256157) compatible connectors will provide:

<img file="PL2817338T3_D0001.tif" />

where the asterisk indicates the point of attachment to the cytotoxic agent, CBA means the cell binding agent / modulator, L¹ means a linker, A is a linking group that connects L¹ with a cell binding agent, L² means a covalent bond or together with -OC (= O) - forms a selfimmolative linker, and L¹ or L² means a susceptible cutter.

[0199] L.¹ preferably is a cuttable coupler and can be called a trigger for activating the cutting connector.

[0200] Character L¹ and L²if present, it can vary significantly. These groups are selected based on their cleavage properties, which can be dictated by the conditions at the site to which the conjugate is delivered. Preferred are those linkers that are cleaved by the action of enzymes, although linkers that may be susceptible to cleavage by changing pH (e.g., labile in acid or base), temperature or irradiation (e.g., photolabile) may also be used. Linkers that are susceptible to cutting under reducing or oxidizing conditions may find use in the present invention.

[0201] L.¹ may be a continuous amino acid sequence. The amino acid sequence may be the target substrate for enzymatic cleavage, thereby allowing the release of R¹⁰ from position N10.

[0202] In one embodiment, L¹ it is susceptible to cleavage by the action of the enzyme. In one embodiment, the enzyme is an esterase or a peptidase.

[0203] In one embodiment, L² is present and together with -C (= O) O- forms a linker ₂ autodestruktywny. In one embodiment, L² is a substrate for enzymatic activity, thus enabling the release of R¹⁰ from position N10.

[0204] In one embodiment, wherein L¹ it is susceptible to cleavage by the action of the enzyme and L 2 is present², the enzyme cleaves the bond between L¹ and L².

L¹ and L²if present, they may be joined by a bond selected from:

-C (-O) NH-, -C (= O) O-, -NHC (= O) -, -OC (= O) -, -OC (= O) O-, -NHC (= O) O -, -OC (= O) NH-, and NHC (= O) NH-.

[0205] Amino group L¹that connects to L² it may be the N-terminus of an amino acid or may be derived from the amino group of the side chain of an amino acid, for example, a side chain of the amino acid lysine. [0206] Carboxyl group L¹that connects to L² it may be the C-terminus of an amino acid or may be derived from the carboxyl group of the side chain of an amino acid, e.g., a side chain of a glutamic acid amino acid.

[0207] Hydroxyl group L¹that connects to L² may be derived from the hydroxyl group of the side chain of an amino acid, for example, a side chain of the amino acid - serine.

[0208] The term "amino acid side chain" includes those groups in: (i) naturally occurring amino acids, such as alanine, arginine, asparagine, aspartic acid, cysteine, glutamine, glutamic acid, glycine, histidine, isoleucine, leucine, lysine , methionine, phenylalanine, proline, serine, threonine, tryptophan, tyrosine and valine; (ii) small amino acids, such as ornithine and citrulline; (iii) unnatural amino acids, beta-amino acids, synthetic analogs and derivatives of naturally occurring amino acids; and (iv) all enantiomers, diastereoisomers, isomerically enriched, radiolabelled (e.g.²H ³H ¹⁴C ¹⁵N), protected forms and their racemic mixtures.

₂ [0209] In one embodiment, -C (= O) O- and L² together they form a group:

<img file="PL2817338T3_D0002.tif" />

ο where the asterisk indicates the point of attachment to the drug or the position of the cytotoxic agent, the corrugated line indicates the point of attachment to the connector L¹, Y is -N (H) -, -O-, -C (= O) N (H) - or -C (= O) O-, and n is from 0 to 3. The phenylene ring is optionally substituted with one or two or three substituents,

EP 2 817 338 B1 as described herein. In one embodiment, the phenylene group is optionally substituted with halogen, NO2, R or OR.

[0210] In one embodiment, Y is NH.

[0211] In one embodiment, n is 0 or 1. Preferably, n is 0.

[0212] Where Y is NH, and n is 0, the self-destructive linker may be referred to as the p-aminobenzylcarbonyl linker (ABC).

[0213] The self-destructive linker will allow release of the protected compound when the remote site is activated by following the lines shown below (for n = 0):

<img file="PL2817338T3_D0003.tif" />

where L * is the activated form of the rest of the connector. These groups have the advantage of separating the activation site from the protected compound. As described above, the phenylene group may be optionally substituted.

In one embodiment described herein, the L * group is the L link¹ as described herein, which may include a dipeptide group.

[0214] In another embodiment, -C (= O) O- and L² together they form a group selected from:

<img file="PL2817338T3_D0004.tif" />

<img file="PL2817338T3_D0005.tif" />

where the asterisk, wavy line, Y and n have the meanings defined above. Each phenylene ring is optionally substituted with one, two or three substituents as described herein. In one embodiment, the phenylene ring having the Y substituent is optionally substituted, and the phenylene ring which lacks the Y substituent is unsubstituted. In one embodiment, the phenylene ring having the substituent Y is unsubstituted, and the phenylene ring having the substituent Y is optionally substituted.

₂ [0215] In another embodiment, -C (= O) O- and L² together they form a group selected from:

<img file="PL2817338T3_D0006.tif" />

Wherein the asterisk, wavy line, Y and n are as defined above, E is O, S or NR, D is N,

CH, or CR and F is N, CH, or CR.

[0216] In one embodiment, D is N.

[0217] In one embodiment, D is CH.

[0218] In one embodiment, E is O or S.

[0219] In one embodiment, F is CH.

[0220] In a preferred embodiment, the linker is a labile linkage to cathepsin.

₁ [0221] In one embodiment, L¹ is a dipeptide. The dipeptide may be depicted as -NHX1-X2-CO-, where NH- and -CO- represent the N- and C-terminus of the amino groups X1 and X2, respectively. Amino acids in the dipeptide can be any combination of natural amino acids. Where the linker is a labile linkage to cathepsin, the dipeptide may be the place of cathepsin mediated cleavage action.

[0222] In addition, for those amino acid groups having the functionality of a carboxyl or amino side chain, for example d, Glu and Lys respectively, CO and NH may represent this side chain functionality [0223] In one embodiment, the -X1-X2 group - in the dipeptide, -NH-X1-X2-CO-, is selected from:

-Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, -Val-Cit-, -Phe-Cit-, -Leu-Cit-, -Ile-Cit-, -Phe -Arg- and -Trp-Citgda Cit is citrulline.

[0224] Preferably, the group -X1-X2- in the dipeptide, -NH-X1-X2-CO-, is selected from:

-Phe-Lys-, -Val-Ala-, -Val-Lys-, -Ala-Lys-, and -Val-Cit-.

[0225] More preferably, the group -X1-X2- in the dipeptide, -NH-X1-X2-CO-, is -Phe-Lys- or -Val-Ala-. [0226] Other dipeptide combinations may be used, including those described by Dubowchik et al., Bioconjugate Chemistry, 2002, 13, 855-869.

[0227] In one embodiment, the side chain of the amino acid is derivatized, where necessary. For example, the amino group or carboxyl group of the amino acid side chain may be derivatized.

[0228] In one embodiment, the amino group NH2 of the side chain amino acid, such as lysine, is a derivatized form selected from the group consisting of NHR and NRR '.

[0229] In one embodiment, the COOH carboxyl group of a side chain amino acid, such as aspartic acid, is a derivatized form selected from the group consisting of COOR,

CONH2, CONHR and CONRR '.

[0230] In one embodiment, the side chain of the amino acid is chemically protected where necessary. The side chain protecting group may be a group as discussed below with respect to the R group^L. Protected amino acid sequences are susceptible to cleavage by enzymes. For example, it has been established that a dipeptide sequence containing a Lys residue protected with a Boc side chain is susceptible to cathepsin cleavage.

[0231] The amino acid side chain protecting groups are well known in the art and are described in the Novabiochem catalog. Additional strategies for protecting groups are shown in Protective Groups in Organic Synthesis, by Greene and Wuts.

[0232] Possible side chain protecting groups are depicted below for those amino acids having functionality of the reactive side chain:

Arg: Z, Mtr, Tos;

Asn: Trt, Xan;

Asp: Bzl, t-Bu;

Cys: Acm, Bzl, Bzl-OMe, Bzl-Me, Trt;

Glu: Bzl, t-Bu;

Gln: Trt, Xan;

His: Boc, Dnp, Tos, Trt;

Lys: Boc, Z-Cl, Fmoc, Z, Alloc;

Cheese: Bzl, TBDMS, TBDPS;

Thr: Bz;

Trp: Boc;

Tyr: Bzl, Z, Z-Br.

[0233] In one embodiment, the side chain protection is selected perpendicular to the group provided in an embodiment or as part of a capping group, if present. Thus, removal of the side chain protecting group does not remove the capping group nor any functionality of the protecting group that is part of the capping group.

[0234] In other embodiments of the invention, the selected amino acids are those that have no functionality of the reactive side chain. For example, amino acids can be selected from: Ala, Gly, Ile, Leu, Met, Phe, Pro and Val.

[0235] In one embodiment, a dipeptide is used in combination with a self-destructive linker. The self-destructive connector can be connected to -X2-.

[0236] Where the self-destructive connector is present, -X2- is connected directly to the self-destructive connector. Preferably, the group -X2-CO- is linked to Y, wherein Y is NH, thus forming a -X2-CO-NH- group.

[0237] -NH-X1- is directly linked to A. A may be -CO- functionality thereby forming an amide bond with -X1-.

[0238] In one embodiment, L¹ and L² together with -OC (= O) - include the group NH-X1-X2-CO-PABC-. The PABC group is directly linked to the cytotoxic agent. Preferably, the self-destructive linker and dipeptide together form the -NH-Phe-Lys-CO-NH-PABC- group, which is illustrated below:

<img file="PL2817338T3_D0007.tif" />

where the asterisk indicates the point of attachment to the selected cytotoxic moiety, and the wavy line indicates the point of attachment to the rest of the linker L¹ or an attachment point to A. Preferably, corrugated

The line indicates the point of attachment to A. The amino acid side chain - Lys can be protected, for example, Boc, Fmoc or Alloc, as described above.

[0239] Alternatively, the self-destructive linker and dipeptide together form the -NH-Val-Ala-CO-NH-PABC- group, which is illustrated below:

<img file="PL2817338T3_D0008.tif" />

where the asterisk and wavy line are as specified above.

[0240] Alternatively, the self-destructive linker and dipeptide together form the -NH-Val-Cit-CO-NH-PABC- group, which is illustrated below:

<img file="PL2817338T3_D0009.tif" />

where the asterisk and wavy line are as specified above.

[0241] In certain embodiments of the present invention, it may be preferred that the drug moiety contains an unprotected imine bond, e.g. if a B moiety exists, then the linker does not contain a free amino group (H2N-). Thus, if the connector has the -AL structure¹-L²- then it would preferably not contain a free amino group. This preference is particularly important when the linker contains a dipeptide on₁ example, like L¹; in this embodiment, it would be advantageous if one of the two amino acids that was chosen was not lysine.

[0242] Without wishing to be bound by theory, a combination of unprotected imine bond in the drug moiety and free amine group in the linker may result in dimerization of the drug-linker moiety, which may interfere with the conjugation of such a drug-linker moiety with the antibody. The cross-reactivity of these groups can be accelerated when the free amino group is present as an ammonium ion (H3N⁺-), such as when a strong acid (e.g., TFA) is used to deprotect the free amino group.

[0243] In one embodiment, A is a covalent bond. Thus, L¹ and a binder ₁ the cells are directly connected. For example, where L is¹ contains a contiguous amino acid sequence, the N-terminus of the sequence may bind directly to the cell-binding agent.

[0244] Thus, where A is a covalently bonded linkage between the cell-binding agent and L¹ can be selected from:

-C (= O) NH-, -C (= O) O-, -NHC (= O) -, -OC (= O) -, -OC (= O) O-, -NHC (= O) O -, -OC (= O) NH-, -NHC (= O) NH, -C (= O) NHC (= O) -, -S-, -SS-, -CH2C (= O) -, and = N-NH.

₁ [0245] Amino group L¹which binds to the DLL3 modulator may be the N-terminus of an amino acid or may be derived from an amino group of a side chain of an amino acid, e.g., an amino acid side chain

- lysine.

EP 2 817 338 B1 ₁ [0246] Carboxyl group L¹which binds to the modulator may be the C-terminus of the amino acid or may be derived from the craboxy side chain of an amino acid, e.g., a side chain of the amino acid glutamic acid.

₁ [0247] Hydroxyl group L¹which binds to the cell-binding agent may be derived from the hydroxyl group of the side chain of the amino acid, e.g. the side chain of the amino acid serine.

₁ [0248] A thiol group of L¹which binds to a modulating agent may be derived from the thiol group of the side chain of an amino acid, e.g., a side chain of the amino acid - serine.

₁ [0249] Comments above regarding the amino, carboxyl, hydroxyl and thiol groups of L¹ also apply to the cell binding agent.

[0250] In one embodiment, L² together with -OC (= O) - represents:

<img file="PL2817338T3_D0010.tif" />

where the asterisk indicates the point of attachment to the N10 position, the wavy line indicates the point of attachment to L¹, n is from 0 to 3, Y is a covalent bond or a functional group, and E is an activatable group, for example, by enzymatic action or light, thus forming a self-destructive unit.

The phenylene ring is optionally further substituted with one, two or three substituents, as described herein. In one embodiment, the phenylene group is optionally further substituted with halogen, NO2, R or OR. Preferably, n is 0 or 1, and most preferably 0.

[0251] E is chosen such that the group is susceptible to activation, e.g. by light or enzyme action. E may be -NO2 or glucuronic acid. The former may be susceptible to nitroreductase and the other to the action of β-glucuronidase.

[0252] In this embodiment, the self-destructive connector will allow release of the protected compound when E is activated by following the lines shown below (for n = 0):

<img file="PL2817338T3_D0011.tif" />

<img file="PL2817338T3_D0012.tif" />

where the asterisk indicates the point of attachment to the N10 position, E * is the activated form of E, and Y is as described above. These groups have the advantage of separating the activation site from the protected compound. As described above, the phenylene group may optionally be further substituted.

₁ [0253] The group Y may be a covalent linkage to L¹.

[0254] The group Y may be a functional group selected from:

-C (= O) -, -NH-, -O-, -C (O =) NH-, -C (= O) O-, -NHC (= O) -, -OC (= O) -, -OC (= O) O -, - NHC (= O) O-, OC (= O) NH-, -NHC (= O) NH-, -NHC (= O) NH, -C (= O) NHC (= O) -, and -S-.

[0255] Where L¹ is a dipeptide, it is preferred that Y be -NH- or -C (= O) -, thus forming an amide bond between L¹ and Y. In this embodiment, the dipeptide sequence need not be a substrate for enzymatic activity.

EP 2 817 338 B1 ₁ [0256] In another embodiment, A is a spacer. Therefore, L¹ and the cell binding agent is indirectly linked.

[0257] L.¹ and A may be joined by a bond selected from:

-C (= O) NH-, -C (= O) O-, -NHC (= O) -, -OC (= O) -, -OC (= O) O-, -NHC (= O) O -, -OC (= O) NH-, and NHC (= O) NH-.

[0258] Preferably, the linker comprises an electrophilic functional group for reaction with a nucleophilic functional group on the modulator. The nucleophilic groups on the antibodies include, but are not limited to: (i) N-terminal amino groups, (ii) side chain amino groups, e.g. lysine, (iii) side chain thiol groups, e.g. cysteine ​​and (iv) hydroxyl or amino groups sugars where the antibody is glycosylated. Amino, thiol and hydroxyl groups are nucleophilic and capable of reacting to form covalent bonds with electrophilic groups on linker moieties and linker reagents, including: (i) maleimide groups (ii) activated disulfides, (iii) active esters, such as NHS esters. (N-hydroxysuccinimide), HOBt (N-hydroxybenzotriazole) esters, haloformates and acid halides; (iv) alkyl and benzyl halides, such as haloacetamides; and (v) aldehydes, ketones, carboxyls, and some of which are depicted as follows:

<img file="PL2817338T3_D0013.tif" />

<img file="PL2817338T3_D0014.tif" />

[0259] Some antibodies have reducible intrachain disulfides, i.e. cysteine ​​bridges. Antibodies may be reactive for conjugation with linker reagents by treatment with a reducing agent such as DTT (dithiothreitol). Each cysteine ​​bridge will therefore form theoretically two reactive tulle nucleophiles. Additional nucleophilic groups can be introduced into antibodies by reacting lysines with 2-iminothiolane (Traut's reagent), which leads to the conversion of the amine to thiol. Reactive thiol groups can be introduced into the antibody (or a fragment thereof) by introducing one, two, three, four or more cysteine ​​residues (e.g., generating mutant antibodies containing one or more non-native cysteine ​​amino acid residues).

[0260] In some embodiments, the linker has a reactive nucleophilic group that is reactive with the electrophilic group present on the antibody. Suitable electrophilic groups on the antibody include, but are not limited to, the carbonyl groups of the aldehyde and the ketone. The heteroatom of the nucleophilic linker group may react with the electrophilic group on the antibody and form a covalent bond with the antibody unit. Suitable nucleophilic groups on the linker include, but are not limited to, hydrazide, oxime, amino, hydroxyl, hydrazine, thiosemicarbazone, hydrazine carboxylate and arylhydrazide. The electrophilic group on the antibody provides a convenient place of attachment to the connector.

[0261] In one embodiment, group A is:

EP 2 817 338 B1

<img file="PL2817338T3_D0015.tif" />

where the asterisk indicates the point of attachment to L¹the wavy line indicates the point of attachment to the binder of the cell, and n is from 0 to 6. In one embodiment, n is 5.

[0262] In one embodiment, group A is:

<img file="PL2817338T3_D0016.tif" />

<img file="PL2817338T3_D0017.tif" />

ο where the asterisk indicates the point of attachment to L¹the wavy line indicates the point of attachment to the binder of the cell, and n is from 0 to 6. In one embodiment, n is 5.

[0263] In one embodiment, group A is:

<img file="PL2817338T3_D0018.tif" />

where the asterisk indicates the point of attachment to L¹the wavy line indicates the point of attachment to the binder of the cell, n is 0 or 1, and m is from 0 to 30. In the preferred embodiment n is 1, and m is 0 to 10, 1 to 8, preferably 4 to 8, and most preferably 4 or 8. In another embodiment, m is from 10 to 30, preferably from 20 to 30. Alternatively, m is from 0 to 50. In this embodiment, m is preferably 10-40, and n is 1.

[0264] W jednym przykładzie wykonania grupa A oznacza:

<img file="PL2817338T3_D0019.tif" />

where the asterisk indicates the point of attachment to L¹the wavy line indicates the point of attachment to the binder of the cell, n is 0 or 1, and m is from 0 to 30. In the preferred embodiment n is 1, m is 0 to 10, 1 to 8, preferably 4 to 8, and most preferably 4 or 8. In another embodiment, m is from 10 to 30, preferably from 20 to 30. Alternatively, m is from 0 to 50. In this embodiment, m is preferably 10-40, and n is 1.

[0265] In one embodiment, the linkage between the cell-binding agent and A occurs through the tulle residue of the cell-binding agent and the maleimide-A group.

[0266] In one embodiment, the combination between the cell binding agent and A is:

<img file="PL2817338T3_D0020.tif" />

Where the asterisk indicates the point of attachment to the remainder of A, and the corrugated line indicates the point of attachment to the remainder of the binding agent of the cell. In this embodiment, the S atom is typically derived from a modulator.

[0267] In each of the above embodiments, the alternative functionality may be used in place of the maleimide derived group shown below:

'0 where the wavy line indicates the point of attachment to the binder of the cell as before and the asterisk indicates the bond to the remainder of the group A.

[0268] In one embodiment, the maleimide derived group is replaced with a group:

<img file="PL2817338T3_D0021.tif" />

where the wavy line indicates the point of attachment to the binder of the cell and the asterisk indicates the binding to the remainder of the group A.

[0269] In one embodiment, the maleimide-derived group is replaced with a group which, optionally together with the cell-binding agent, is selected from:

-C (= O) NH-, -C (= O) O-, -NHC (= O) -, -OC (= O) -, -OC (= O) O-, -NHC (= O) O -, -OC (= O) NH-, -NHC (= O) NH, -NHC (= O) NH, -C (= O) NHC (= O) -, -S-, -SS-, -CH2C (= O) -, -C (= O) CH2-, = N-NH- and -NH-N =.

[0270] In one embodiment, the maleimide-derived group is replaced with a group which, optionally together with the cell-binding agent, is selected from:

<img file="PL2817338T3_D0022.tif" />

where the wavy line indicates either the point of attachment to the binding agent of the cell or binding to the remainder of group A, and the asterisk indicates a different attachment point to the binding agent of the cell or binding to the remainder of the group A.

₁ [0271] Other groups suitable for combination of L¹ with the selected modulator is described in WO 2005/082023. [0272] In another preferred case, the modulators of the present disclosure may be associated with biocompatible polymers containing drug linker units. In this regard, one such type of compatible polymer includes Fleximer® polymers (Mersana Therapeutics). These polymers are biodegradable, well tolerated and have been subjected to clinical validation. In addition, such polymers are compatible with many configurable linker and chemical technologies that allow control of pharmacokinetics, drug release location, and improved biodistribution.

[0273] Selected modulators may also be directly conjugated radioisotopes or may be macrocyclic chelators useful for conjugating radioactive metal ions (e.g.

EP 2 817 338 B1 are described herein). In certain embodiments, the macrocyclic chelator is 1,4,7,10-tetraazacyclododecane-N, N ', N ", N" -tetraocetic acid (DOTA) that can be attached to the antibody via a linker molecule. Such linker molecules are commonly known in the art and described in Denardo et al., 1998, Cancer Cancer Res. 4: 2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug. Chem.

10: 553; and Zimmerman et al., 1999, Nucl. Med. Biol. 26: 943.

[0274] More generally, techniques for conjugating therapeutic moieties or cytotoxic agents to modulators are well known. As discussed above, the moieties can be conjugated to modulators by any method known in the art including but not limited to aldehyde / Schiff base bond, sulfhydryl bond, acid labile bond, cis-aconityl bond, hydrazone bond, enzymatically degradable linkage (see generally Garnett, 2002 , Adv Drug Deliv Rev. 53: 171). See also, for example, Amon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy," in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al., (Eds.), Pp. 243-56 (Alan R. Liss. , Inc., 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (second edition), Robinson et al., (Eds.), Pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc., 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., (Eds.), Pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (Eds.), Pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119. In preferred embodiments, the DLL3 modulator, which is conjugated to a therapeutic moiety or cytotoxic agent, may be internalized by the daughter after binding to the DLL3 molecule bound to the cell surface, thus providing a therapeutic load. Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (Eds.), Pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (Eds.), Pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119. In preferred embodiments, the DLL3 modulator, which is conjugated to a therapeutic moiety or cytotoxic agent, may be internalized by the daughter after binding to the DLL3 molecule bound to the cell surface, thus providing a therapeutic load. Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (Eds.), Pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (Eds.), Pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119. In preferred embodiments, the DLL3 modulator, which is conjugated to a therapeutic moiety or cytotoxic agent, may be internalized by the daughter after binding to the DLL3 molecule bound to the cell surface, thus providing a therapeutic load. in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (ed.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119. In preferred embodiments, the DLL3 modulator, which is conjugated to a therapeutic moiety or cytotoxic agent, may be internalized by the daughter after binding to the DLL3 molecule bound to the cell surface, thus providing a therapeutic load. in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al., (ed.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62: 119. In preferred embodiments, the DLL3 modulator, which is conjugated to a therapeutic moiety or cytotoxic agent, may be internalized by the daughter after binding to the DLL3 molecule bound to the cell surface, thus providing a therapeutic load.

C. Biocompatible Modifiers [0275] In certain cases, the modulators of the disclosure may be conjugated or otherwise associated with biocompatible modifiers that may be used to adapt, change, improve or moderate the modulator properties as desired. For example, antibodies or fusion constructs with increased half-lives in vivo can be produced by the attachment of relatively high molecular weight polymer molecules, such as commercially available polyethylene glycol (PEG) or similar biocompatible polymers. Those skilled in the art will appreciate that PEG can be obtained in a wide variety of molecular weights and molecular configurations that can be selected to confer specific properties on antibodies (e.g., half-life can be adjusted). PEG can be attached to modulators or antibody fragments or derivatives with or without a multifunctional linker or via site-specific conjugation of PEG to the N- or C-terminus of these antibodies or antibody fragments or via epsilon-amino groups present on the lysine residues. Derivatization of a linear or branched polymer can be used, which leads to minimal loss of biological activity. The degree of conjugation can be closely monitored by SDS-PAGE and mass spectrometry to ensure optimal coupling of PEG molecules to antibody molecules. The unreacted PEG can be separated from the PEG-antibody conjugates, e.g. by size exclusion or ion-exchange chromatography. In a similar manner, the disclosed modulators can be conjugated to albumin to make that the antibody or antibody fragment will be more stable in vivo or will have a longer half-life in vivo. Techniques are well known in the art, see e.g. International Publication Nos. WO 93/15199, WO 93/15200 and WO 01/77137; and

European Patent No. 0 413, 222. Other biocompatible conjugates are obvious to those skilled in the art and can be easily identified as described herein.

D. Diagnostic and Detection means [0276] In other preferred cases, the modulators of the present disclosure or fragments or derivatives thereof are coupled with a diagnostic or detectable agent, marker or reporter, which may be, for example, a biological molecule (e.g., a peptide). or nucleotide), a small molecule, a fluorophore or a radioisotope. Labeled modulators may be useful for monitoring the development or progression of a hyperproliferative disorder or as part of a clinical testing procedure to determine the efficacy of a particular therapy, including disclosed modulators (i.e., theragnostic agents) or to determine the future course of treatment. Such markers or reporters may also be useful in purifying the selected modulator, analyzing the modulator (e.g.

[0277] Such diagnostic analysis and / or detection may be achieved by coupling the modulator with detectable substances, including but not limited to various enzymes including, for example, horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, beta-galactosidase or acetylcholinesterase; prosthetic groups, such as, but not limited to, streptavidinobiotin and avidin / biotin; fluorescent materials, such as, but not limited to, umbelliferone, fluorescein, fluorescein isothiocyanate, rhodamine, dichlorotriazinylamine fluorescein, dansyl chloride or phycoerythrin; luminescent materials, such as, but not limited to, luminol; bioluminescent materials, such as, but not limited to, luciferase, luciferin and aequorin; radioactive materials, such as, but not limited to, iodine (¹³¹AND, ¹²⁵AND, ¹²³AND, ¹²¹I,), carbon (¹⁴C), sulfur (¹⁵S), tritium (³H), ind (¹¹⁵in, ¹¹³in, ¹¹²in, ¹¹¹In) and technet (⁹⁹(Tc), thal (²⁰¹Ti), gal (⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga), palladium (¹⁰³Pd), molybdenum (⁹⁹Mo), xenon (¹³³Xe), fluorine (¹⁸F) ¹⁵³sm, ¹⁷⁷Lu, ¹⁵⁹Gd, ¹⁴⁹pm, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁵Yb, ¹⁶⁶Ho, ⁹⁰Y ⁴⁷sc, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁴²Pr, ¹⁰⁵rh ⁹⁷ru, ⁶⁸Ge, ⁵⁷What, ⁶⁵Zn, ⁸⁵sr ³²P ¹⁵³Gd, ¹⁶⁹Yb, ⁵¹Cr, ⁵⁴Mn, ⁷⁵Se, ¹¹³Sn, i ¹¹⁷Tin; positron emitting metals using various positron emission tomography, non-radioactive paramagnetic metal ions and molecules that are radiolabeled or conjugated with specific radioactive isotopes. In such cases, an appropriate detection methodology is well known in the art and readily available from a number of commercial sources.

[0278] As indicated above, in other instances, modulators or fragments thereof may be fused or conjugated to marker sequences or compounds, such as a peptide or fluorophore to facilitate purification or diagnostic or analytical procedures, such as immunohistochemistry, biological layer interferometry, resonance. surface plasmons, flow cytometry, competitive ELISA, FAC, etc. In preferred embodiments, the tag is a his tag, such as that provided by the pQE vector (Qiagen), among others many of them are commercially available. Other peptide markers suitable for purification include, but are not limited to, the "HA" hemagglutinin tag that corresponds to the epitope derived from the influenza hemagglutinin protein (Wilson et al., 1984, Cell 37: 767) and the "flag" flag (US Pat.

B. Therapeutic moieties [0279] As previously referred to modulators or fragments or derivatives thereof, they may also be conjugated, fused or fused to or otherwise associated with a "therapeutic moiety" or "drug" such as an anti-proliferative or anti-cancer agent, including but not

Only cytotoxic agents, cytostatic agents, anti-angiogenic agents, and relief measures are used.

debulking agents), chemotherapeutic agents, radiotherapy and radiotherapeutic agents, targeted anti-cancer agents, BRM, therapeutic antibodies, cancer vaccines, cytokines, hormonal therapies, irradiation and anti-metastatic agents, and immunotherapeutic agents.

Preferred examples of anti-cancer drugs include cytochalasin B, grammyamidin D, ethidium bromide, emetine, mitomycin, etoposide, tenoposide, vincristine, vinblastine, colchicine, doxorubicin, daunorubicin, dihydroxyanthracin, maytansinoids such as DM-1 and DM-4 (Immunogen, Inc.), dion, mitoxantrone, mytramycin, actinomycin D, 1-dehydrotestosterone, glucocorticoids, procaine, tetracaine, lidocaine, propranolol, puromycin, epirubicin and cyclophosphamide, and their analogs or homologs. Additional compatible cytotoxins include dolastatin and auristatin, including monomethylauristatin E (MMAE) and monomethylauristatin F (MMAF) (Seattle Genetics, Inc.), amanitines, such as alpha-amanitine, betaamanityna, gamma-amanitin or epsilon-amanitine (Heidelberg Pharma AG ), small DNA groove binding agents such as duocarmycin derivatives (Syntarga, BV) and modified pyrrolobenzodiazepine dimers (Spirogen, Ltd.), assembly inhibitors such as meajamycin analogs or derivatives (e.g., FR901464 as shown in USPN 7 825 267), tabular binding agents such as epothilone analogs and paclitaxel, and DNA damaging agents , such as calicheamycin and esperamicin. Furthermore, in some cases the DLL3 modulators of the present disclosure may be associated with anti-CD3 binding molecules to recruit cytotoxic T cells and direct them to tumor-initiating cells (BiTE technology, see e.g. Fuhrmann, S. et al., Annual Meeting of AACR abstract No. 5625 (2010)). such as epothilone analogs and paclitaxel, and DNA damaging agents such as calicheamycin and esperamicin. Furthermore, in some cases the DLL3 modulators of the present disclosure may be associated with anti-CD3 binding molecules to recruit cytotoxic T cells and direct them to tumor-initiating cells (BiTE technology, see e.g. Fuhrmann, S. et al., Annual Meeting of AACR abstract No. 5625 (2010)). such as epothilone analogs and paclitaxel, and DNA damaging agents such as calicheamycin and esperamicin. Furthermore, in some cases the DLL3 modulators of the present disclosure may be associated with anti-CD3 binding molecules to recruit cytotoxic T cells and direct them to tumor-initiating cells (BiTE technology, see e.g. Fuhrmann, S. et al., Annual Meeting of AACR abstract No. 5625 (2010)).

[0281] Still additional co-cancer anticancer drugs include, but are not limited to, antimetabolites (e.g., methotrexate, 6-mercaptopurine, 6-thioguanine, cytarabine, 5-fluorouracearodecarbazine), alkylating agents (e.g., mechlorotamine, thioepa, chlorambucil, melphalan, carmustine) (BCNU) and lomustine (CCNU), busulfan, dibromomannitol, streptozotocin and cisdichlorodiaminoplatinum II (DDP), cisplatin), anthracyclines (e.g. daunorubicin (formerly daunomycin) and doxorubicin), antibiotics (e.g., dactinomycin (formerly actinomycin), bleomycin and antramycin) (AMC)) and anti-mitotic agents (e.g., vincristine and vinblastine). A more extensive list of therapeutic moieties can be found in PCT publication WO 03/075957 and USPN 2009/0155255.

[0282] As indicated above, selected embodiments of the present invention pertain to conjugated DLL3 modulators, such as anti-DLL3 drug-drug conjugates, which contain a pyrolobenzodiazepine cytotoxic agent (PBD). It should be noted that PBDs are alkylating agents that exert antitumor activity by covalently binding to DNA in a small groove and inhibiting nucleic acid synthesis. In this respect, it has been shown that PBDs have strong anti-tumor properties while showing minimal bone marrow depression. PBDs compatible with the present invention may be linked to a DLL3 modulator using one of several types of linkers (e.g., a maleimide peptide linker with free sulfhydryl), and in certain embodiments are in a dimeric form (i.e., PBD dimers). Co-efficient PBDs (and optional linkers) that can be conjugated to the disclosed modulators are described, for example, in USPN 6,362,331, 7,049,311, 7,189,710, 7,429,658, 7,407,951, 7,741,319, 7,557.099, 8,034,808, 8,133,736 of USPN 2011/0256157 and PCT publication WO2011. / 130613, WO2011 / 128650 and WO2011 / s130616. Accordingly, in particularly preferred embodiments, the modulator will be an anti-DLL3 antibody conjugated to or bound to one or more PBD dimers (i.e., DLL3-PBD ADC).

[0283] In particularly preferred embodiments, compatible PBDs that can be conjugated with the disclosed modulators are described in USPN 2011/0256157. In the present disclosure, PBD dimers may be preferred, i.e. those that contain two PBD moieties. Thus, preferred conjugates of the present invention are those of formulas (AB) or (AC):

<img file="PL2817338T3_D0023.tif" />

<img file="PL2817338T3_D0024.tif" />

in which:

the dashed lines indicate the optional presence of a double bond between C1 and C2 or C2 and C3;

R² is independently selected from H, OH, = O, = CH 2, CN, R, OR, = CH-R^D, = C (R.^D2, O-SO2-R, CO2R and COR, and optionally further selected from halogen or dihalo; when R^D is independently selected from R, CO2R, COR, CHO, CO2H, and halogen;

R⁶ and R⁹ are independently selected from H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR ', NO2, Me3Sn and halogen;

R⁷ is independently selected from H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR ', NO2, Me3Sn and halogen;

R¹⁰ means a link connected to a modulator or a fragment or derivative thereof as described above;

Q is independently selected from O, S and NH;

R¹¹ is either H, or R or, wherein Q is O, SO3M, wherein M is a metal cation;

R and R 'are each independently selected from optionally substituted C1-12 alkyl, C320 heterocyclyl and C5-20 aryl groups, and optionally in combination with the NRR' group, R and R 'together with the nitrogen atom to which they are attached forms optionally a substituted 4-, 5-, 6- or 7-membered heterocyclic ring; and where R^{2 '}, R^{6 "}, R^{7 "}, R^{9 "}, X ", Q" and R^{11 "} are as defined in accordance with R², R⁶, R⁷, R⁹, X, Q 11 C and R¹¹and R^C is a capping group.

Double bond [0284] In one embodiment, there is no double bond present between C1 and C2, and C2 and C3.

[0285] In one embodiment, the dashed lines indicate the optional presence of a double bond between C2 and C3, as shown below:

EP 2 817 338 B1

<img file="PL2817338T3_D0025.tif" />

₂ [0286] In one embodiment, a double bond is present between C2 and C3 when R² is C5-20 aryl or C1-12 alkyl.

[0287] In one embodiment, the dashed lines indicate the optional presence of a double bond between C1 and C2, as shown below:

S "

^r \ lt d

[0288] In one embodiment, the double bond is present between C1 and C2 when R² is C5-20 aryl or C1-12 alkyl.

_R2 ₂ [0289] In one embodiment of R² is independently selected from H, OH, = O, = CH 2, CN, R, OR, = CH-R^D, = C (R.^D) 2, O-SO2-R, CO2R and COR, and optionally further selected from halogen or dihalo. [0290] In one embodiment of R² is independently selected from H, OH, = O, = CH 2, CN, R, OR, = CH-R^D, = C (R.^D) 2, O-SO2-R, CO2R and COR.

[0291] In one embodiment of R² is independently selected from H, = O, = CH2, R, = CH-R^D, i = C (R.^D) 2.

₂ [0292] In one embodiment of R² independently means H.

₂ [0293] In one embodiment of R² is independently = O.

₂ [0294] In one embodiment of R² is independently = CH2.

2D [0295] In one embodiment of R² is independently = CH-R^D. In relation PBD group = CHR^D may have one of the configurations shown below:

<img file="PL2817338T3_D0026.tif" />

[0296] [0297] [0298] [0299] [0300] [0301] [0302] [0303] [0304] [0305] [0306] (0M

In one embodiment, the configuration is configuration (I).

2D

In one embodiment R² is independently = C (R.^D) 2.

₂

In one embodiment R² is independently = CF2.

₂

In one embodiment R² independently is R.

In one embodiment R² is independently optionally substituted C5-20 aryl.

In one embodiment R² is independently optionally substituted C 1-12 alkyl.

In one embodiment R² is independently optionally substituted C5-20 aryl.

In one embodiment R² is independently optionally substituted C 5-7 aryl.

In one embodiment R² is independently optionally substituted C8-10 aryl. ₂

In one embodiment R² is independently optionally substituted phenyl.

₂

In one embodiment R² is independently optionally substituted naphthyl.

[0307] In one embodiment of R² is independently optionally substituted pyridyl.

[0308] In one embodiment of R² is independently optionally substituted quinolinyl or isoquinolinyl.

[0309] In one embodiment of R² carries one to three substituted groups, with 1 and 2 being more preferred, and individually substituted groups being the most preferred. The substituents can be in any position.

[0310] When R² is a C 5-7 aryl group, the single substituent preferably located on a ring atom that is not adjacent to the remainder of the compound, i.e. it is preferably β or γ to bind to the remainder of the compound. Thus, when the C 5-7 aryl group is phenyl, the substituent is preferably in the meta or para position, more preferably in the para position.

[0311] In one embodiment of R² is chosen from among:

<img file="PL2817338T3_D0027.tif" />

where the asterisk points to the connection point.

[0312] When R² is C8-10 aryl, e.g. quinolinyl or isoquinolinyl, may carry any number of substituents at any position of the quinolinyl or isoquinolinyl ring. In some embodiments, it carries one, two or three substituents and they can be on either the proximal or distal ring or both (if there is more than one substituent).

[0313] In one embodiment, wherein R² is optionally substituted, the substituents are selected from those substituents given in the "substituents" section below.

[0314] When R is optionally substituted, the substituents are preferably selected from:

halogen, hydroxyl, ether, formyl, acyl, carboxyl, ester, acyloxy, amino, amido, acylamido, aminocarbonyloxy, ureido, nitro, cyano and thioether.

₂ [0315] In one embodiment, wherein R or R² is optionally substituted, the substituents are selected from the group consisting of R, OR, SR, NRR ', NO2, halogen, CO2R, COR, CONH2, CONHR, and CONRR'.

[0316] When R² is C1-12 alkyl, the optional substituent may further include C3-20 heterocyclyl and C5-20 aryl groups.

[0317] When R² is C3-20 heterocyclyl, the optional substituent may further include C1-12 alkyl and C5-20 aryl.

[0318] When R² means C5-20 aryl groups, the optional substituent may additionally include a C320 heterocyclyl group and a C1-12 alkyl group.

[0319] It is understood that the term "alkyl" includes both alkenyl and alkynyl as well as cycloalkyl subclasses. So, when R² is optionally substituted C 1-12 alkyl, it is understood that the alkyl group optionally has one or more carbon-carbon double or triple bonds that can form part of the conjugated system. In one embodiment, the optionally substituted C1-12 alkyl group contains at least one carbon or carbon double or triple bond and the bond is conjugated to the double bond present between C1 and C2 or C2 and C3. In one embodiment, the C1-12 alkyl group is a group selected from saturated C1-12 alkyl, C2-12 alkenyl, C2-12 alkynyl and C3-12 cycloalkyl. [0320] If a substituent on R² is halogen, it is preferably F or Cl, more preferably Cl.

EP 2 817 338 B1 ₂ [0321] When a substituent on R² the ether is, in some embodiments it may be an alkoxy group, e.g. a C1-7 alkoxy group (e.g., methoxy, ethoxy) or may be in some embodiments a C5-7 aryloxy (e.g., phenoxy, pyridyloxy, furanyloxy).

₂ [0322] When a substituent on R² is C1-7 alkyl, it may preferably be a C1-4 alkyl group (e.g., methyl, ethyl, propyl, butyl).

₂ [0323] When a substituent on R² is C 3-7 heterocyclyl, it may be in some embodiments a C 6 containing heterocyclyl group, e.g., morpholino, thiomorpholino, piperidinyl, piperazinyl. These groups may be associated with the PBD moiety via a nitrogen atom. These groups may be further substituted, for example, by C1-4 alkyl groups.

[0324] When a substituent on R² is bis-oxy-C 1-3 alkylene, it is preferably bis-oxy-methylene or bis-oxyethylene.

₂ [0325] Particularly preferred substituents for R² include methoxy, ethoxy, fluoro, chloro, cyano, bis-oxy-methylene, methylpiperazinyl, morpholino and methylthienyl substituents.

₂ [0326] Particularly preferred substituted R groups² include, but not limited to, 4-methoxyphenyl, 3-methoxyphenyl, 4-ethoxyphenyl, 3-ethoxyphenyl, 4-fluorophenyl, 4-chlorophenyl, 3,4-bis-oxymethylene, 4-methoxyphenyl, 4-methylthienyl, 4-cyanophenyl, 4-phenoxyphenyl, quinoline 3-yl and quinolin-6-yl, isoquinolin-3-yl and isoquinolin-6-yl, 2-thienyl, 2-furanyl, methoxynaphthyl and naphthyl.

₂ [0327] In one embodiment of R² means hydrogen or dihydrogen. In one example₂ implementation of R² is -F or -F2, which substituents are illustrated below as (III) and (IV) respectively:

Γ \ &lt;^Η^Ζ'\ -4} Uf α ο ί^; fili) (! V) [0328] In one embodiment of R^D is independently selected from R, CO2R, COR, CHO, CO2H, and a halide.

[0329] In one embodiment of R^D is independently R.

[0330] In one embodiment of R^D is independently a halogen atom.

r6 [0331] In one embodiment of R⁶ is independently selected from H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR ', NO2, Me3Sn- and hydrogen.

[0332] In one embodiment of R⁶ is independently selected from H, OH, OR, SH, NH2, NO2 and hydrogen.

[0333] In one embodiment of R⁶ is independently selected from H and hydrogen.

[0334] In one embodiment of R⁶ is independently H.

[0335] In one embodiment of R⁶ and R⁷ together form a -O- (CH2) pO- group in which p is 1 or 2.

r7 [0336] R⁷ is independently selected from H, R, OH, OR, SH, SR, NH2, NHR, NRR ', NO2, Me3Sn and hydrogen.

[0337] In one embodiment of R⁷ means independently OR.

[0338] In one embodiment of R⁷ means independently OR^7Awhere R^7A is independently optionally substituted C 1-6 alkyl.

[0339] In one embodiment of R^7A is independently optionally substituted saturated C16 alkyl.

[0340] In one embodiment of R^7A is independently optionally substituted C2-4 alkenyl. [0341] In one embodiment of R^7A is independently Me.

[0342] In one embodiment of R^7A means CH2Ph ​​independently.

[0343] In one embodiment of R^7A means independently altyl.

[0344] In one embodiment, the compound is a dimer in which the R groups⁷ each monomer together forms a bridge with a dimer having the formula XR &amp; quot; -X connecting monomers.

[0345] In one embodiment, the compound is a dimer in which the R groups⁸ each monomer together forms a bridge with a dimer having the formula XR &amp; quot; -X connecting monomers.

8A 8A [0346] In one embodiment of R⁸ means independently OR^8Awhere R^8A is independently optionally substituted C 1-4 alkyl.

[0347] In one embodiment of R^8A is independently an optionally substituted C 16 alkyl or an optionally substituted C 2-4 alkenyl.

[0348] In one embodiment of R^8A is independently Me.

[0349] In one embodiment of R^8A means CH2Ph ​​independently.

[0350] In one embodiment of R^8A means allyl independently.

[0351] In one embodiment of R⁸ and R⁷ together form a -O- (CH2) pO- group, where p is 1 or 2.

[0352] In one embodiment of R⁸ and R⁹ together form a -O- (CH2) pO- group, where p is 1 or 2.

[0353] In one embodiment of R⁹ is independently selected from H, R, OH, OR, SH, SR, NH2,

NHR, NRR ', NO2, Me3Sn- and hydrogen.

[0354] In one embodiment of R⁹ is independently H.

[0355] In one embodiment of R⁹ is independently R or OR.

R and R '[0356] In one embodiment, R is independently selected from optionally substituted C1-12 alkyl, C3-20 heterocyclyl and C5-20 aryl. Each of these groups is defined in the "substituents" section below.

[0357] In one embodiment, R is independently optionally substituted C1-12 alkyl.

[0358] In one embodiment, R is independently optionally substituted C3-20 heterocyclyl.

[0359] In one embodiment, R is independently optionally substituted C5-20 aryl.

[0360] In one embodiment, R is independently optionally substituted C1-12 alkyl.

[0361] Described above in relation to R² there are various embodiments regarding preferred alkyl and aryl groups and the identity and number of optional substituents. Preferences presented for R² as applicable for R, apply, where applicable, to all other R groups, for example where R⁶, R⁷, R⁸ or R⁹ means R.

[0362] The preferences for R also apply to R '.

[0363] In some embodiments of the invention, there is provided a compound having a -NRR 'substituent group. In one embodiment, R and R 'together with the nitrogen atom to which they are attached form an optionally substituted 4-, 5-, 6- or 7-membered heterocyclic ring. The ring may contain an additional heteroatom, for example, N, O or S.

[0364] In one embodiment, the heterocyclic ring itself is substituted with R. When an additional N-heteroatom is present, the substituent may be on the heteroatom N.

R "

[0365] R "is a C3-12 alkylene group, the chain of which may be disrupted by one or more heteroatoms, e.g. O, S, N (H), NMe and / or aromatic rings, e.g. benzene or pyridine, which rings are optionally substituted.

[0366] In one embodiment, R "is a C3-12 alkylene group, the chain of which may be interrupted by one or more heteroatoms and / or aromatic rings, e.g. benzene or pyridine.

[0367] In one embodiment, the alkylene group is optionally interrupted by one or more heteroatoms selected from O, S, and NMe and / or orthoromatic rings, which rings are optionally substituted.

[0368] In one embodiment, the aromatic ring is a C5-20 arylene group, where arylene refers to a divalent group obtained by removing two hydrogen atoms from two aromatic ring atoms of an aromatic compound, which moiety has 5 to 20 ring atoms.

[0369] In one embodiment, R "is a C3-12 alkylene group, the chain of which may be interrupted by one or more heteroatoms, e.g. O, S, N (H), NMe NMe and / or rings, such as benzene or pyridine, which rings are optionally substituted with NH2.

[0370] In one embodiment, R "is a C3-12 alkylene group.

[0371] In one embodiment, R "is selected from the group of C3, C5, C7, C9 and C11.

[0372] In one embodiment, R "is selected from a C3, C5 and C7 alkylene group.

[0373] In one embodiment, R "is selected from a C3 and C5 alkylene group.

[0374] In one embodiment, R "is a C3 alkylene group.

[0375] In one embodiment, R "is a C5 alkylene group.

[0376] The alkylene groups mentioned above may optionally be interrupted by one or more heteroatoms and / or aromatic rings, e.g. benzene or pyridine, which rings are optionally substituted.

[0377] The alkylene groups mentioned above may be optionally interrupted by one or more heteroatoms and / or aromatic rings, e.g. benzene or pyridine rings.

[0378] The alkylene groups mentioned above may be unsubstituted linear, aliphatic alkylene groups.

X [0379] In one embodiment, X is selected from O, S, or N (H).

[0380] Preferably, X is O.

R¹⁰

[0381] Preferably, compatible connectors such as those described above attach the DLL3 modulator (CBA / Ab / M) to the drug PBD D via covalent linkage (s) at the R position.¹⁰ (i.e., N10). The linker is a bifunctional or multifunctional moiety that can be used to combine one or more drug moieties (D) and a modulator (preferably an antibody) to make antibody-drug conjugates (ADCs). The linker (L) may be stable outside the cell, i.e. extracellular, or may be susceptible to cleavage by enzymatic activity, hydrolysis or other metabolic conditions. Antibody drug conjugates (ADCs) can be conveniently prepared using a linker having reactive functionality for binding to a drug moiety and antibody. A cysteine, thiol or amine, e.g. an N-terminal or amino acid side chain, such as lysine, antibodies (Ab) may form a functional linking linker or spacer reactant, a drug PBD (D) moiety or a drug-linker reagent (DL). [0382] Multiple functional groups on the linker attached to the N10 position of the PBD moiety can be useful to react with the cell-binding agent. For example, ester, thioester, amide, thioamide, carbamate, thiocarbamate, urea, thiourea, ether, thioether or disulfide linkages can be formed from the reaction of PBD intermediates and cell-binding agent.

[0383] In another embodiment, the linker may be substituted with groups that modulate aggregation, solubility or reactivity. For example, the sulfonate substituent can increase the water solubility of the reagent and facilitate the coupling reaction of the linker reagent with the antibody or drug moiety, or facilitate the Ab-L coupling reaction with D or DL ​​with Ab, depending on the synthetic route used to prepare the ADC.

[0384] In one preferred embodiment of R¹⁰ means the group:

<img file="PL2817338T3_D0028.tif" />

where the asterisk indicates the point of attachment to the N10 position, CBA is the binding agent / cell modulator, L¹ means a linker, A is a linking group linking L¹ with cell binding agent, L²means a covalent bond or together with -OC (= O) - creates a self-destructive connector, and L¹ or L² means a susceptible cutter.

[0385] L.¹ preferably is a cuttable connector and may be referred to as a trigger for activating the cutting connector.

[0386] As discussed in the section "linkers" above the character L¹ and L²if present, it can vary significantly. These groups are selected based on their cleavage properties, which can be dictated by the conditions at the site to which the conjugate is delivered. Preferred are those linkers that are cleaved by the action of enzymes, although linkers that are susceptible to cleavage by changing pH (e.g., acid or base labile), temperature or irradiation (e.g., photolabile) may also be used. Connectors that are susceptible to cutting under reducing or oxidizing conditions may also find use in the present invention.

[0387] L.¹ may be a continuous amino acid sequence. The amino acid sequence may be the target substrate for enzymatic cleavage, which allows the release of R¹⁰ from position N10 [0388] In one embodiment, L¹ it is susceptible to cleavage by the action of the enzyme. In one embodiment, the enzyme is an esterase or a peptidase.

[0389] In one embodiment of L² is present and together with -C (= O) O- forms a self-destructive connector.

In one embodiment, L² is a substrate for enzymatic activity, thus allowing the release of R¹⁰ from position N10.

[0390] In one embodiment where L¹ it is susceptible to cleavage by the enzyme and L² is present, the enzyme cleaves the bond between L¹ and L².

[0391] Regarding the attachment of the selected linker to the selected PBD, the R group^C is removable from the N10 position of certain PBD moieties to leave the imine N10-C11 bond, carbinolamine, a substituted carbinolamine where QR¹¹ means OSO3M, a bisulfite adduct, thiocarbinolamine, a substituted thiocarbinolamine or a substituted carbinolamine.

[0392] In one embodiment of R^C, can be a protecting group that can be removed to leave an iminic bond N10-C11, carbinolamine, a substituted carbinolamine, or, where QR¹¹ means OSO3M, a bisulfite adduct. In one embodiment R^C is a protecting group that can be removed to leave the N10-C11 imine bond.

[0393] Group R^C it should be removable under the same conditions as those required to remove the R group¹⁰, for example, to obtain an imine bond N10-C11, carbinolamine and so on. The capping group acts as a safety group for the intended functionality in position N10. The capping group is intended to be non-reactive to the cell-binding agent. For example, R^C is not the same as R^L.

[0394] Compounds having a ringing moiety can be used as intermediates in the synthesis of dimers having a monomer and mine. Alternatively, compounds having a capping group can be used as conjugates in which the capping group is removed at the target site to obtain an imine, carbinolamine, substituted carbinolamine and so on. Thus, in this embodiment the capping group can be referred to as a therapeutically removable nitrogen protecting group, as defined in WO 00/12507.

[0395] In one embodiment, the R group^C it can be removed under conditions that cut the R connector^L R group¹⁰. Thus, in one embodiment the capping group is susceptible to cleavage by the action of the enzyme.

[0396] In an alternative embodiment, the capping group is removable before connecting the link R^L with modulator. In this embodiment, the knotting group is removable under conditions that do not cut the link R^L.

[0397] Where the compound contains a functional group G¹ to form a combination with a cell-binding agent, the puffball may be removed before adding or exposing G¹.

[0398] The capping group can be used as part of the strategy of the protecting group to ensure that only one of the monomer units in the dimer is connected to the binder.

[0399] The capping group can be used as a mask for the N10-C11 imine bond. The protecting group can be removed at the time the imine functionality in the compound is required. The capping group is also masking for carbinolamine, a substituted carbinolamine and a bisulfite adduct as described above.

[0400] In one embodiment of R^C means the protection of the minian group.

[0401] In one embodiment, the carbamate protecting group is selected from: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz and PNZ.

[0402] Optionally, the carbamate protecting group is further selected from Moc.

[0403] In one embodiment of R^C means a linker group R^L devoid of a functional group to combine with the cell-binding agent.

[0404] The present application particularly applies to these R groups^Cwhich are carbamates.

[0405] In one embodiment of R^C means the group:

AND ³ ·. Ο »- * s

where the asterisk indicates the point of attachment to position N10, G² means a terminating group, L³ means a covalent bond or a cuttable L-link¹, L² means a covalent bond or together with OC (= O) forms a self-destructive connector.

Where L³ and L² both are covalent bonds, G² and OC (= O) together form a kabaminate protecting group as defined above.

[0406] L.¹ is as defined above in relation to R¹⁰.

[0407] L.² is as defined above in relation to R¹⁰.

[0408] Various terminating groups are described below, including those that are based on well-known protecting groups.

[0409] In one embodiment, L³ means cutable L-link¹and L2, together with OC (= O), forms a self-destructive connector. In this embodiment G² is Ac (acetyl) or Moc, or a carbamate protecting group selected from: Alloc, Fmoc, Boc, Troc, Teoc, Psec, Cbz and PNZ. Optionally, the carbamate protecting group is further selected from Moc.

[0410] In another embodiment G² means an acyl group -C (= O) G³where G³ is selected from alkyl (including cycloalkyl, alkenyl and alkynyl), heteroalkyl, heterocyclyl and aryl (including heteroaryl and carboaryl). These groups may optionally be substituted. The acyl group together with the amino group L³ or L², if appropriate, can form an amide bond. The acyl group together with the hydroxyl group L³ or L², if appropriate, may form an ester link.

[0411] In one embodiment G³ means heteroalkyl. The heteroalkyl group may include polyethylene glycol. The heteroalkyl group may have a heteroatom, such as O or N, adjacent to the acyl group, thereby forming a carbamate or carbonate group, if appropriate, with the heteroatom present in the L group.³ or L², if applicable.

[0412] In one embodiment G³ is selected from NH2, NHR and NRR '. Preferably, G³ means NRR '.

[0413] In one embodiment G² means a group;

<img file="PL2817338T3_D0029.tif" />

where the asterisk indicates the point of attachment to L³, n is from 0 to 6 and G⁴ is selected from OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR ', NH2, NHR, NRR', NO2, and hydrogen. The OH, SH, NH2 and NHR groups are protected. In one embodiment, n is from 1 to 6, and preferably n is 5. In one embodiment G⁴ is OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR ', and NRR'. In one embodiment G⁴ means OR, SR, and NRR '. Preferably G⁴ is selected from OR and NRR ', most preferably G⁴ means OR. Most preferably G⁴ means OMe.

EP 2 817 338 B1 ₂ [0414] In one embodiment, the group G² means:

<img file="PL2817338T3_D0030.tif" />

ο where the asterisk indicates the point of attachment to L³or G⁴ are as specified above.

[0415] In one embodiment, the G group² means:

<img file="PL2817338T3_D0031.tif" />

where the asterisk indicates the point of attachment to L³, n is from 0 or 1, m is from 0 to 50, and G⁴ is selected from OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR ', NHR NHR, NRR', NO2 and hydrogen. In a preferred embodiment, n is 1, and m is from 0 to 10, from 1 to 2, preferably from 4 to 8, most preferably 4 or 8. In another embodiment, n is 1, m is from 10 to 50, preferably from 20 to 40. OH, SH, NH2 and NHR groups are protected. In one embodiment G⁴ means OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR 'and NRR'. In one embodiment G⁴ means OR, SR and NRR '. Preferably G⁴ is selected from OR and NRR ', most preferably G⁴ means OR. Preferably G⁴ means OMe.

₂ [0416] In one embodiment, the group G² means:

<img file="PL2817338T3_D0032.tif" />

where the asterisk indicates the point of attachment to L³, an, mi G⁴ are as specified above. [0417] In one embodiment, the G group² means:

<img file="PL2817338T3_D0033.tif" />

where n is 1-20, m is 0-6, and G is⁴ is selected from OH, OR, SH, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR ', NH2, NHR, NRR', NO2 and hydrogen. In one embodiment, n is 1-10. In another embodiment, n is from 10 to 50, preferably from 20 to 40. In one embodiment, n is 1. In one embodiment, m is 1. The OH, SH, NH2 and NHR groups are protected. In one embodiment G⁴ means OR, SR, COOR, CONH2, CONHR, CONRR 'and NRR'. In one embodiment G⁴ means OR, SR and NRR '. Preferably G⁴ is selected from OR and NRR ', most preferably G⁴ means OR. Preferably G⁴ means OMe.

₂ [0418] In one embodiment, the G group² means:

, '1 m: | *

η * J. J Ο where the asterisk indicates the point of attachment to L³, an, mi G⁴ are as specified above.

[0419] In each of the above embodiments G⁴ may be OH, SH, NH2 and NHR. These groups are preferably protected.

[0420] In one embodiment, OH is protected with Bz1, TBDMS or TBDPS.

[0421] In one embodiment SH is protected with Acm, Bz1, Bz1-OMe, Bz1-Me or Trt.

[0422] In one embodiment, NH2 or NHR are protected with Boc, Moc, Z-Cl, Fmoc, Z or Alloc.

[0423] In one embodiment, the group G² is present in combination with the L group³which group is a dipeptide.

[0424] The capping group is not intended to be combined with a modulator. Thus, another monomer present in the dimer serves as a point of connection with the modulators via a connector. Accordingly, it is preferred that the functionality present in the capping group is not available for reaction with the modulator. Thus, preferably reactive functional groups such as OH, SH, NH 2, COOH are avoided. However, such functionality may occur in the capping group if it is protected as described above. [0425] Thus, according to the present teachings, one embodiment of the invention comprises a conjugate comprising the compound:

<img file="PL2817338T3_D0034.tif" />

where CBA is the cell / modulator binding agent, and n is 0 or 1. L¹ is as specified previously, and R^E and R^E"each is independently selected from H or R^D.

[0426] In another embodiment, the conjugate comprises the compound:

<img file="PL2817338T3_D0035.tif" />

wherein CBA is a cell binding agent / modulator, L¹ is as specified before, Ar¹ and Ar² each is independently optionally substituted C5-20aryl, and n is 0 or 1.

[0427] Those skilled in the art will appreciate that other symmetrical and asymmetric PBD dimers and linkers are compatible with the present invention and can be selected without undue experimentation based on the description herein and the prior art.

[0428] Another aspect of the invention includes ADCs containing radioactive isotopes. Exemplary radioactive isotopes that may be compatible with such embodiments include, but are not limited to, iodine (i.e.¹³¹AND, ¹²⁵AND,¹²³AND, ¹²¹I,), carbon (¹⁴C), copper (⁶²Cu, ⁶⁴Cu, ⁶⁷Cu), sulfur (³⁵S), tritium (³H), ind (¹¹⁵in, ¹¹³in, ¹¹²in, ¹¹¹In,), bismuth (²¹²bi, ²¹³Bi), technet (⁹⁹Tc), tal (²⁰¹Ti), gal (⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga), palladium (¹⁰³Pd)

EP 2 817 338 B1

188

188

<img file="PL2817338T3_D0036.tif" />

<img file="PL2817338T3_D0037.tif" />

At. Other radionuclides are also available as diagnostic and therapeutic agents, especially those in

211 energy range from 60 to 4,000 keV. Depending on the condition to be treated and the desired therapeutic profile, those skilled in the art will readily select appropriate radioactive isotopes for use with the disclosed modulators.

[0429] DLL3 modulators according to the present disclosure also are coupled to a therapeutic moiety or a drug that modifies a given biological response (e.g., biological response modifiers or BRM). This means that therapeutic agents or moieties that are compatible with the present disclosure are not to be construed as limited to classical therapeutic chemical agents. For example, in particularly preferred embodiments, the drug moiety may be a protein or polypeptide or fragments thereof having the desired biological activity. Such proteins may include, for example, a toxin, such as abrin, ricin A, onkonase (or other cytotoxic RNa), Pseudomonas exotoxin, cholera toxin or diphtheria toxin; a protein such as tumor necrosis factor, interferon α, interferon β, nerve growth factor, platelet growth factor, tissue plasminogen activator, apoptotic agent, e.g. TNF-α, TNF-β, AIM I (see International Publication No. WO 97/33899), AIM II (see International Publication No. WO 97/34911), Fas ligand ( Takahashi et al., 1994, J. Immunol., 6: 1567) and VEGI (see International Publication No. WO 99/23105), an anticoagulant or an anti-angiogenic agent, e.g. angiostatin or endostatin; or, a biological response modifier such as, for example, lymphokine (e.g., interleukin-1 ("IL-1"), interleukin-2 ("IL-2"), interleukin-6 ("IL-6"), factor stimulating the growth of granulocyte and macrophage colonies ("GM-CSF") and granulocyte colony stimulating factor ("G-CSF") or growth factor (eg, growth hormone ("GH")). As outlined above, methods for the fusion or conjugation of modulators with polypeptide moieties are known in the art. In addition to the references referenced above, see, e.g., USP No. 5,336,603; 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851 and 5,112,946; EP 307,434; EP 367, 166; PCT publications WO 96/04388 and WO 91/06570; Ashkenazi et al., 1991, PNAS USA 88: 10535; Zheng et al., 1995, J Immunol 154: 5590; and Vil et al., 1992, PNAS USA 89: 11337.

[0430] Furthermore, as stated above, the binding of the modulator to such moieties does not necessarily have to be direct, but can occur through the linker sequences. As previously mentioned, such linker molecules are commonly known in the art and described in Denardo et al., 1998, Clin Cancer Res 4: 2483; Peterson et al., 1999, Bioconjug Chem 10: 553; Zimmerman et al., 1999, Nucl Med Biol 26: 943; Garnett, 2002, Adv Drug Deliv Rev. 53: 171.

IX. Diagnostics and screening

A. Diagnostics [0431] In yet other instances, the disclosure provides methods for in vitro or in vivo detection of the diagnosis or monitoring of proliferative disorders and methods of cell screening from a patient to identify cancer-causing cells, including CSCs. Such methods include identifying a person having cancer to treat or monitor cancer progression, comprising contacting a patient or a sample taken from a patient (i.e. either in vivo or in vitro) with a modulator as described herein, and detecting the presence or absence or level of the cancer progression. binding the modulator to bound or free target molecules in the sample. In particularly preferred

In some cases, the modulator will contain a detectable label or reporter molecule as described herein.

[0432] In some cases, a modulator compound, such as an antibody, with specific cells in a sample probably indicates that the sample may contain CSC, thereby indicating that the subject having cancer can be effectively treated with a modulator as described herein. The methods may further comprise the step of comparing the level of binding to a control. Conversely, when the modulator is an Fc construct, binding properties can be used and monitored (directly or indirectly, in vivo or in vitro) when in contact with the sample to provide the desired information.

[0433] Exemplary compatible test methods include radioimmunoassays, enzyme immunoassays, competitive binding assays, immunofluorescence assays, immunoblotting assays, Western blot analysis, flow cytometry assays and ELISA assays. In vivo compatible theragnostics or diagnostics may include art imaging or monitoring techniques known in the art, such as magnetic resonance imaging, computed tomography (e.g., CAT study), positron emission tomography (e.g., PET), radiography, ultrasonography, etc., as well as known to those skilled in the art.

[0434] In another embodiment, the disclosure provides a method of analyzing cancer progression and / or pathogenesis in vivo. In another case, the analysis of cancer progression and / or pathogenesis in vivo involves determining the degree of tumor progression. Otherwise, the analysis includes tumor identification. In another case, the analysis of tumor progression is carried out in the primary tumor. In another case, the analysis is carried out over time depending on the type of cancer, as known to those skilled in the art. In another case, further analysis of secondary tumors derived from metastatic primary tumor cells is analyzed in vivo. In another case, the size and shape of secondary tumors are analyzed. In some cases, further ex vivo analysis is carried out.

[0435] In another instance, the invention provides a method of analyzing cancer progression and / or pathogenesis in vivo, including determining cell metastasis or detecting and quantifying the level of circulating cancer cells. In yet another case, the analysis of cell metastasis involves determining the progressive cell growth at a discontinuous site from the primary tumor. In another case, the site of cell metastasis analysis includes the pathway of cancer spread. In some cases, the cells may disperse via blood vessels, lymphatic vessels, body cavities or combinations thereof. In another case, the analysis of cell metastases is carried out in connection with cell migration, dissemination, extravasation, proliferation or combinations thereof.

[0436] Accordingly, in a particularly preferred case, the modulators of the present invention can be used to detect and quantify DLL3 levels in a patient sample (e.g., plasma or blood), which in turn can be used to detect, diagnose or monitor disorders related to DLL3, including proliferative disorders. In related cases, the modulators of the present disclosure can be used to detect, monitor and / or quantify circulating tumor cells in vivo or in vitro (see, e.g., WO 2012/0128801). In still other preferred embodiments, circulating cancer cells may include cancer stem cells.

[0437] In certain examples, cells causing a tumor formation in a subject or a sample from a subject can be evaluated or characterized using the disclosed modulators before therapy or a scheme to determine the baseline value. In other examples, the sample comes from

The subject was treated. In some instances, a sample is taken from the subject at least about 1, 2, 4, 6, 7, 8, 10, 12, 4, 15, 16, 18, 20, 34, 60, 90 days, 6 months, 9 months, 12 months or> 12 months from the start or end of the individual treatment. In certain instances, cancer-causing cells are evaluated or characterized after a number of doses (e.g., after 2, 5, 10, 20, 30 or more doses of therapy). In other examples, the tumor-causing cells are characterized or scored after 1 week, 2 weeks, 1 month, 2 months, 1 year, 2 years, 3 years, 4 years or more after one or more treatments.

[0438] In another aspect, and as discussed in more detail below, the present disclosure provides kits for detecting, monitoring or diagnosing a hyperproliferative disorder, identifying a subject with such a disorder to treat or monitor the progression (or regression) of a disorder in the subject, wherein the kit includes a modulator as described herein and reagents for detecting the effect of the modulator on the sample.

[0439] Yet another case of the present disclosure involves the use of labeled DLL3 for immunohistochemistry (IHC). Therefore, IH3 DLL3 can be used as a diagnostic tool to help diagnose various proliferative disorders and to monitor potential response to treatment, including DLL3 modulator therapy. Compatible diagnostic tests can be performed on tissues that have been chemically fixed (including but not limited to: formaldehyde, glutaraldehyde, osmium tetroxide, potassium dichromate, acetic acid, alcohols, zinc salts, mercuric chloride, chromium tetroxide and picrylic acid) and submerged (including, but not limited to: glycol methacrylate, paraffin and resins) or preserved via freezing. As discussed in more detail below,

B. Screening [0440] In certain cases, modulators may also be used to screen or identify compounds or agents (e.g., drugs) that alter the function or activity of cells that cause the formation of tumors or their daughter cells by interacting with an antigen (e.g. its genotypic or phenotypic components). Such compounds and agents can be, for example, drug candidates who are screened for treatment of a proliferative disorder. In one instance, the system or method includes cancer-causing cells comprising DLL3 and a compound or agent (e.g., a drug), wherein the cells and compound or agent are in contact with each other. In these cases, the cells could be identified,

[0441] W jeszcze innym przypadku sposób obejmuje kontaktowanie, bezpośrednio lub pośrednio, komórek powodujących tworzenie się nowotworu lub ich potomstwa ze środkiem lub związkiem testowym i określenie, czy środek lub związek testowy modulują aktywność lub funkcję komórek powodujących tworzenie się nowotworu związanych z antygenem. Jednym z przykładów bezpośredniego oddziaływania jest oddziaływanie fizyczne, podczas gdy oddziaływanie pośrednie obejmuje działanie ko mpo zycji na cząsteczkę pośredniczącą, która z kolei działa na podmiot odwoławczy (np. komórkę lub hodowlę ko mórkową). Przykładowe aktywności lub funkcje, które mogą być modulowane, obejmują zmiany morfologii komórek lub żywotności, ekspresję markera, różnicowanie lub odzróżnicowanie, oddychanie komórek, aktywność mitochondrialną, integralność błonową, dojrzewanie, proliferację, żywotność, apoptozę lub śmierć komórki.

EP 2 817 338 B1 [0442] Sposoby przeszukiwania i identyfikacji środków i związków obejmują te, które nadają się do przeszukiwania o dużej przepustowości, obejmującego macierze komórek (np. mikromacierze) umiejscowione lub umieszczone, ewentualnie we wcześniej określonych miejscach lub adresach. Na przykład, ko mó rki mogą być umiejscawiane lub umieszczane (wstępnie zaszczepione) na szalce hodowlanej, probówce, butelce, butelce typu roller lub płytce (np. pojedynczej płytce lub szalce wielostudzienkowej, na przykład, 8, 16, 32, 64, 96 , 384 i 1536 płytce lub szalce wielostudzienkowej). Sposoby manipulacji robotycznej lub ręcznej o dużej przepustowości mogą sondować oddziaływania chemiczne i określać poziomy ekspresji wielu genów w krótkim czasie. Opracowano techniki, które wykorzystują sygnały molekularne (np. via fluorofory) i zautomatyzowane analizy, które przetwarzają informacje w bardzo szybkim tempie (patrz, np. Pinhasov i wsp., Comb. Chem, High Throughput Screen 7: 133 (2004)). Na przykład, technologia mikromacierzy została szeroko wykorzystana do sondowania oddziaływań tysięcy genów naraz, dostarczając informacji o konkretnych genach (patrz np. Mocellin i Rossi, Adv. Exp. Med. Biol. 593: 19 (2007)).

[0443] Biblioteki, które mogą być przeszukiwane, obejmują, na przykład, biblioteki małych cząsteczek, biblioteki prezentacji fagowej, biblioteki prezentacji drożdżowej w pełni ludzkich przeciwciał (Adimab, LLC), biblioteki siRNA i wektory transfekcji adenowirusowej.

X. Preparaty farmaceutyczne i zastosowania terapeutyczne

A. Formulacje i drogi podania [0444] W zależności od postaci modulatora wraz z ewentualnym koniugatem, trybu zamierzonego dostarczania, leczonej lub monitorowanej choroby oraz licznych innych zmiennych, kompozycje według ujawnienia można formułować jak pożądane, stosując techniki znane w dziedzinie. W niektórych przykładach wykonania kompozycje terapeutyczne według wynalazku można podawać w postaci czystej lub z minimalną ilością dodatkowych składników, podczas gdy inne mogą ewentualnie być sformułowane tak, aby zawierały odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne nośniki obejmujące substancje pomocnicze i środki pomocnicze, które są dobrze znane w tej dziedzinie (patrz np. Gennaro , Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons: Drugfacts Plus, wydanie 20. (2003), Ansel i wsp., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, wydanie 7., Lippencott Williams i Wilkins (2004); Kibbe i wsp., Handbook of Pharmaceutical Excipients, wydanie 3., Pharmaceutical Press (2000)). Różne farmaceutycznie dopuszczalne nośniki, które obejmują substancje nośne, adiuwanty i rozcieńczalniki, są łatwo dostępne z licznych źródeł komercyjnych. Ponadto dostępny jest również asortyment farmaceutycznie dopuszczalnych środków pomocniczych, takich jak środki dostosowujące pH i buforujące, środki dostosowujące toniczność, stabilizatory, środki zwilżające i tym podobne. Niektóre nieograniczające przykładowe nośniki obejmują sól fizjologiczną, buforowaną sól fizjologiczną, dekstrozę, wodę, glicerol, etanol i ich kombinacje.

[0445] Bardziej szczegółowo należy zauważyć, że w niektórych przykładach wykonania, kompozycje terapeutyczne według wynalazku można podawać w postaci czystej lub z minimum dodatkowych składników. Odwrotnie, modulatory DLL3 według niniejszego wynalazku mogą być ewentualnie formułowane tak, aby zawierały odpowiednie farmaceutycznie dopuszczalne nośniki obejmujące substancje pomocnicze i środki pomocnicze, które są dobrze znane w dziedzinie i są stosunkowo obojętnymi substancjami, które ułatwiają podawanie modulatora, lub które wspomagają przetwarzanie substancji aktywnych w preparaty, które są farmaceutycznie zoptymalizowane pod kątem dostarczenia do miejsca działania. Na przykład,

EP 2 817 338 B1 substancja pomocnicza może nadawać postać lub konsystencję lub działać jako rozcieńczalnik w celu polepszenia farmakokinetyki lub stabilności modulatora. Odpowiednie substancje pomocnicze lub dodatki obejmują, ale nie wyłącznie, środki stabilizujące, środki zwilżające i emulgujące, sole zmieniające osmolarność, środki kapsułkujące, bufory i środki zwiększające przenikanie do skóry. W pewnych korzystnych przykładach wykonania kompozycje farmaceutyczne mogą być dostarczane w postaci liofilizowanej i rekonstytuowane, na przykład, w buforowanej soli fizjologicznej przed podaniem.

[0446] Ujawnione modulatory do podawania ogólnoustrojowego można formułować do podawania dojelitowego, pozajelitowego lub miejscowego. Rzeczywiście, wszystkie trzy typy formulacji można stosować równocześnie, aby osiągnąć układowe podawanie składnika aktywnego. Substancje pomocnicze jak również formulacje do podawania pozajelitowego i nie-pozajelitowego przedstawiono w Remington, The Science and Practice of Pharmacy, wydanie 20., Mack Publishing (2000). Odpowiednie formulacje do podawania pozajelitowego obejmują wodne roztwory substancji aktywnych w postaci rozpuszczalnej w wodzie, na przykład, soli rozpuszczalnych w wodzie. Ponadto, można podawać zawiesiny związków aktywnych jako odpowiednie do olejowych zawiesin do iniekcji. Odpowiednie lipofilowe rozpuszczalniki lub substancje nośne obejmują oleje tłuszczowe, na przykład, heksylopodstawiony poli(laktyd), olej sezamowy lub syntetyczne estry kwasów tłuszczowych, na przykład, oleinian etylu lub triglicerydy. Wodne zawiesiny do iniekcji mogą zawierać substancje, które zwiększają lepkość zawiesiny i obejmują, na przykład, karboksymetylocelulozę sodową, sorbitol i/lub dekstran. Ewentualnie zawiesina może zawierać również stabilizatory. Liposomy można również stosować do enkapsulacji środka do dostarczania do komórki.

[0447] Odpowiednie formulacje do podawania dojelitowego obejmują twarde lub miękkie kapsułki żelatynowe, pigułki, tabletki, w tym tabletki powlekane, eliksiry, zawiesiny, syropy lub inhalacje i ich postacie o kontrolowanym uwalnianiu.

[0448] Ogólnie związki i kompozycje według ujawnienia, zawierające modulatory DLL3, można podawać in vivo wymagającemu tego osobnikowi, różnymi drogami, w tym, ale nie wyłącznie, doustnie, dożylnie, do tętnicy, podskórnie, pozajelitowo, donosowo, domięśniowo, doczaszkowo, dosercowo, dokomorowo, dotchawicznie, podpoliczkowo, doodbytniczo, dootrzewnowo, doskórnie, miejscowo, przezskórnie i dooponowo, lub w inny sposób przez implantację lub inhalację. Kompozycje według wynalazku można formułować w preparaty w postaci stałej, półstałej, ciekłej lub gazowej; w tym, ale nie wyłącznie, tabletki, kapsułki, proszki, granulki, maści, roztwory, czopki, enemy, iniekcje, inhalatory i aerozole. Odpowiednia formulacja i droga podawania mogą być wybrane zgodnie z zamierzonym zastosowaniem i schematem terapeutycznym.

B. Dawkowania [0449] Podobnie, konkretny schemat dawkowania, to znaczy dawka, czas i powtórzenie, będzie zależeć od konkretnej osoby i jej historii medycznej, a także od rozważań empirycznych, takich jak farmakokinetyka (np. okres półtrwania, klirens, itp.). Częstość podawania może być określona i skorygowana w trakcie terapii i opiera się na zmniejszeniu liczby komórek proliferacyjnych lub powodujących tworzenie się nowotworu, utrzymując zmniejszenie takich komórek nowotworowych, zmniejszając proliferację komórek nowotworowych lub opóźniając rozwój przerzutów. W innych przykładach wykonania podawane dawkowanie może być dostosowywane lub łagodzone w celu wyeliminowania potencjalnych skutków ubocznych i/lub toksyczności. Alternatywnie, odpowiednie mogą być formulacje o przedłużonym uwalnianiu przedmiotowej kompozycji terapeutycznej.

EP 2 817 338 B1 [0450] Ogólnie rzecz biorąc, modulatory według ujawnienia mogą być podawane w różnych zakresach. Obejmują one około 10 μg / kg masy ciała do około 100 mg / kg masy ciała na dawkę; około 50 μg / kg masy ciała do około 5 mg / kg masy ciała na dawkę; około 100 μg / kg masy ciała do około 10 mg / kg masy ciała na dawkę. Inne zakresy obejmują około 100 μg / kg masy ciała do około 20 mg / kg masy ciała na dawkę i około 0,5 mg / kg masy ciała do około 20 mg / kg masy ciała na dawkę. W pewnych przykładach wykonania dawka wynosi co najmniej około 100 μg / kg masy ciała, co najmniej około 250 μg / kg masy ciała, co najmniej około 750 μg / kg masy ciała, co najmniej około 3 mg / kg masy ciała, co najmniej około 5 mg / kg masy ciała, co najmniej około 10 mg / kg masy ciała.

[0451] W wybranych przypadkach modulatory będą podawane w przybliżeniu w ilości 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 lub 100 μg / kg masy ciała na dawkę. Inne przypadki obejmują podawanie modulatorów w ilości 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 lub 900 μg / kg masy ciała na dawkę. W innych korzystnych przypadkach ujawnione modulatory będą podawane w ilości 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 lub 10 mg / kg. W jeszcze innych przypadkach modulatory można podawać w ilości 12, 14, 16, 18 lub 20 mg / kg masy ciała na dawkę. W jeszcze innych przypadkach modulatory można podawać w ilości 25, 30, 35, 40, 45, 0, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90 lub 100 mg / kg masy ciała na dawkę. Zgodnie z instrukcjami w niniejszym dokumencie należy zauważyć, że wspomniane powyżej dawki mają zastosowanie zarówno do nieskoniugowanych modulatorów jak i modulatorów skoniugowanych ze środkiem cytotoksycznym. Specjalista w tej dziedzinie mógłby łatwo określić odpowiednie dawki dla różnych skoniugowanych i nieskoniugowanych modulatorów na podstawie przedklinicznych badań na zwierzętach, obserwacji klinicznych oraz standardowych technik i pomiarów medycznych i biochemicznych.

[0452] W odniesieniu do modulatorów skoniugowanych szczególnie korzystne przykłady wykonania obejmują dawki od około 50 μg / kg do około 5 mg / kg masy ciała na dawkę. W tym kontekście modulatory skoniugowane można podawać w ilości 50, 75 lub 100 μg / kg lub 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9 lub 1 mg / kg masy ciała na dawkę. W innych korzystnych przykładach wykonania skoniugowane modulatory według niniejszego wynalazku można podawać w ilości 1,25, 1,5, 1,75, 2, 2,25, 2,5, 2,75, 3, 3,25, 3,5, 3,75, 4, 4,25, 4,5, 4,75 lub 5 mg / kg mc. masa na dawkę. W szczególnie korzystnych przykładach wykonania takie dawki skoniugowanego modulatora będą podawane dożylnie przez pewien czas. Ponadto takie dawki mogą być podawane wielokrotnie w określonym czasie leczenia.

[0453] Inne schematy dawkowania można przewidzieć na podstawie obliczeń pola powierzchni ciała (BSA), jak ujawniono w U.S.P.N. 7,744,877. Jak dobrze wiadomo, BSA oblicza się z wykorzystaniem wzrostu i masy pacjenta i dostarcza się pomiaru wielkości osobnika jak reprezentowany przez pole powierzchni jego lub jej ciała. W niektórych przypadkach modulatory można podawać w dawkach od 10 mg / m² do 800 mg /

2 2 2 2 2 2 m² , od 50 mg / m² do 500 mg / m² i w dawkach 100 mg / m² , 150 mg / m² , 200 mg / m² , 250 mg / m² ,

300 mg / m² , 350 mg / m² , 400 mg / m² lub 450 mg / m².

[0454] Należy również zauważyć, że w celu określenia odpowiedniej dawki dla skoniugowanych modulatorów (tj. ADC) można zastosować techniki empiryczne i znane w dziedzinie.

[0455] W każdym przypadku modulatory DLL3 (zarówno skoniugowane, jak i nieskoniugowane) korzystnie podaje się w miarę potrzeby osobnikom, którzy tego potrze bują. Określanie częstości podawania może być dokonywane przez specjalistów w tej dziedzinie, takich jak lekarz na podstawie rozważań dotyczących leczonego stanu chorobowego, wieku poddawanego leczeniu osobnika, nasilenia leczonego stanu chorobowego, ogólnego stanu zdrowia poddawanego leczeniu osobnika i tym podobnych. Ogólnie skuteczna dawka modulatora DLL3 jest podawana osobnikowi raz lub kilka razy. Bardziej konkretnie,

EP 2 817 338 B1 skuteczna dawka modulatora jest podawana osobnikowi raz w miesiącu, częściej niż raz w miesiącu lub rzadziej niż raz w miesiącu. W pewnych przypadkach skuteczna dawka modulatora DLL3 może być podawana wielokrotnie, w tym przez okres wynoszący co najmniej miesiąc, co najmniej sześć miesięcy, co najmniej rok, co najmniej dwa lata lub przez okres kilku lat. W jeszcze innych przypadkach kilka dni (2, 3, 4, 5, 6 lub 7), kilka tygodni (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 lub 8) lub kilka miesięcy (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 lub 8), a nawet rok lub kilka lat może upłynąć pomiędzy podawaniem ujawnionych modulatorów.

[0456] W pewnych korzystnych przykładach wykonania przebieg leczenia obejmującego skoniugowane modulatory będzie obejmował wiele dawek wybranego produktu leczniczego (tj. ADC) przez okres kilku tygodni lub miesięcy. Bardziej konkretnie, skoniugowane modulatory według niniejszego wynalazku można podawać raz dziennie, co dwa dni, co cztery dni, co tydzień, co dziesięć dni, co dwa tygodnie, co trzy tygodnie, co miesiąc, co sześć tygodni, co dwa miesiące, co dziesięć tygodni lub co trzy miesiące. W tym kontekście należy zauważyć, że można zmieniać te dawki lub można dostosowywać odstęp na podstawie reakcji pacjenta i praktyk klinicznych.

[0457] Dawki i schematy można również określić empirycznie dla ujawnionych kompozycji terapeutycznych u osób, którym podano jedną lub więcej dawek. Na przykład, osobom można dawać osobne dawki kompozycji terapeutycznej wytworzonej jak opisano w niniejszym dokumencie. W wybranych przypadkach dawkowanie może być stopniowo zwiększane lub zmniejszane lub osłabiane odpowiednio na podstawie empirycznie określonych lub obserwowanych skutków ubocznych lub toksyczności. W celu oceny skuteczności wybranej kompozycji, można obserwować marker określonej choroby, zaburzenia lub stanu chorobowego, jak wcześniej opisano. W przypadkach, gdy dana osoba cierpi na raka, obejmuje to bezpośrednie pomiary wielkości guza via palpacja lub obserwacja wzrokowa, pośrednie pomiary wielkości guza metodą rentge nowską lub innymi technikami obrazowania; poprawę, jak oceniona za pomocą bezpośredniej biopsji guza i mikroskopowe badanie próbki guza; pomiar pośredniego markera nowotworu (np. PSA dla raka gruczołu krokowego) lub antygenu zidentyfikowanego zgodnie z meto da mi opisanymi w niniejszym dokumencie, zmniejszenie bólu lub porażenia; poprawę mowy, widzenia, oddychania lub innej niepełnosprawności związanej z nowotworem; zwiększony apetyt; lub poprawę jakości życia, mierzoną zaakceptowanymi testami lub przedłużeniem przeżycia. Dla specjalisty oczywiste będzie, że dawkowanie będzie się różnić w zależności od osoby, rodzaju stanu nowotworowego, stadium stanu nowotworowego, tego czy stan nowotworowy zaczął przerzutować do innej lokalizacji u osobnika, oraz stosowanych w przeszłości i jednocześnie terapii.

C. Terapie skojarzone [0458] Terapie skojarzone mogą być szczególnie użyteczne w zmniejszaniu lub hamowaniu niepożądanej proliferacji komórek nowotworowych, zmniejsza niu występowania raka, zmniejszaniu lub zapobieganiu nawrotom raka lub zmniejszaniu lub zapobieganiu rozprzestrzenianiu się lub przerzutom raka. W takich przypadkach modulatory według niniejszego ujawnienia mogą działać jako czynniki uczulające lub chemouczulające poprzez usunięcie CSC, które w przeciwnym razie podtrzymywałyby i unieśmiertelniały masę guza, a tym samym umożliwiałyby bardziej efektywne wykorzystanie obecnego standardu środków do zmniejszania masy lub przeciwrakowych. Oznacza to, że ujawnione modulatory mogą w pewnych przypadkach zapewnić zwiększony efekt (np. addytywny lub synergistyczny), który pobudza tryb działania innego podawanego środka terapeutycznego. W kontekście niniejszego ujawnienia określenie "terapia skojarzona" należy interpretować w szerokim zakresie i odnosi się jedynie do podawania modulatora i

EP 2 817 338 B1 jednego lub więcej środków przeciwrakowych, które obejmują, ale nie wyłącznie, środki cytotoksyczne, środki cytostatyczne, środki antyangiogenne środki zmniejszające masę guza, środki chemoterapeutyczne, środki do radioterapii i radioterapeutyczne, ukierunkowane środki przeciwrakowe (w tym zarówno przeciwciała monoklonalne, jak i małe cząsteczki), BRM, przeciwciała terapeutyczne, szczepionki przeciwko rakowi, cytokiny, terapie hormonalne, naświetlanie i środki antymetastatyczne oraz środki immunoterapeutyczne, w tym zarówno podejścia specyficzne, jak i niespecyficzne.

[0459] Nie jest wymagane, aby połączone wyniki były addytywne wobec efektów obserwowanych gdy każde leczenie (np. przeciwciała i środek przeciwrakowy) przeprowadza ne jest oddzielnie. Chociaż co najmniej addytywne efekty są ogólnie pożądane, korzystne jest jakiekolwiek zwiększenie efektu przeciwnowotworowego powyżej jednej z pojedynczych terapii. Ponadto wynalazek nie wymaga, aby terapia skojarzona wykazywała działanie synergistyczne. Jednakże specjaliści w dziedzinie docenią, że przy pewnych wybranych kombinacjach, które obejmują korzystne przykłady wykonania, można zaobserwować synergizm.

[0460] W praktyce terapii skojarzonej modulator i środek przeciwrakowy mogą być podawane pacjentowi jednocześnie, albo w pojedynczej kompozycji, albo jako dwie lub więcej różnych kompozycji z zastosowaniem tej samej lub różnych dróg podawania. Alternatywnie, modulator może poprzedzać, lub następować po leczeniu środkiem przeciwrakowym przez, np. odstępy w zakresie od minut do tygodni. Okres pomiędzy każdym podaniem jest taki, że środek przeciwrakowy i modulator mogą wywierać połączone działanie na nowotwór. W co najmniej jednym przypadku zarówno środek przeciwrakowy jak i modulator podaje się w ciągu około 5 minut do około dwóch tygodni od siebie nawzajem. W jeszcze innych przypadkach kilka dni (2, 3, 4, 5, 6 lub 7), kilka tygodni (1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 lub 8) lub kilka miesięcy (1, 2, 3, 4 , 5, 6, 7 lub 8) może minąć pomiędzy podaniem modulatora i leku przeciwrakowego.

[0461] Terapię skojarzoną można podawać raz, dwa razy lub co najmniej przez pewien czas, dopóki dany stan chorobowy nie zostanie wyleczony, złagodzony lub uleczony. W niektórych przykładach wykonania terapię skojarzoną podaje się wielokrotnie, na przykład, od trzech razy dziennie do raz na sześć miesięcy. Podawanie może odbywać się zgodnie ze schematem, takim jak trzy razy dziennie, dwa razy dziennie, raz dziennie, raz na dwa dni, raz na trzy dni, raz w tygodniu, raz na dwa tygodnie, raz w miesiącu, raz na dwa miesiące, raz na trzy miesiące, raz na pół roku lub można podawać w sposób ciągły za pomocą minipompy. Terapię skojarzoną można podawać dowolną drogą, jak wspomniano wcześniej. Terapię skojarzoną można podawać w miejscu oddalonym od miejsca guza.

[0462] W jednym przypadku modulator podaje się w kombi nacji z jednym lub większą liczbą środków przeciwra kowych przez krótki cykl leczenia pacjentowi, który tego potrzebuje. Ujawnienie obejmuje również nieciągłe podawanie lub codzienne dawki podzielone na kilka częściowych podań. Modulator i środek przeciwrakowy mogą być podawane wymiennie, w alternatywnych dniach lub tygodniach; lub może być podana sekwencja terapii przeciwciałem, a następnie jedna lub więcej terapii środkiem przeciwrakowym. W każdym przypadku, jak będzie zrozumiałe dla specjalistów w tej dziedzinie, odpowiednie dawki środków chemioterapeutycznych będą zazwyczaj około dawek już stosowanych w terapiach klinicznych, w których chemioterapeutyki podaje się same lub w kombinacji z innymi chemioterapeutykami.

[0463] W innym korzystnym przypadku modulatory DLL3 według niniejszego ujawnienia mogą być stosowane w terapii podtrzymującej w celu zmniejszenia lub wyeliminowania szansy na nawrót nowotworu po pierwotnej prezentacji choroby. Korzystnie zaburzenie zostanie wyleczone, a początkowa masa guza wyeliminowana, zmniejszona lub w inny sposób złagodzona tak, że pacjent nie ma objawów lub jest w

EP 2 817 338 B1 remisji. W tym czasie pacjentowi można podawać farmaceutycznie skuteczne ilości ujawnionych modulatorów raz lub więcej razy, nawet jeśli jest mało lub nie ma wskazań choroby z zastosowaniem standardowych procedur diagnostycznych. W niektórych przypadkach modulatory będą podawane regularnie przez pewien czas, tak jak co tydzień, co dwa tygodnie, co miesiąc, co sześć tygodni, co dwa miesiące, co trzy miesiące, co sześć miesięcy lub co roku. Biorąc pod uwagę informacje w niniejszym dokumencie, specjalista w tej dziedzinie łatwo określi korzystne dawki i schematy dawkowania w celu zmniejszenia potencjału nawrotu choroby. Co więcej, takie leczenie może być kontynuowane przez okres tygodni, miesięcy, lat, a nawet przez czas nieokreślony w zależności od odpowiedzi pacjenta oraz parametrów klinicznych i diagnostycznych.

[0464] W jeszcze innym korzystnym przypadku, modulatory według niniejszego ujawnienia mogą być stosowane profilaktycznie lub jako terapia wspomagająca, aby zapobiec lub zmniejszyć możliwość przerzutu nowotworu w wyniku procedury zmniejszania masy guza. W znaczeniu stosowanym w niniejszym ujawnieniu "procedura zmniejszania masy guza" jest szeroko określana i oznacza jakąkolwiek procedurę, technikę lub metodę, która eliminuje, zmniejsza, leczy lub łagodzi guza lub proliferację guza. Przykładowe procedury zmniejszania masy guza obejmują, ale nie wyłącznie, za biegi chirurgiczne, leczenie promieniowaniem (tj. promieniowanie wiązki), chemioterapię, immunoterapię lub ablację. W odpowiednich mo mentach łatwo określanych przez specjalistę w tej dziedzinie, w związku z niniejszym ujawnieniem, ujawnione modulatory można podawać w sposób sugerowany przez kliniczne, diagnostyczne lub teragnostyczne procedury w celu zmniejszenia przerzutów nowotworowych. Modulatory można podawać raz lub kilka razy w farmaceutycznie skutecznych dawkach, jak określone z zastosowaniem standardowych technik. Korzystnie, schematowi dawkowania będą towarzyszyć odpowiednie techniki diagnostyczne lub monitorujące, które umożliwiają jego modyfikację.

[0465] Jeszcze inne przypadki według ujawnienia obejmują podawanie ujawnionych modulatorów osobnikom bezobjawowym, ale narażonym na ryzyko wystąpienia zaburzenia proliferacyjnego. Oznacza to, że modulatory według niniejszego ujawnienia można stosować w naprawdę zapobiegawczym znaczeniu i podawać pacjentom, którzy zostali zbadani lub przetestowani i mają jeden lub więcej wymienionych czynników ryzyka (np. wskazania genomowe, historię rodzinną, wyniki testu in vivo lub in vitro, itp.), ale nie rozwinęli nowotworu. W takich przypadkach specjaliści w dziedzinie mogliby ustalić skuteczny schemat dawkowania poprzez obserwację empiryczną lub dopuszczone praktyki kliniczne.

D. Środki przeciwrakowe [0466] Określenie "środek przeciwrakowy" lub "środek przeciwproliferacyjny" oznacza dowolny środek, który może być stosowany do leczenia zaburzenia proliferacyjnego komórek, takiego jak rak, i obejmuje, ale nie wyłącznie, środki cytotoksyczne, środki cytostatyczne, środki antyangiogenne, środki zmniejszające masę guza, środki chemioterapeutyczne, środki do radioterapii i radioterapeutyczne, ukierunkowane środki przeciwrakowe, BRM, przeciwciała terapeutyczne, szczepionki przeciwko rakowi, cytokiny, terapie hormonalne, radioterapię i środki przeciwko przerzutom oraz środki immunoterapeutyczne. Należy zauważyć, że w wybranych przypadkach, jak omówiono powyżej, takie środki przeciwrakowe mogą obejmować koniugaty i mogą być związane z modulatorami przed podaniem. W pewnych przypadkach ujawniony środek przeciwrakowy zostanie połączony z modulatorem DLL3 w celu dostarczenia ADC jak przedstawiono w niniejszym dokumencie.

EP 2 817 338 B1 [0467] W znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie określenie "środek cytotoksyczny" oznacza substancję, która jest toksyczna dla komórek i zmniejsza lub hamuje funkcję komórek i / lub powoduje zniszczenie komórek. Zazwyczaj substancja jest naturalnie występującą cząsteczką pochodzącą od żywego organizmu. Przykłady środków cytotoksycznych obejmują, ale nie wyłącznie, toksyny małocząsteczkowe lub enzymatycznie aktywne toksyny bakterii (np. toksynę błoniczą, endotoksynę i egzotoksynę Pseudomonas, enterotoksynę A Staphylococcus), grzybów (np. α-sarcynę, restryktocynę), roślin (np. abrynę, rycynę, modekinę, wiskuminę, białko antywirusowe szkarłatki amerykańskiej, saporynę, żeloninę, momoridynę, trichosantynę, toksynę jęczmienia, białka Aleurites fordii, białka diantyny, białka Phytolacca mericana (PAPI, PAPII i PAP-S), inhibitor Momordica charantia, kurcynę, krotynę inhibitor Saponaria officinalis, żeloninę, mitożelinę, restryktocynę, fenomycynę, neomycynę i trichoteceny) lub zwierząt, (np. cytotoksyczne RNazy, takie jak zewnątrzko mórkowe RNazy trzustkowe, DNaza 1, w tym ich fragmenty i / lub warianty) .

[0468] Dla celów niniejszego wynalazku "środek chemoterapeutyczny" obejmuje związek chemiczny, który niespecyficznie zmniejsza lub hamuje wzrost, proliferację i/lub przeżycie komórek nowotworowych (np. środki cytotoksyczne lub cytostatyczne). Takie środki chemiczne często są ukierunkowane na wewnątrzko mórkowe procesy niezbędne do wzrostu lub podziału komórek, a zatem są szczególnie skuteczne przeciwko komórkom nowotworowym, które zwykle rosną i dzielą się szybko. Na przykład, winkrystyna depolimeryzuje mikrotubule, a tym samym hamuje komórki przed wchodzeniem w mitozę. Ogólnie, środki chemoterapeutyczne mogą obejmować dowolny środek chemiczny, który hamuje lub jest zaprojektowany, aby hamować, komórkę nowotworową lub komórkę, która może stać się nowotworowa lub generować potomstwo powodujące tworzenie się nowotworu (np. TIC). Takie środki są często podawane i często są najbardziej skuteczne, w kombinacji, np. w schematach takich jak CHOP lub FOLFIRI. Ponownie, w wybranych przypadkach, takie środki chemoterapeutyczne można koniugować z ujawnionymi modulatorami.

[0469] Przykłady środków przeciwrakowych, które mogą być stosowane w kombinacji z (lub skoniugowane z) modulatorami według niniejszego ujawnienia obejmują, ale nie wyłącznie, środki alkilujące, alkilosulfoniany, azyrydyny, etylenoiminy i metyloamelaminy, acetogeniny, kamptotecynę, briostatyny, kallistatynę, CC-1065, kryptoficyny, dolastatynę, duokarmycynę, eleuterobinę, pankratystatynę, sarkodiktyinę, spongistatynę, iperyty azotowe, antybiotyki, antybiotyki enediynowe, dynemicynę, bisfosfoniany, esperamycynę, chromofory enediynowych antybiotyków chromobiałkowych, aklacynomyzyny, aktynomycynę, autramycynę, azaserynę, bleomycyny, kaktynomycynę karabicynę, karminomycynę, karzynofilinę, chromomycyny, daktynomycynę, daunorubicynę, detorubicynę, 6 -diazo-5-okso-L-norleucynę, doksorubicynę ADRIAMYCIN®, epirubicynę, esorubicynę, idarubicynę, marcellomycynę, mitomycynę, kwas mykofenolowy, nogalamycynę, oliwomycyny, peplomycynę, potfiromycynę, puromycynę, kwelamycynę, rodorubicynę, streptonigrynę, streptozocynę, tubercydynę, ubenimeks, zynostatynę, zorubicynę, antymetabolity, erlotynib, wemurafenib, kryzotynib, sorafenib, ibutynib, enzalutamid, analogi kwasu foliowego, analogi puryn, androgeny, środki hamująca działanie nadnerczy, środki uzupełniające działanie kwasu foliowego, takie jak kwas frolinowy, aceglaton, glikozyd aldofosfamidowy, kwas aminolewulinowy, eniluracyl, amsakryna, bestrabucyl, bisantren, edatoksat, defofaminę, demekolcynę, diazykwon, elfornitynę, octan eliptynowy, epotilon, etoglucyd, azotan galu, hydroksymocznik, lentynan, lonidaininę, maytanzynoi dy, mitoguazon, mitoksantron, mopidanmol, nitraerynę, pentostatynę, fenamet, pirarubicynę, losoksantron, kwas podofilinowy, 2-etylohydrazyd, prokarbazynę, kompleks polisacharydowy PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR), razoksan; ryzoksynę; sizofiran; spirogermanium; kwas tenuazonowy; triazykwon; 2,2',2'88

EP 2 817 338 B1 trichlorotrietyloaminę, trichoteceny (zwłaszcza toksynę T-2, wirrakurynę A, rorydynę A i anguidynę), uretan, winyzynę, dakarbazynę, mannomustynę, mitobronitol, mitolaktol, pipobroman, gacytozynę, arabinozy d ("AraC"), cyklofosfamid, tiotepa, taksoidy, chloranbucyl, gemcytabinę GEMZAR®, 6 -tioguaninę, merkaptopurynę, metobreksat, analogi platyny, winblastynę, platynę, etopozyd (VP-16), ifosfamid, mitoksantron, winkrystynę, winorelbinę NAVINBINE®, nowantron, tenipozyd; edatreksat, daunomycynę, aminopterynę, Xeloda, ibandronian, irynotekan (Camptosar, CPT-11), inhibitor topoizomerazy RFS 2000, difluorometyloornitynę, retinoidy, kapecytabinę, kombretastatynę, leukoworynę, oksaliplatynę, inhibitory PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR i VEGF-A, które zmniejszają proliferację komórek i ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy lub pochodne dowolnego z powyższych. Objęte tą definicją są również środki przeciwhormonalne działające na regulowanie lub hamowanie działania hormonu na nowotwory, takiego jak anty-estrogeny i selektywne modulatory receptora estrogenu, inhibitory aromatazy, które hamują enzym - aromatazę, która reguluje produkcję estrogenu w gruczołach nadnerczy i anty-androgeny; jak również troksacytabinę (analogi cytozyny z nukleozydem 1,3-dioksolanu); antysensowne oligonukleotydy, rybozymy, takie jak inhibitor ekspresji VBGF i inhibitor ekspresji HER2; szczepionki, PROLEUKIN® rIL-2; inhibitor topoizomerazy 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; winorelbinę i esperamycynę oraz farmaceutycznie dopuszczalne sole, kwasy lub pochodne któregokolwiek z powyższych.

[0470] W innych przypadkach modulatory według niniejszego ujawnienia mogą być stosowane w kombinacji z dowolną liczbą przeciwciał (lub środków immunoterapeutycznych) obecnie w badaniach klinicznych lub dostępnych w handlu. W tym celu ujawnione modulatory można stosować w kombinacji z przeciwciałem wybranym z grupy obejmującej abagowomab, adekatumumab, efutuzumab, alemtuzumab, altumomab, amatuksymab, anatumomab, arcitumomab, bawituksymab, bektumomab, bewacyzumab, biwatuzumab, blinatumomab, brentuksymab, kantuzumab, katumaksomab, cetuksymab, citatuzumab, cyksutumumab, clivatuzumab, conatumumab, daratumumab, drozytumab, duligotumab, dusigitumab, detumomab, dacetuzumab, dalotuzumab, ecromexi mab, elotuzumab, ensituksymab, ertumaksomab, etaracyzumab, farletuzumab, ficlatuzumab, figitumumab, flanwotumab, futuksymab, ganitumab, gemtuzumab, girentuximab, glembatumumab, ibritumomab, igowomab, imgatuzumab, indatuximab, inotuzumab, intetumumab, ipilimumab, iratumumab, labetuzumab, lexatumumab, lintuzumab, lorwotuzumab, lucatumumab, mapatumumab, matuzumab, milatuzumab, minretumomab, mitumomab, moxetumomab, namatumab, naptumomab, necytumumab, nimotuzumab, nofetumomabn, ocaratuzumab, ofatumumab, olaratumab, onartuzumab, oportuzumab, oregowomab, panitumumab, parsatuzumab, patritumab, pemtumomab, pertuzumab, pintumomab, pritumumab, racotumomab, radretumab, rilotumumab, rytuksymab, robatumumab, satumomab, sibrotuzumab, siltuksymab, simtuzumab, solitomab, takatuzumab, taplitumomab, tenatumomab, teprotumumab, tigatuzumab, tositumomab, trastuzumab, tukotuzumab, ublituksymab, veltuzumab, vorsetuzumab, votumuinab, zalutumumab, CC49, 3F8 i ich kombinacje.

[0471] Jeszcze inne szczególnie korzystne przypad ki obejmują zastosowanie przeciwciał zatwierdzonych do terapii nowotworowej, w tym, ale nie wyłącznie, rituksymabu, trastuzumabu, gemtuzumabu ozogamycyny, alemtuzumabu, ibritumomabu tiuksetanu, tositumomabu, bewacyzumabu, cetuksymabu, panitumumabu, ofatumumabu, ipilimumabu i brentuksymabu wedotyny. Specjaliści w tej dziedzinie będą w stanie łatwo zidentyfikować dodatkowe środki przeciwrakowe, które są zgodne z niniejszym opisem.

E. Radioterapia

EP 2 817 338 B1 [0472] Niniejsze ujawnienie dostarcza również kombinacji modulatorów z radioterapią (tj. dowolnego mechanizmu indukowania uszkodzenia DNA lokalnie w komórkach nowotworowych, takiego jak naświetlanie gamma, promieniowanie rentgenowskie, promieniowanie UV, mikrofale, emisje elektroniczne i tym podobne). Rozważa się również terapię skojarzoną z zastosowaniem ukierunkowanego dostarczania izotopów promieniotwórczych do komórek nowotworowych i można ją stosować w połączeniu z ukierunkowanym środkiem przeciwrakowym lub innymi środkami kierującymi. Zazwyczaj radioterapię podaje się w impulsach przez pewien czas od około 1 do około 2 tygodni. Radioterapię można podawać pacjentom z rakiem głowy i szyi przez około 6 do 7 tygodni. Ewentualnie, radioterapi ę można podawać w postaci pojedynczej dawki lub wielokrotnej, sekwencyjnej dawki.

XI. Wskazania [0473] Zostanie docenione, że modulatory według niniejszego ujawnienia mogą być stosowane do diagnozowania, leczenia lub hamowania wystąpienia lub nawrotu dowolnego zaburzenia związa nego z DLL3. W związku z tym, czy podaje się same czy w kombinacji ze środkiem przeciwrakowym lub radioterapią, modulatory według ujawnienia są szczególnie przydatne do ogólnego leczenia stanów nowotworowych u pacjentów lub osobników, które mogą obejmować nowotwory łagodne lub złośliwe (np. nadnercza, wątroby, pęcherza moczowego, sutka, żołądka, jajników, jelita grubego, gruczołu krokowego, trzustki, płuc, tarczycy, wątroby, szyjki macicy, endometrium, przełyku i macicy, mięsaki, glejaki i różne nowotwory głowy i szyi); białaczki i nowotwory limfoidalne; inne zaburzenia, takie jak zaburzenia neuronalne, glejowe, astrocytowe, podwzgórza i inne zaburzenia gruczołowe, makrofagowe, nabłonkowe, stromatyczne i blastoceliczne; oraz zaburzenia zapalne, angiogenne, immunologiczne i zaburzenia spowodowane przez patogeny. W szczególności kluczowe cele dla leczenia to choroby nowotworowe obejmujące guzy lite, chociaż nowotwory układu krwiotwórczego są objęte zakresem wynalazku. Korzystnie "osobnik" lub "pacjent", który ma być leczony, będzie człowiekiem, chociaż w znaczeniu stosowanym w niniejszym dokumencie określenia są wyraźnie uważane za obejmujące dowolne gatunki ssaków.

[0474] Bardziej szczegółowo, stany nowotworowe podlegające leczeniu zgodnie z niniejszym wynalazkiem mogą być wybrane z grupy obejmującej, ale nie wyłącznie, guzy gruczołów nadnerczy, raki związane AIDS, mięsaka pęcherzykowego, gwiaździaki, raka pęcherza moczowego (raka płaskokomórkowego i raka przejściowonabłonkowego), raka kości (szkliwiaka, torbiele tętniakowate, wyrośle kostno-chrzęstne, kostniakomięsak), raki mózgu oraz rdzenia kręgowego, metastatyczne nowotwory mózgu, raka sutka, przyzwojaki kłębka szyjnego, raka szyjki macicy, chrzęstniakomięsaka, struniaka, raka chromofobowego nerek, raka jasnokomórkowego nerki, raka okrężnicy, raka jelita grubego, skórne łagodne włókniste histiocytoma, desmoplastyczny guz drobnookrągłokomórkowy, wyściółczaki, guzy Ewinga, chrzęstniakomięsaka śluzowatego pozakostnego, (ang. fibrogenesis imperfecta ossium), dysplazję włóknistą kości, raki pęcherzyka żółciowego i dróg żółciowych, ciążową chorobę tromboblastyczną, nowotwory zarodkowe, raki głowy i szyi, nowotwory komórek wysepek, mięsaka Kaposiego, raka nerki (nerczaka zarodkowego, raka nerkowokomórkowego), białaczki, tłuszcza ka/łagod ne guzy tłuszczakowate, tłuszczakomięsaka/złośliwe guzy tłuszcza kowate, raka wątroby (wątrobiaka, raka wątrobowokomórkowego), chłoniaki, raki płuc (raka drobnokomórkowego, gruczolakoraka, raka płaskonabłonkowego, raka wielokomórkowego, itp.), rdzeniaka zarodkowego, czerniaka, oponiaki, mnogą gruczola kowatość wewnątrzwydzielniczą, szpiczaka mnogiego, zespoły mielodysplastyczne, neuroblastoma, nowotwory neuroendokrynne, raka jajnika, raki trzustki, raka brodawkowatego tarczycy, nowotwory przytarczyc,

EP 2 817 338 B1 nowotwory u dzieci, nowotwór osłonek nerwów obwodowych, guzy chromochłonne, guza przysadki mózgowej, raka gruczołu krokowego, (ang.posterious unveai melanoma czerniak oka), rzadkie zaburzenia hematologiczne, metastatycznego raka nerki, guza rabdoidalnego, mięśniakomięsaka prążkowanokomórkowego, mięsaki, raka skóry, mięsaki tkanek miękkich, raka płaskonabłonkowego, raka żołądka, mięsaka maziówkowego, raka jąder, raka grasicy, grasiczaka, metastatycznego raka tarczy i raki macicy (raka szyjki macicy, raka endometrium i mięśniaka gładkokomórkowego).

[0475] W pewnych korzystnych przykładach wykonania zaburzenie proliferacyjne będzie obejmować guz lity, w tym, ale nie wyłącznie, nadnercza, wątroby, nerki, pęcherza moczowego, sutka, żołądka, jajników, szyjki macicy, macicy, przełyku, jelita grubego, gruczołu krokowego, trzustki, płuc (zarówno drobnokomórkowy i niedrobnokomórkowy), tarczycy, raki, mięsaki, glejaki i różne guzy głowy i szyi. W innych korzystnych przypadkach i jak pokazano poniżej w Przykładach, ujawnione modulatory są szczególnie skuteczne w leczeniu drobnokomórkowego raka płuc (SCLC) i niedrobnokomórkowego raka płuca (NSCLC) (np. płaskonabłonkowego niedrobnokomórkowego raka płuc lub płaskonabłonkowego drobnokomórkowego rak płuc). W jednym przykłądzie rak płuc jest oporny, nawrotowy lub odporny na środek na bazie platyny (np. karboplatyna, cisplatyna, oksaliplatyna, topotekan) i / lub taksan (np. docetaksel, paklitaksel, larotaksel lub kabazytaksel). Ponadto, w szczególnie korzystnych przypadkach, ujawnione modulatory można stosować w postaci skoniugowanej do leczenia drobnokomórkowego raka płuc.

[0476] W odniesieniu do drobnokomórkowego raka płuc szczególnie korzystne przykłady wykonania obejmują podawanie skoniugowanych modulatorów (ADC). W wybranych przykładach wykonania skoniugowane modulatory będą podawane pacjentom wykazujących chorobę w ograniczonym stopniu. W przypadkach ujawnione modulatory będą podawane pacjentom wykazującym rozległe stadium choroby. W innych korzystnych przykładach wykonania ujawnione skoniugowane modulatory będą podawane pacjentom opornym (tj. tym, którzy ponownie chorują podczas lub wkrótce po zakończeniu pierwszego etapu terapii). Jeszcze inne przypadki obejmują podawanie ujawnionych modulatorów wrażliwym pacjentom (tj. tym, u których nawrót jest dłuższy niż 2-3 miesiące po pierwotnej terapii). W każdym przypadku należy zauważyć, że kompatybilne modulatory mogą być w stanie skoniugowanym lub nieskoniugowanym w zależności od wybranego schematu dawkowania i diagnozy klinicznej.

[0477] Jak omówiono powyżej, ujawnione modulatory mogą być dalej stosowane do zapobiegania, leczenia lub diagnozowania nowotworów o cechach lub fenotypach neuroendokrynnych, w tym nowotworów neuroendokrynnych. Prawdziwe lub kanoniczne nowotwory neuroendokrynne (NET) powstajace z rozproszonego układu endokrynnego są stosunkowo rzadkie, z częstością występowania 2-5 na 100 000 osób, ale bardzo agresywne. Nowotwory neuroendokrynne występują w nerkach, przewodzie moczowopłciowym (pęcherzu, gruczole krokowym, jajniku, szyjce macicy i endometrium), przewodzie pokarmowym (jelito grube, żołądek), tarczycy (rak rdzeniasty tarczycy) i płucu (rak drobnokomórkowy płuc i neuroendokrynny rak wielokomórkowy płuc). Te nowotwory mogą wydzielać kilka hormonów, w tym serotoninę i/lub chromograninę A, które mogą powodować osłabiające objawy znane jako zespół rakowiaka. Takie nowotwory można oznaczać dodatnimi markami immunohistochemicznymi, takimi jak enolaza specyficzna względem neuronu (NSE, znana również jako enolaza gamma, symbol genu = ENO2), CD56 (inaczej NCAM1), chromogranina A (CHGA) i synaptofizyna (SYP) lub przez geny, o których wiadomo, że wykazują podwyższoną ekspresję, takie jak ASCL1. Niestety tradycyjne chemioterapie nie były szczególnie skuteczne w leczeniu NET, a przerzuty do wątroby jest częstym wynikiem.

EP 2 817 338 B1 [0478] Chociaż ujawnione modulatory mogą być korzystnie stosowane w leczeniu nowotworów neuroendokrynnych, mogą być również stosowane do leczenia, zapobiegania lub diagnozowania nowotworów pseudoneuroendokrynnych (pNET), które genotypowo lub fenotypowo naśladują, przypo minają lub wykazują cechy wspólne z kanonicznymi nowotworami neuroendokrynnymi. Nowotworami rzekomo neurokrynnymi lub nowotworami o cechach neuroendokrynnych są nowotwory, które powstają z komórek rozproszonego układu ne uroendo krynnego lub z komórek, w których kaskada różnicowania neuroendokrynowego została nieprawidłowo reaktywowana podczas procesu onkogennego . Takie pNET zazwyczaj dzielą pewne charakterystyczne cechy fenotypowe lub biochemiczne z tradycyjnie określonymi nowotworami neuroendokrynnymi, w tym zdolność do wytwarzania podgrup biologicznie aktywnych amin, neuroprzekaźników i hormonów peptydowych. Histologicznie takie nowotwory (NET i pNET) mają wspólny wygląd, często wykazując gęsto połączone małe komórki z minimalną cytoplazmą o łagodnej cytopatologii i okrągłymi lub owalnymi jądrami. Dla celów niniejszego wynalazku powszechnie wyrażane markery histologiczne lub markery genetyczne, które mogą być stosowane do definiowania nowotworów neuroendokrynnych i rzekomo neurokrynnych obejmują, ale nie wyłącznie, chromograninę A, CD56, synaptofizynę, PGP9.5, ASCL1 i enolazę specyficzną wobec neuronu (NSE).

[0479] Zgodnie z tym, modulatory według niniejszego ujawnienia mogą być korzystnie stosowane do leczenia zarówno nowotworów rzekomo neuroendokrynnych, jak i kanonicznych nowotworów neuroendokrynnych. W związku z tym modulatory można stosować w sposób opisany w niniejszym dokumencie do leczenia nowotworów neuroendokrynnych (zarówno NET, jak i pNET) powstających w nerkach, przewodzie moczowo-płciowym (pęcherzu, gruczole krokowym, jajniku, szyjce macicy i endometrium), przewodzie pokarmowym (jelicie grubym, żołądku), tarczycy (rak rdzeniasty tarczycy) i płucu (drobnoko mórkowy rak płuc i neuroendokrynny wielkoko mórkowy rak płuc). Ponadto, modulatory według niniejszego ujawnienia mogą być stosowane do leczenia nowotworów wyrażających jeden lub więcej markerów wybranych z grupy składającej się z NSE, CD56, synaptofizyny, chromograniny A, ASCL1 i PGP9.5 (UCHL1). Oznacza to, że niniejsze ujawnienie może być stosowane do leczenia osobnika cierpiącego na nowotwór, który jest NSB⁺, lub CD56⁺, lub PGP9.5⁺, lub ASCL1⁺, lub SYP⁺, lub CHGA⁺, lub niektóre ich kombinacje.

[0480] W odniesieniu do nowotworów hematologicznych należy ponadto docenić, że związki i sposoby według niniejszego ujawnienia mogą być szczególnie skuteczne w leczeniu różnych chłoniaków z komórek B, w tym chłoniaka grudkowego (FCC) o niskiej złośliwości/NHL, chłoniaka z komórek płaszcza (MCL), rozlanego chłoniaka wielkokomórkowego (DLL), małego limfocytycznego (SL) NHL, o średniej złośliwości/grudkowego NHL, o średniej złośliwości rozlanego NHL, o wysokiej złośliwości immunoblastycznego NHL, o wysokiej złośliwości limfoblastycznego NHL, drobnoko mórkowego słabo zróżnicowanego NHL o wysokiej złośliwości (ang. high grade small non-cleaved cell NHL), NHL o dużej masie guza (ang. bulky disease NHL), makroglobulinemii Waldenstroma, chłoniaka limfatycznego (LPL), chłoniaka z komórek pła s zcza (MCL), chłoniaka grudkowego (FL), rozlanego chłoniaka wielkokomórkowego (DLCL), chłoniaka Surkitta (BL), chłoniaków związanych z AIDS, chłoniaka z monocytowych komórek B, angioimmunoblastycznej limfadekopatii, drobnej limfocytowej, grudkowej, rozlanej wielkoko mórkowej, rozlanej drobnoko mórkowej słabo zróżnicowanej, wielko ko mó rkowej immunoblastycznej limfoblastoma, drobnego, słabo zróżnicowanego, Burkitta i nie-Burkitta, grudkowego, głównie wielkokomórkowego; grudkowego, głównie drobnoko mórkowego słabo zróżnicowanego; i grudkowego; mieszanych, drobnokomórkowych dobrze zróżnicowanych i wielkokomórkowych chłoniaków. Patrz, Gaidono i wsp., "

EP 2 817 338 B1

Lymphomas ", W CANCER: PRINCIPLES &amp; PRACTICE OF ONCOLOGY, tom. 2: 2131-2145 (DeVita i wsp.,

Wydanie 5, wyd., 1997). Dla specjalistów powinno być jasne, że chłoniaki te często mają różne nazwy ze względu na zmieniające się systemy klasyfikacji, a pacjenci z chłoniakami sklasyfikowanymi pod różnymi nazwami mogą również korzystać z kombinowanych schematów terapeutycznych według niniejszego wynalazku.

[0481] Niniejsze ujawnienie dostarca również terapii prewencyjnej lub profilaktycznej osobników, które mają nowotwory łagodne lub przedrakowe. Poza tym, że jest to zaburzenie związane z DLL3 nie uważa się, że jakiekolwiek szczególne rodzaje nowotworów lub zaburzeń proliferacyjnych należy wykluczyć z leczenia z zastosowaniem niniejszego wynalazku. Jednakże rodzaj komórek nowotworowych może być istotny dla zastosowania ujawnienia w kombinacji z drugorzędowymi środkami terapeutycznymi, zwłaszcza środkami chemioterapeutycznymi i ukierunkowanymi środkami przeciwrakowymi.

XII. Wyroby produkcyjne [0482] Dostarczone są również opakowania i zestawy farmaceutyczne zawierające jeden lub więcej pojemników, zawierających jedną lub więcej dawek modulatora DLL3. W pewnych przykładach wykonania dostarcza się dawki jednostkowe, które to dawki jednostkowe zawierają określoną z góry ilość kompozycji zawierającej, na przykład, przeciwciało anty-DLL3, z dodatkiem lub bez jednego lub więcej dodatkowych środków. W innych przykładach wykonania taka dawka jednostkowa jest dostarczana w ampułko-strzykawce jednorazowego użytku do iniekcji. W jeszcze innych przykładach wykonania kompozycja zawarta w dawce jednostkowej może zawierać sól fizjologiczną, sacharozę lub tym podobne; bufor, taki jak fosforan, lub tym podobne; i/lub być sformułowana w stabilnym i skutecznym zakresie pH. Alternatywnie, w pewnych przykładach wykonania kompozycja może być dostarczana jako liofilizowany proszek, który może być rekonstytuowany po dodaniu odpowiedniej cieczy, na przykład, jałowej wody. W pewnych korzystnych przykładach wykonania kompozycja zawiera jedną lub więcej substancji, które hamują agregację białek, w tym, ale nie wyłącznie, sacharozę i argininę. Każda etykieta na pojemniku(-ach) lub związana z nim(i) wskazuje, że załączona kompozycja jest stosowana do diagnozowania lub leczenia wybranego stanu chorobowego.

[0483] Niniejsze ujawnienie dostarcza także zestawów do wytwarzania jednostek podawania pojedynczej dawki lub wielokrotnej dawki modulatora DLL3 i, ewentualnie, jednego lub więcej środków przeciwrakowych. Zestaw zawiera pojemnik i etykietę lub wkładkę do opakowania na lub połączoną z pojemnikiem. Odpowiednie pojemniki obejmują, na przykład, butelki, fiolki, strzykawki, itp. Pojemniki mogą być wytworzone z różnych materiałów, takich jak szkło lub plastik i zawierać farmaceutycznie skuteczną ilość ujawnionych modulatorów w postaci skoniugowanej lub nieskoniugowanej. W innych korzystnych przypadkach pojemnik (-i) zawiera(-ją) sterylny port dostępu (na przykład, pojemnik może być woreczkiem roztworu do dożylnego podawania lub fiolką mającą zatyczkę przebijaną igłą do iniekcji podskórnej). Zestawy takie zazwyczaj zawierają w odpowiednim pojemniku farmaceutycznie dopuszczalną formulację modulatora DLL3 i, ewentualnie, jeden lub większą liczbę środków przeciwrakowych w tych samych lub różnych pojemnikach. Zestawy mogą również zawierać inne farmaceutycznie dopuszczalne formulacje, albo do diagnozowania albo do terapii skojarzonej. Na przykład, oprócz modulatora DLL3 według ujawnienia, takie zestawy mogą zawierać dowolny jeden lub większą liczbę zakresów środków przeciwrakowych, takich jak leki chemioterapeutyczne lub radioterapeutyczne; środki przeciwangiogenne; środki anty-przerzutowe; ukierunkowane środki przeciwrakowe; środki cytotoksyczne; i / lub inne środki przeciwrakowe. Takie zestawy

EP 2 817 338 B1 mogą także dostarczać odpowiednie reagenty do koniugowania modulatora DLL3 z środkiem przeciwrakowym lub środkiem diagnostycznym (np. patrz U.S.P.Nr 7,422,739).

[0484] Bardziej szczegó łowo, zestawy mogą zawierać pojedynczy pojemnik zawierający modulator DLL3, z lub bez dodatkowych składników lub mogą mieć różne pojemniki dla każdego pożądanego środka. Tam, gdzie połączone środki terapeutyczne są dostarczane do koniugacji, pojedynczy roztwór może być wstępnie zmieszany, albo w kombinacji równoważnej molowo albo z jednym składnikiem w nadmiarze w stosunku do innych. Alternatywnie, modulator DLL3 i dowolny ewentualny środek przeciwrakowy w zestawie mogą być utrzymywane osobno w różnych poje mnikach przed podanie m pacjentowi. Zestawy mogą zawierać również drug / trzeci pojemnik do przechowywania sterylnego, farmaceutycznie dopuszczalnego buforu lub innego rozcieńczalnika, takiego jak bakteriostatyczna woda do iniekcji (BWFI), sól fizjologiczna buforowana fosforanem (PBS), roztwór Ringera i roztwór dekstrozy.

[0485] Gdy składniki zestawu są dostarczone w jednym lub więcej ciekłych roztworach, ciekłym roztworem jest korzystnie roztwór wodny, przy czym szczególnie korzystny jest sterylny roztwór wodny. Jednakże składniki zestawu mogą być dostarczane w postaci suchego(-ych) proszku(-ów). Gdy odczynniki lub składniki są dostarczane w postaci suchego proszku, proszek może być odtworzony przez dodanie odpowiedniego rozpuszczalnika. Przewiduje się, że rozpuszczalnik może być również dostarczony w innym pojemniku.

[0486] Jak wskazano pokrótce powyżej zestawy mogą również zawierać środki do podawania przeciwciała i jakichkolwiek ewentualnych składników zwierzęciu lub pacjentowi, np. jedną lub większą liczbę igieł lub strzykawek, a nawet wkraplacz do oka, pipetę lub inne podobne urządzenie, z którego formulacja może być wstrzykiwana lub wprowadzana do zwierzęcia lub nanoszona na chory obszar ciała. Zestawy według niniejszego ujawnienia będą zwykle obejmować środki do umieszczania fiolek lub podobnych i innych składników w zamknięciu w celach handlowych, takie jak, np. pojemniki z tworzywa sztucznego formowanego wtryskowo lub rozdmuchiwanego, w których pożądane fiolki i inne urządzenie są umieszczane i przechowywane. Każda etykieta lub wkładka do opakowania wskazuje, że kompozycja modulatora DLL3 jest stosowana do leczenia raka, na przy kła d drobnoko mórkowego raka płuc.

[0487] W innych korzystnych przypadkach modulatory według niniejszego ujawnienia mogą być stosowane w połączeniu z, lub stanowić wyrób diagnostyczny lub terapeutyczny przydatny w diagnostyce lub leczeniu zaburzeń proliferacyjnych. Na przykład, w korzystnym przypadku, związki i kompozycje według niniejszego ujawnienia mogą być połączone z pewnymi wyrobami diagnostycznymi lub na rzędzia mi, które można stosować do wykrywania, monitorowania, określania ilościowego lub profilowania komórek lub związków markerowych uczestniczących w etiologii lub manifestacji zaburzeń proliferacyjnych. W wybranych przypadkach związki markerowe mogą obejmować NSE, CD56, syna ptofizynę, chromograninę A i PGP9.5. [0488] W szczególnie korzystnych przypadkach wyroby można stosować do wykrywania, monitorowania i / lub ilościowego oznaczania krążących komórek nowotworowych in vivo lub in vitro (patrz, na przykład, WO 2012/0128801).

[0489] W jeszcze innych korzystnych przykładach wykonania i jak omówiono powyżej, krążące komórki nowotworowe mogą obejmować komórki macierzyste raka.

XIII. Reagenty badawcze [0490] Inne korzystne przypadki według ujawnienia wykorzystują także właściwości ujawnionych modulatorów jako narzędzia użytecznego do identyfikowania, monitorowania, izolowania, dzielenia lub

EP 2 817 338 B1 wzbogacania populacji lub subpopulacji komórek inicjujących nowotwór takimi metodami, jak cytometria przepływowa, aktywowane fluorescencyjnie sortowanie komórek (FACS), aktywowane magnetycznie sortowanie komórek (MACS) lub dzielenia za pośrednictwem lasera. Specjaliści w tej dziedzinie docenią, że modulatory mogą być stosowane w kilku kompatybilnych technikach do charakteryzowania i manipulacji TIC, w tym komórek macierzystych raka (np. patrz U.S.S.Nr 12 / 686,359, 12 / 669,136 i 12 / 757,649).

XIV. Różne [0491] Jeśli w niniejszym dokumencie nie określono inaczej, pojęcia naukowe i techniczne stosowane w związku z niniejszym wynalazkiem będą miały znaczenia, które są powszechnie rozumiane przez specjalistów o przeciętnych umiejętnościach w tej dziedzinie. Ponadto, jeśli nie jest to wymagane w kontekście, określenia w liczbie pojedynczej będą obejmować liczbę mnogą, a określenia w liczbie mnogiej będą obejmować liczbę pojedynczą. Bardziej szczegółowo, jak stosuje się w niniejszym opisie i załączonych zastrzeżeniach, formy pojedyncze "a", "an" i "the", jak stosowane w języku angielskim, obejmują odniesienia w liczbie mnogiej, chyba że kontekst wyraźnie wskazuje inaczej. Zatem, na przykład, odniesienie do "białka" obejmuje wiele białek; odniesienie do "komórki" obejmuje mieszaniny komórek, i tym podobne. Ponadto, zakresy podane w opisie i załączonych zastrzeżeniach obejmują zarówno punkty końcowe, jak i wszystkie punkty pomiędzy punktami końcowymi. Zatem, zakres 2,0 do 3,0 obejmuje 2,4, 3,0 i wszystkie punkty w przedziale od 2,0 do 3,0.

[0492] Ogólnie rzecz biorąc, nomenklatura stosowana w powiązaniu z technikami hodowli komórek i tkanek, biologii molekularnej, immunologii, mikrobiologii, genetyki i chemii i hybrydyzacji białek i kwasów nukleinowych jest dobrze znana i powszechnie stosowana w tej dziedzinie. Sposoby i techniki według niniejszego ujawnienia są zazwyczaj przeprowadzane zgodnie z konwencjonalnymi metodami dobrze znanymi w dziedzinie i opisanymi w różnych ogólnych i bardziej szczegółowych odnośnikach, które są cytowane i omawiane w niniejszym opisie, chyba że wskazano inaczej. Patrz np. Abbas i wsp., Cellular and Molecular Immunology, wydanie 6., W.B. Saunders Company (2010); Sambrook J. i Russell D. Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, wydanie trzecie, Cold Press Harbor Press Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (2000); Ausubel i wsp., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, John &amp; Sons, Inc. (2002); Harlow i Lane Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Press Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1998); oraz Coligan i wsp., Short Protocols in Protein Science, Wiley, John &amp; Sons, Inc. (2003). Reakcje enzymatyczne i techniki oczyszczania przeprowadza się zgodnie ze specyfikacjami producenta, takimi jak powszechnie realizowane w dziedzinie lub opisane w niniejszym dokumencie. Nomenklaturę stosowaną w związku z, i procedury laboratoryjne i techniki chemii analitycznej, syntetycznej chemii organicznej i chemii medycznej i farmaceutycznej są opisane w niniejszym dokumencie i powszechnie stosowane w dziedzinie. Ponadto wszelkie nagłówki sekcji stosowane w niniejszym dokume ncie służą jedynie celom organizacyjnym i nie mogą być interpretowane jako ograniczające opisany przedmiot wynalazku.

XV. Odniesienia DLL3 [0493]

Apelqvist A i wsp., (1999). Notch signalli ng controls pancreatic cell differentiation. Nature. 400:87781. PMID: 10476967.

Bigas A i Espinosa L (2012). Hematopoietic stem cells: to be or Notch to be. Blood. 2012 PMID: 22308291.

EP 2 817 338 B1

Cabrera CV (1990). Lateral inhibition and cell fate during neurogenesis in Drosophila: the interactions between seute. Notch and Delta. Development. 110:733-42 . PMID: 1709404.

Chapman G i wsp., (2011). Notch inhibition by the ligand DELTA-LIKE 3 defines the mechanism of abnormal vertebral segmentation in spondylocostal dysostosis. Hum Mol Genet. 20:905-16. PMID:

21147753.

Chen H i wsp., (1997). Conservation of the Drosophila lateral inhibition pathway in human lung cancer: a hairy-related protein (HES-1) directly represses achaete-scute homolog-1 expression. Froc Natl Acad Sci U S A. 94:5355-60. PMID: 9144241.

Cook M i wsp., (2010). Notch in the development of thyroid C-cells and the treatment of medullary thyroid cancer. Am J Transl Res. 2:119-25. PMID: 20182588.

de la Pompa JL i wsp., (1997). Conservation of the Notch signaling pathway in mammalian neurogenesis. Development. 124:1139-48. PMID: 9102301.

D'Souza B i wsp., (2010). Canonical and non-canonical Notch ligands. Curr Top Dev Biol. 92:73129. PMID: 20816393.

Dunwoodie SL (2009). The role of Notch in patterning the human vertebral column. Curr Opin Genet

Dev. 19:329-37. PMID:19608404.

Dutta S i wsp., (2008). Notch signaling regulates endocrine cell specification in the zebrafish anterior pituitary. Dev Biol, 319:248-57. PubMed PMID: 18534570.

Fre S i wsp., (2005). Notch signals control the fate of Immature progenitor cells in the intestine. Nature. 435:964-8. PMID: 15959516.

Fre S i wsp., (2009). Notch and Wnt signals cooperatively control cell proliferation and tumorigenesis in the intestine. Proc Natl Acad Sci U S A. 106:6309-14. PMID: 19251639.

Galluzzo P, i Bocchetta M (2011). Notch signaling in lung cancer. Expert Rev Anticancer Ther. 11:533-40. PMID: 21504320.

Geffers I i wsp., (2007). Divergent functions and distinct localization of the Notch ligands DLL1 and DILL3 in vivo. J Cell Biol. 178:465-76. PMID: 17664336.

Glittenberg M, i wsp., (2006). Role of conserved intracellular motifs in Serrate signalling, cisinhibition and endocytosis. EMBO J. 25:4697-706. PMID: 17006545.

Goldbeter A, i Pourquie O (2008). Modeling the segmentation clock as a network of coupled oscillations in the Notch, Wnt and FGF signaling pathways. J Theor Biol. 252:574 -85. PMID: 18308339.

Habener JF i wsp., (2005). Minireview: transcriptional regulation in pancreatic development. Endocrinology. 146:1025-34. PMID: 15604203.

Harris PJ i wsp., (2012). Targeting embryonic signaling pathways in cancer therapy. Expert Opin Ther Targets. PMID: 22239436.

Henke RM i wsp., (2009). Ascl1 and Neurog2 form novel complexes and regulate Delta-like3 (DLL3) expression in the neural tube. Dev Biol 328:529-40. PMID: 19389376.

Hoyne GF, i wsp., (2011). A cell autonomous role for the Notch ligand Delta-like 3 in αβ T-cell development. Immunol Cell Biol. 89:696-705. PMID: 21151194.

Huber K i wsp., (2002). Development of chromaffin cells depends on MASH1 function. Development.

129:4729-38. PMID: 12361965.

EP 2 817 338 B1

Ito T i wsp., (2000). Basic helix-loop-helix transcription factors regulate the neuroendocrine differentiation of fetal mouse pulmonary epithelium. Development. 127:3913-21. PMID: 10952889.

Jensen J i wsp., (2000). Control of endodermal endocrine development by Hes-1. Nat Genet. 24:3644. PMID: 10615124.

Kageyama R, i wsp., (2007). Oscillator mechanism of Notch pathway in the segmentation clock. Dev Dyn. 236:1403-9. PMID:17366573.

Kameda Y i wsp., (2007). Mash1 regulates the development of C cells in mouse thyroid glands. Dev Dyn. 236:262-70. PMID: 17103415.

Klein T, i wsp., (1997). An intrinsic dominant negative activity of serrate that is modulated during wing development in Drosophila. Dev Biol. 189:123-34. PMID: 9281342.

Klimstra DS, i wsp., (2010). The pathologic classification of neuroendocrine tumors: a review of nomenclature, grading, and staging systems. Pancreas. 39:707-12. PMID: 20664470.

Kloppel G. (2011). Classification and pathology of gastroenteropancreatic neuroendocrine neoplasms. Endocr Reiat Cancer. 18 Suppl 1:S1 -16 . PMID: 22005112.

Koch U i Radtke F (2010). Notch signaling in solid tumors. Curr Top Dev Biol. 92:411-55. PMID:

20816403.

Kusumi K i wsp., (1998). The mouse pudgy mutation disrupts Delta homologue DLL3 and initiation of early somite boundaries. Nat Genet. 19:274-8. PMID: 9662403.

Ladi E i wsp., (2005). The divergent DSL ligand DLL3 does not activate Notch signaling but cell autonomously attenuates signaling induced by other DSL ligands. J Cell Biol. 170:983-92.

PMID:16144902.

Liu J i wsp., (2010). Notch signaling in the regulation of stem cell self-renewal and differentiation. Curr Top Dev Biol. 92:367-409. PMID: 20816402.

Nagase H i wsp., (2011). γ-Secretase-regulated signaling pathways, such as notch signaling, mediate the differentiation of hematapoietic stem cells, development of the immune system, and peripheral immune responses. Curr Stem Cell Res Ther. 6:131-41. PMID: 21190540.

Raetzman LT i wsp., (2004). Developmental regulation of Notch signaling genes in the embryonic pituitary: Prop1 deficiency affects Notch2 expression. Dev Biol. 265:329-40. PMID: 14732396.

Rebay I, i wsp., (1991). Specific EGF repeats of Notch mediate interactions with Delta and Serrate: implications for Notch as a multifunctional receptor. Cell. 67:687-99. PMID: 1657403.

Sakamoto K i wsp., (2002). Intracellular cell-autonomous association of Notch and its ligands: a novel mechanism of Notch signal modification. Dev Biol. 241:313-26. PMID: 11784114.

Schonhoff SE i wsp., (2004). Minireview: Development and differentiation of gut endocrine cells. Endocrinology. 145:2639-44. PMID: 15044355.

Shimizu K i wsp., (1999). Mouse jagged1 physically interacts with notch2 and other notch receptors. Assessment by quantitative methods. J Biol Chem. 274:32961-9. PMID: 10551863.

Shinkai Y i wsp., (2004). New mutant mouse with skeletal deformities caused by mutation in delta like 3 (DLL3) gene. Exp Anim. 53:129-36. PMID: 15153675.

Schonhoff SE i wsp., (2004). Minireview: Development and differentiation of gut endocrine cells. Endocrinology. 145:2639-44. PMID: 15044355.

Sprinzak D i wsp., (2010). Cis-interactions between Notch and Delta generate mutually exclusive signalling states. Nature. 465:86-90. PMID: 20418862.

EP 2 817 338 B1

Sriuranpong V i wsp., (2002). Notch signaling induces rapid degradation of achaete -scute homolog

1. Mol Cell Biol. 22:3129-39. PMID: 11940670.

Sternberg PW (1988). Lateral inhibition during vulval induction in Caenorhabditis elegans. Nature.

335:551-4. PMID: 3419532.

Wharton KA, i wsp., (1985). Nucleotide sequence from the neurogenic locus notch implies a gene product that shares homology with proteins containing EGF-like repeats. Cell. 43:567-81 . PMID: 3935325.

Yao JC i wsp., (2008). One hundred years after "carcinoid": epidemiology of and prognostic factors for neuroendocrine tumors in 35,825 cases in the United States. J Clin Oncol. 26:3063-72. PMID: 18565894.

Zarebezan B, Chen H (2010). Signaling mechanisms in neuroendocrine tumors as targets for therapy. Endocrinol Metab Clin North Am. 39:801-10. PMID: 21095546.

XVI. Wybane przypadki według ujawnienia [0494] Oprócz ujawnienia i Przykładów w niniejszym dokumencie, niniejsze ujawnienie jest nakierowane na wybrane przypadki konkretnie przedstawione poniżej.

Wybane przypadki:

[0495]

1. Wyizolowany modulator DLL3.

2. Wyizolowany modulator DLL3 według 1, który to modulator DLL3 stanowi antagonistę DLL3,

3. Wyizolowany modulator DLL3 według 1, który to modulator DLL3 stanowi przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment.

4. Wyizolowany modulator DLL3 według 3, przy czym przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment stanowi przeciwciało monoklonalne.

5. Wyizolowany modulator DLL3 według 4, przy czym przeciwciało monoklonalne jest wybrane z grupy składającej się z przeciwciał chimerycznych, przeciwciał humanizowanych i przeciwciał ludzkich.

6. Wyizolowany modulator DLL3 według 4, przy czym przeciwciało monoklonalne stanowi przeciwciało neutralizujące.

7. Wyizolowany modulator DLL3 według 4, przy czym przeciwciało monoklonalne stanowi przeciwciało zubożające.

8. Wyizolowany modulator DLL3 według 4, przy czym przeciwciało monoklonalne stanowi przeciwciało internalizujące.

9. Wyizolowany modulator DLL3 według 8, przy czym przeciwciało monoklonalne stanowi ponadto środek cytotoksyczny.

10. Wyizolowany modulator DLL3 według 4, przy czym przeciwciało monoklonalne zawiera region zmienny łańcucha lekkiego mający trzy regiony determinujące komplementarność i region zmienny łańcucha ciężkiego mający trzy regiony determinujące komple mentarność, przy czym regiony determinujące komple mentarność łańcucha ciężkiego i lekkiego obejmują co najmniej jeden region determinujący komple mentarność przedstawiony na FIG. 11A i FIG. 11B.

11. Wyizolowany modulator DLL3 według 4 przy czym przeciwciało monoklonalne zawiera region zmienny łańcucha lekkiego i region zmienny łańcucha ciężkiego, który to region zmienny łańcucha lekkiego zawiera sekwencję mającą co najmniej 60% identyczności z sekwencją aminokwasową

EP 2 817 338 B1 wybraną z grupy składającej się z sekwencji aminokwasowych jak przedstawione w SEKW. NR ID: 20,

SEKW. NR ID: 22, SEKW. NR ID: 24, SEKW. NR ID: 26, SEKW. NR ID: 28, SEKW. NR ID: 30, SEKW. NR ID: 32, SEKW. NR ID: 34, SEKW. NR ID: 36, SEKW. NR ID: 38, SEKW. NR ID: 40, SEKW. NR ID: 42, SEKW. NR ID: 44, SEKW. NR ID: 46, SEKW. NR ID: 48, SEKW. NR ID: 50, SEKW. NR ID: 52, SEKW. NR ID: 54, SEKW. NR ID: 56, SEKW. NR ID: 58, SEKW. NR ID: 60, SEKW. NR ID: 62, SEKW. NR ID: 64, SEKW. NR ID: 66, SEKW. NR ID: 68, SEKW. NR ID: 70, SEKW. NR ID: 72, SEKW. NR ID: 74, SEKW. NR ID: 76, SEKW. NR ID: 78 SEKW. NR ID: 80, SEKW. NR ID: 82, SEKW. NR ID: 84, SEKW. NR ID: 86, SEKW. NR ID: 88, SEKW. NR ID: 90, SEKW. NR ID: 92, SEKW. NR ID: 94, SEKW. NR ID: 96, SEKW. NR ID: 98, SEKW. NR ID: 100, SEKW. NR ID: 102, SEKW. NR ID: 104, SEKW. NR ID: 106, SEKW. NR ID: 108, SEKW. NR ID: 110, SEKW. NR ID: 112, SEKW. NR ID: 114, SEKW. NR ID: 116, SEKW. NR ID: 118, SEKW. NR ID: 120, SEKW. NR ID: 122, SEKW. NR ID: 124, SEKW. NR ID: 126, SEKW. NR ID: 128, SEKW. NR ID: 130, SEKW. NR ID: 132, SEKW. NR ID:134, SEKW. NR ID: 136, SEKW. NR ID: 138, SEKW. NR ID: 140, SEKW. NR ID: 142, SEKW. NR ID: 144, SEKW. NR ID:

146, SEKW. NR ID: 148, SEKW. NR ID: 150, SEKW. NR ID: 152, SEKW. NR ID: 154, SEKW. NR ID:

156, SEKW. NR ID:158, SEKW. NR ID: 160, SEKW. NR ID: 162 SEKW. NR ID: 164, SEKW. NR ID: 166, SEKW. NR ID: 168, SEKW. NR ID: 170, SEKW. NR ID: 172. SEKW. NR ID: 174, SEKW. NR ID:

176, SEKW. NR ID: 178, SEKW. NR ID: 180, SEKW. NR ID: 182, SEKW. NR ID:184, SEKW. NR ID:

186, SEKW. NR ID: 188, SEKW. NR ID: 190, SEKW. NR ID: 192, SEKW. NR ID: 194, SEKW. NR ID:

196, SEKW. NR ID: 198, SEKW. NR ID: 200 and SEKW. NR ID: 202 i przy czym region zmienny łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 60% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji aminokwasowych jak przedstawione w SEKW. NR ID: 21, SEKW. NR ID: 23, SEKW. NR ID: 25, SEKW. NR ID: 27, SEKW. NR ID: 29, SEKW. NR ID: 31, SEKW. NR ID: 33, SEKW. NR ID: 35, SEKW. NR ID: 37, SEKW. NR ID: 39, SEKW. NR ID: 41, SEKW. NR ID: 43, SEKW. NR ID: 45, SEKW. NR ID: 47, SEKW. NR ID: 49, SEKW. NR ID: 51, SEKW. NR ID: 53, SEKW. NR ID: 55, SEKW. NR ID: 57, SEKW. NR ID: 59, SEKW. NR ID: 61, SEKW. NR ID: 63, SEKW. NR ID: 65, SEKW. NR ID: 67, SEKW. NR ID: 69, SEKW. NR ID: 71, SEKW. NR ID: 73, SEKW. NR ID: 75, SEKW. NR ID: 77, SEKW. NR ID: 79, SEKW. NR ID: 81. SEKW. NR ID: 83, SEKW. NR ID: 85, SEKW. NR ID: 87, SEKW. NR ID: 89, SEKW. NR ID: 91, SEKW. NR ID: 93, SEKW. NR ID: 95, SEKW. NR ID: 97, SEKW. NR ID: 99, SEKW. NR ID: 101, SEKW. NR ID: 103, SEKW. NR ID: 105, SEKW. NR ID:107, SEKW. NR ID: 109, SEKW. NR ID: 111, SEKW. NR ID:1 113, SEKW. NR ID: 115, SEKW. NR ID: 117, SEKW. NR ID: 119, SEKW. NR ID: 121, SEKW. NR ID:

123, SEKW. NR ID: 125, SEKW. NR ID: 127, SEKW. NR ID: 129, SEKW. NR ID: 131, SEKW. NR ID:

133, SEKW. NR ID: 135, SEKW. NR ID: 137, SEKW. NR ID: 139, SEKW. NR ID: 141, SEKW. NR ID:

143, SEKW. NR ID: 145, SEKW. NR ID: 147, SEKW. NR ID: 149, SEKW. NR ID: 151, SEKW. NR ID:

153, SEKW. NR ID: 155, SEKW. NR ID: 157, SEKW. NR ID: 159, SEKW. NR ID: 161, SEKW. NR ID:

163, SEKW. NR ID: 165, SEKW. NR ID:1 167, SEKW. NR ID: 169, SEKW. NR ID: 171, SEKW. NR ID: 173, SEKW. NR ID: 175, SEKW. NR ID: 177, SEKW. NR ID: 179, SEKW. NR ID: 181, SEKW. NR ID: 183, SEKW. NR ID: 185, SEKW. NR ID: 187, SEKW. NR ID: 189, SEKW. NR ID:191, SEKW. NR ID: 193, SEKW. NR ID:195, SEKW. NR ID:197, SEKW. NR ID:199, SEKW. NR ID: 201 i SEKW. NR ID: 203.

12. Wyizolowany modulator DLL3 zawierający CDR z dowolnego z regionów zmiennych łańcucha ciężkiego lub lekkiego przedstawionych według 11.

EP 2 817 338 B1

13. Wyizolowany modulator DLL3 zawierający przeciwciało konkurujące, które to przeciwciało konkurujące hamuje wiązanie wyizolowanego modulatora DLL3 według 10 lub 11 do DLL3 o co najmniej

40%.

14. Kwas nukleinowy kodujący aminokwasowy region zmienny łańcucha ciężkiego lub aminokwasowy region zmienny łańcucha lekkiego według 11.

15. Wektor zawierający kwas nukleinowy według 14.

16. Wyizolowany modulator DLL3 według 1 zawierający sekwencję aminokwasową jak przedstawiona w SEKW. NR ID: 3 lub jej fragment.

17. Wyizolowany modulator DLL3 według 16, przy czym modulator DLL3 zawiera ponadto co najmniej część regionu stałego immunoglobuliny.

18. Wyizolowany modulator DLL3 według 1, przy czym wspomniany modulator zmniejsza częstość występowania komórek inicjujących nowotwór po podaniu osobnikowi, który tego potrzebuje.

19. Wyizolowany modulator DLL3 według 18, przy czym zmniejszenie częstości występowania jest określane z zastosowaniem analizy cytometrii przepływowej markerów powierzchniowych komórki nowotworowej, o których wiadomo, że wzbogacają komórki inicjujące nowotwór.

20. Wyizolowany modulator DLL3 według 18, przy czym zmniejszenie częstości występowania jest określane z zastosowaniem detekcji immunohistochemicznej markerów powierzchniowych komórki nowotworowej, o których wiadomo, że wzbogacają komórki inicjujące nowotwór.

21. Wyizolowany modulator DLL3 według 18, przy czym wspomniane komórki inicjujące nowotwór stanowią komórki unieśmiertelniające nowotwór. .

22. Wyizolowany modulator DLL3 według 1 ponadto obejmuje środek cytotoksyczny.

23. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca wyizolowany modulator DLL3 według 1.

24. Kompozycja farmaceutyczna według 23, w której wyizolowany modulator DLL3 stanowi przeciwciało monoklonalne.

25. Kompozycja farmaceutyczna według 24, w której przeciwciało monoklonalne stanowi humanizowane przeciwciało .

26. Kompozycja farmaceutyczna według 25, w której wspomniane humanizowane przeciwciało obejmuje środek cytotoksyczny.

27. Kompozycja farmaceutyczna według 26, w której wspomniany środek cytotoksyczny stanowi pirolobenzodiazepinę.

28. Sposób leczenia zaburzenia związanego z DLL3 obejmujący podawanie terapeutycznie skutecznej ilości modulatora DLL3 osobnikowi, który tego potrzebuje.

29. Sposób według 28, w którym DLL3 modulator stanowi antagonistę DLL3.

30. Sposób według 28, w którym wspomniany modulator DLL3 stanowi przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment.

31. Sposób według 30, w którym przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment stanowi przeciwciało monoklonalne.

32. Sposób według 31, w którym przeciwciało monoklonalne jest wybrane z grupy składającej się z chimerycznych przeciwciał, humanizowanych przeciwciał i ludzkich przeciwciał.

33. Sposób według 32, w którym wspomniane przeciwciała monoklonalne zawierają region zmienny łańcucha lekkiego i region zmienny łańcucha ciężkiego, przy czym region zmienny łańcucha lekkiego obejmuje sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 60% identyczności z sekwencją aminokwasową

100

EP 2 817 338 B1 wybraną z grupy składającej się z sekwencji aminokwasowych przedstawionych w SEKW. NR ID: 20, SEKW. NR ID: 22, SEKW. NR ID: 24, SEKW. NR ID: 26, SEKW. NR ID: 28, SEKW. NR ID: 30, SEKW. NR ID: 32, SEKW. NR ID: 34, SEKW. NR ID: 36, SEKW. NR ID: 38, SEKW. NR ID: 40, SEKW. NR ID: 42, SEKW. NR ID: 44, SEKW. NR ID: 46, SEKW. NR ID: 48, SEKW. NR ID: 50, SEKW. NR ID: 52, SEKW. NR ID: 54, SEKW. NR ID: 56, SEKW. NR ID: 58, SEKW. NR ID: 60, SEKW. NR ID: 62, SEKW. NR ID: 64, SEKW. NR ID: 66, SEKW. NR ID: 68, SEKW. NR ID: 70, SEKW. NR ID: 72, SEKW. NR ID: 74, SEKW. NR ID: 76, SEKW. NR ID: 78 SEKW. NR ID: 80, SEKW. NR ID: 82, SEKW. NR ID: 84, SEKW. NR ID: 86, SEKW. NR ID: 88, SEKW. NR ID: 90, SEKW. NR ID: 92, SEKW. NR ID: 94, SEKW. NR ID: 96, SEKW. NR ID: 98, SEKW. NR ID: 100, SEKW. NR ID: 102, SEKW. NR ID: 104, SEKW. NR ID: 106, SEKW. NR ID: 108, SEKW. NR ID: 110, SEKW. NR ID: 112, SEKW. NR ID: 114, SEKW. NR ID: 116, SEKW. NR ID: 118, SEKW. NR ID: 120, SEKW. NR ID: 122, SEKW. NR ID: 124, SEKW. NR ID:

126, SEKW. NR ID: 128, SEKW. NR ID: 130, SEKW. NR ID: 132, SEKW. NR ID: 134, SEKW. NR ID:

136, SEKW. NR ID: 138, SEKW. NR ID: 140, SEKW. NR ID: 142, SEKW. NR ID: 144, SEKW. NR ID:

146, SEKW. NR ID: 148, SEKW. NR ID: 150, SEKW. NR ID: 152, SEKW. NR ID:154, SEKW. NR ID: 156, SEKW. NR ID: 158, SEKW. NR ID: 160, SEKW. NR ID: 162 SEKW. NR ID: 164, SEKW. NR ID:

166, SEKW. NR ID: 168, SEKW. NR ID: 170, SEKW. NR ID: 172, SEKW. NR ID: 174, SEKW. NR ID:

176, SEKW. NR ID: 178, SEKW. NR ID: 180, SEKW. NR ID: 182, SEKW. NR ID: 184, SEKW. NR ID:

186, SEKW. NR ID: 188, SEKW. NR ID: 190, SEKW. NR ID: 192, SEKW. NR ID: 194, SEKW. NR ID:

196, SEKW. NR ID: 198, SEKW. NR ID: 200 i SEKW. NR ID: 202 i gdzie wspomniany region zmienny łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 60% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji aminokwasowych jak przedstawione w SEKW. NR ID: 21, SEKW. NR ID: 23, SEKW. NR ID: 25, SEKW. NR ID: 27, SEKW. NR ID: 29, SEKW. NR ID: 31, SEKW. NR ID: 33, SEKW. NR ID: 35, SEKW. NR ID: 37, SEKW. NR ID: 39, SEKW. NR ID: 41, SEKW. NR ID: 43, SEKW. NR ID: 45, SEKW. NR ID: 47, SEKW. NR ID: 49, SEKW. NR ID: 51, SEKW. NR ID: 53, SEKW. NR ID: 55, SEKW. NR ID: 57, SEKW. NR ID: 59, SEKW. NR ID: 61, SEKW. NR ID: 63, SEKW. NR ID: 65, SEKW. NR ID: 67, SEKW. NR ID: 69, SEKW. NR ID: 71, SEKW. NR ID: 73, SEKW. NR ID: 75, SEKW. NR ID: 77, SEKW. NR ID: 79, SEKW. NR ID: 81, SEKW. NR ID: 83, SEKW. NR ID: 85, SEKW. NR ID: 87, SEKW. NR ID: 89, SEKW. NR ID: 91, SEKW. NR ID: 93, SEKW. NR ID: 95, SEKW. NR ID: 97, SEKW. NR ID: 99, SEKW. NR ID: 101, SEKW. NR ID: 103, SEKW. NR ID; 105, SEKW. NR ID: 107, SEKW. NR ID: 109, SEKW. NR ID: 111, SEKW. NR ID: 113, SEKW. NR ID: 115, SEKW. NR ID: 117, SEKW. NR ID: 119, SEKW. NR ID: 121, SEKW. NR ID: 123, SEKW. NR ID: 125, SEKW. NR ID: 127, SEKW. NR ID: 129, SEKW. NR ID:131, SEKW. NR ID:133, SEKW. NR ID: 135, SEKW. NR ID: 137, SEKW. NR ID: 139, SEKW. NR ID: 141, SEKW. NR ID: 143, SEKW. NR ID: 145, SEKW. NR ID: 147, SEKW. NR ID: 149, SEKW. NR ID: 151, SEKW. NR ID:

153, SEKW. NR ID: 155, SEKW. NR ID: 157, SEKW. NR ID: 159, SEKW. NR ID: 161, SEKW. NR ID:

163, SEKW. NR ID: 165, SEKW. NR ID: 167, SEKW. NR ID: 169, SEKW. NR ID: 171, SEKW. NR ID:

173, SEKW. NR ID: 175, SEKW. NR ID: 177, SEKW. NR ID: 179, SEKW. NR ID: 181, SEKW. NR ID:

183, SEKW. NR ID: 185, SEKW. NR ID: 187, SEKW. NR ID: 189, SEKW. NR ID: 191, SEKW. NR ID:

193, SEKW. NR ID: 195, SEKW. NR ID: 197, SEKW. NR ID: 199, SEKW. NR ID: 201 i SEKW. NR ID: 203.

34. Sposób według 33, w którym przeciwciało monoklonalne jest humanizowanym przeciwciałem.

35. Sposób według 31, w którym przeciwciało monoklonalne stanowi przeciwciało neutralizujące.

101

EP 2 817 338 B1

36. Sposób według 31, w którym przeciwciało monoklonalne stanowi przeciwciało internalizujące.

37. Sposób według 36, w którym wspomniane przeciwciało internalizujące obejmuje środek cytotoksyczny.

38. Sposób według 37, w którym wspomniany środek cytotoksyczny stanowi pirolobenzodiazepinę.

39. Sposób według 38, w którym wspomniane zaburzenie związane z DLL3 stanowi zaburzenie nowotworowe.

40. Sposób według 39, w którym wspomniane zaburzenie nowotworowe obejmuje nowotwór wykazujący cechy neuroendokrynne.

41. Sposób według 40, w którym wspomniany nowotwór wykazujący cechy neuroendokrynne stanowi nowotwór neuroendokrynny.

42. Sposób według 39, w którym wspomniane zaburzenie nowotworowe obejmuje nowotwór hematologiczny.

43. Sposób według 42, w którym wspomniany nowotwór hematologiczny obejmuje białaczkę lub chłoniaka.

44. Sposób według 39, w którym osobnik cierpiący na wspomniane zaburzenie nowotworowe wykazuje nowotwory zawierające komórki inicjujące nowotwór.

45. Sposób według 44 zawierajacy ponadto etap zmniejszania częstości występowania komórek inicjujących nowotwór u wspomnianego osobnika.

46. Sposób według 45, w którym zmniejszenie częstości występowania określa się z zastosowaniem analizy cytometrii przepływowej markerów powierzni komórek nowotworowych, o których wiadomo, że wzbogacają komórki inicjujące nowotwór lub detekcji immunohistochemicznej markerów powierzchni komórek nowotworowych, o których wiadomo, że wzbogacają komórki inicjujące nowotwór.

47. Sposób według 45, w którym zmniejszenie częstości występowania określa się z zastosowaniem analizy ograniczających rozcieńczeń in vitro lub in vivo .

48. Sposób według 47, w którym zmniejszenie częstości występowania określane z zastosowaniem analizy ograniczających rozcieńczeń in vivo obejmuje przeszczep żywych ludzkich komórek nowotworowych myszom o obniżonej odporności.

49. Sposób według 48 w którym zmniejszenie częstości występowania określane z zastosowaniem analizy ograniczających rozcieńczeń in vivo obejmuje kwantyfikację częstości występowania komórek inicjujących nowotwór z zastosowaniem statystyki rozkładu Poissona.

50. Sposób według 47, w którym zmniejszenie częstości występowania określane z zastosowaniem analizy ograniczających rozcieńczeń in vitro obejmuje zdeponowanie w ograniczonych rozcieńczeniach żywych ludzkich komórek nowotworowych w warunkach podtrzymujących kolonie in vitro.

51. Sposób według 50, w którym zmniejszenie częstości występowania określane z zastosowaniem analizy ograniczonych rozcieńczeń in vitro obejmuje kwantyfikację częstości występowania komórek inicjujących nowotwór z zastosowaniem statystyki rozkładu Poissona.

52. Sposób według 28 obejmujący ponadto etap podawania środka przeciwrakowego.

53. Sposób według 28, w którym wspomniany modulator DLL3 zawiera jeden lub więcej CDR z dowolnej spośród SEKW. NR ID: 20 do 203.

54. Sposób według 28, w którym wspomniany modulator DDL3 stanowi modulator pan-DLL.

55. Sposób zmniejszania częstości występowania komórek inicjujących nowotwór u osobnika, który tego potrzebuje obejmujący etap podawania temu osobnikowi modulatora DDL3.

102

EP 2 817 338 B1

56. Sposób według 55, w którym komórki inicjujące nowotwór obejmują komórki unieśmiertelniające nowotwór.

57. Sposób według 56, w którym wspomnianymi komórkami unieśmiertelniającymi nowotwór są komórki CD324⁺ lub CD46⁺ .

58. Sposób według 55, w którym wspomniany modulator DLL3 stanowi przeciwciało.

59. Sposób według 58, w którym wspomniane przeciwciało stanowi przeciwciało monoklonalne.

60. Sposób według 59, w którym przeciwciało monoklonalne obejmuje ponadto środek cytotoksyczny.

61. Sposób według 55, w którym osobnik cierpi na zaburzenie nowotworowe wybrane z grupy składającej się z raka nadnerczy, raka pęcherza moczowego, raka szyjki macicy, raka endometrium, raka nerki, raka wątroby, raka płuca, raka jajnika, raka trzustki, raka gruczołu krokowego i raka sutka.

62. Sposób według 55, w którym częstość występowania komórek inicjujących nowotwór jest zmniejszona o co najmniej 10%.

63. Sposób według 55, w którym zmniejszenie częstości występowania określane jest z zastosowaniem analizy cytometrii przepływowej markerów powierzchni komórki nowotworowej, o których wiadomo, że wzbogacają komórki inicjujące nowotwór lub detekcji immunohistochemicznej markerów powierzchni komórki nowotworowej, o których wiadomo, że wzbogacają komórki inicjujące nowotwór.

64. Sposób leczenia osobnika cierpiącego na nowotwór hematologiczny obejmujący etap podawania temu osobnikowi modulatora DLL3.

65. Sposób według 64, w którym wspomniany modulator DLL3 stanowi przeciwciało monoklonalne.

66. Sposób uczulania nowotworu u osobnika do leczenia środkiem przeciwrakowym obejmujący etap podawania temu osobnikowi modulatora DLL3.

67. Sposób według 66, w którym wspomniany modulator DLL3 stanowi przeciwciało.

68. Sposób według 66, w którym wspomnianym nowotworem jest guz lity.

69. Sposób według 66, w którym wspomniany środek przeciwrakowy stanowi środek chemioterapeutyczny.

70. Sposób według 66, w którym wspomniany środek przeciwrakowy stanowi środek immunoterapeutyczny.

71. Sposób diagnozowania zaburze nia proliferacyjnego u osobnika, który tego potrzebuje, obejmujący etapy:

a. otrzymywania od wspomnianego osobnika próbki tkanki;

b. kontaktowania próbki tkanki z co najmniej jednym modulatorem DLL3; i

c. wykrywania lub kwantyfikacji modulatora DLL3 związanego z próbką.

72. Sposób według 71, w którym modulator DLL3 stanowi przeciwciało monoklonalne.

73. Sposób według 72, w którym przeciwciało jest funkcjonalnie powiązane z reporterem.

74. Wyrób fabryczny użyteczny do diagnozowania lub leczenia zaburze ń związanych z DLL3 zawierający pojemnik zawierający modulator DLL3 i materiały instruktażowe do stosowania wspomnianego modulatora DLL3 do leczenia lub diagnozowania zaburze nia związanego z DLL3.

75. Wyrób fabryczny według 74, w którym wspomnianym modulatorem DLL3 jest przeciwciało monoklonalne.

76. Wyrób fabryczny według 74, w którym pojemnik zawiera możliwą do odczytania płytę.

77. Sposób leczenia pacjenta cierpiącego na zaburzenie nowotworowe obejmujący etap podawania terapeutycznie skutecznej ilości co najmniej jednego internalizującego modulatora DLL3.

103

EP 2 817 338 B1

78. Sposób według 77, w którym modulator DLL3 stanowi przeciwciało.

79. Sposób według 78, w którym wspomniane przeciwciało stanowi przeciwciało monoklonalne.

80. Sposób według 79, w którym przeciwciało monoklonalne obejmuja ponadto środek cytotoksyczny.

81. Sposób według 80 obejmujący ponadto etap podawania środka przeciwrakowego.

82. Sposób leczenia osobnika cierpiącego na zaburzenie nowotworowe obejmujący etap podawania terapeutycznie skutecznej ilości co najmniej jednego ne utralizującego modulatora DLL3.

83. Sposób według 82, w którym wspomniany modulator DLL3 stanowi przeciwciało.

84. Sposób według 83, w którym wspomniane przeciwciało stanowi przeciwciało monoklonalne.

85. Sposób według 84, w którym przeciwciało monoklonalne stanowi przeciwciało humanizowane.

86. Sposób według 85, w którym wspomniane przeciwciało humanizowane obejmuje ponadto środek cytotoksyczny. .

87. Sposób według 82, w którym zaburzenie nowotworowe stanowi nowotwór wykazujący cechy neuroendokrynne.

88. Sposób identyfikowania, izolowania, dzielenia na sekcje lub wzbogacania populacji komórek inicjujących nowotwór obejmujący etap kontaktowania komórek inicjujących nowotwór z modulatorem

DLL3.

89. Sposób według 88, w którym wspomniany modulator DLL3 stanowi przeciwciało.

90. Modulator DLL3 stanowiący przeciwciało humanizowane, które to humanizowane przeciwciało zawiera region zmienny łańcucha lekkiego i region zmienny łańcucha ciężkiego, przy czym wspomniany region zmienny łańcucha lekkiego zawiera sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 60% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji aminokwasowych jak przedstawione w SEKW. NR ID: 204, SEKW. NR ID: 206, SEKW. NR ID: 208, SEKW. NR ID: 210 i SEKW. NR ID: 212 i przy czyme wspomniany region zmienny łańcucha ciężkiego zawiera sekwencję aminokwasową mającą co najmniej 60% identyczności z sekwencją aminokwasową wybraną z grupy składającej się z sekwencji aminokwasowych jak przedstawione w SEKW. NR ID: 205, SEKW. NR ID: 207, SEKW. NR ID: 209, SEKW. NR ID: 211 i SEKW. NR ID: 213.

91. Sposób hamowania lub zapobiegania przerzutom u osobnika, który tego potrzebuje, obejmujący etap podawania farmaceutycznie skutecznej ilości modulatora DLL3.

92. Sposób według 91, w którym osobnik przechodzi procedurę zmniejszania masy guza przed lub po podawaniu modulatora DLL3.

93. Sposób według 92, w którym wspomniana procedura zmniejszania masy guza obejmuje podawanie co najmniej jednego środka przeciwrakowego.

94. Sposób przeprowadzania terapii podtrzymującej u osobnika, który tego potrzebuje, obejmujący etap podawania farmaceutycznie skutecznej ilości modulatora DLL3.

95. Sposób według 94, w którym wspomnianego osobnika leczono ze względu na zaburzenie nowotworowe przed podaniem modulatora DLL3.

96. Sposób zubożania komórek inicjujących nowotwór u osobnika cierpiącego na zaburzenie proliferacyjne obejmujący etap podawania modulatora DLL3.

97. Sposób diagnozowania, wykrywania i monitorowania zaburzenia związanego z DLL3 in vivo u osobnika, który tego potrzbuje, obejmujący etap podawania modulatora DLL3.

104

EP 2 817 338 B1

98. Sposób diagnozowania, wykrywania i monitorowania zaburzenia związanego z DLL3 u osobnika, który tego potrzbuje, obejmujący etap kontaktowania krążących komórek nowotworowych z modulatorem DLL3.

99. Sposób według 98, w którym wspomnianym etap kontaktowania następuje in vivo.

100. Sposób według 98, w którym etap kontaktowania następuje in vitro.

101. Sposób leczenia nowotworu wykazującego cechy neuroendokrynne u pacjenta, który tego potrzebuje, obejmujący etap podawania terapeutycznie skutecznej ilości modulatora DDL3.

102. Sposób według 101, w którym wspomnianym nowotworem wykazującym cechy neuroendokrynne jest nowotwór neuroendokrynny.

103. Modulator DLL3 pochodzący od przeciwciała wybranego z grupy składającej się z SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35,

SC16.36, SC16.38, SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52,

SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68,

SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103,

SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113,

SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123,

SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134,

SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143,

SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16.150.

104. Wyizolowany modulator DLL3, który wiąże się z epitopem związanym z dome ną EGF1 DLL3.

105. Modulator DLL3 według 104, który to modulator DLL3 stanowi przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment.

106. Modulator DLL3 według 105, przy czym przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment stanowi przeciwciało monoklonalne .

107. Modulator DLL3 według 106, który to modulator DLL3 stanowi ADC.

108. Modulator DLL3 według 107, przy czym ADC obejmuje pirolobenzodiazepinę.

109. Modulator DLL3 według 108 obejmuje ponadto łącznik.

110. Wyizolowany modulator DLL3, który wiąże się z epitopem związanym z dome ną EGF2 DLL3.

111. Modulator DLL3 według 110, przy czym wspomniany modulator DLL3 stanowi przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment.

112. Modulator DLL3 według 111, przy czym wspomniane przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment stanowi przeciwciało monoklonalne.

113. Modulator DLL3 według 112, przy czym wspomniany modulator DLL3 obejmuje ADC.

114. Modulator DLL3 według 113, przy czym wspomniany ADC obejmuje pirolobenzodiazepinę.

115. Modulator DLL3 według 114 obejmujący ponadto łącznik.

116. Wyizolowany modulator DLL3, który wiąże się z epitopem związanym z dome ną EGF3 DLL3.

117. Modulator DLL3 według 116, przy czym wspomniany modulator DLL3 stanowi przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment.

118. Modulator DLL3 według 117, przy czym przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment stanowi przeciwciało monoklonalne .

119. Modulator DLL3 według 118, przy czym wspomniany modulator DLL3 obejmuje ADC.

105

EP 2 817 338 B1

120. Modulator DLL3 według 119, przy czym ADC obejmuje pirolobenzodiazepinę.

121. Modulator DLL3 według 120 obejmuje ponadto łącznik.

122. Wyizolowany modulator DLL3, który wiąże się z epitopem związanym z domeną EGF4 DLL3.

123. Modulator DLL3 według 122, przy czym wspomniany modulator DLL3 stanowi przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment.

124. Modulator DLL3 według 123, przy czym wspomniane przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment stanowi przeciwciało monoklonalne.

125. Modulator DLL3 według 124, przy czym wspomniany modulator DLL3 stanowi ADC.

126. Modulator DLL3 według 125, przy czym wspomniany ADC obejmuje pirolobenzodiazepinę.

127. Modulator DLL3 według 126 obejmujący ponadto łącznik.

128. Wyizolowany modulator DLL3 który wiąże się z epitopem związanym z domeną EGF5 DLL3.

129. Modulator DLL3 według 128, przy czym wspomniany modulator DLL3 stanowi przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment.

130. Modulator DLL3 według 129, przy czym wspomniane przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment stanowi przeciwciało monoklonalne.

131. Modulator DLL3 według 130, przy czym wspomniany modulator DLL3 stanowi ADC.

132. Modulator DLL3 według 131, przy czym wspomniany ADC obejmuje pirolobenzodiazepinę.

133. Modulator DLL3 według 132 obejmujący ponadto łącznik.

134. Wyizolowany modulator DLL3, który wiąże się z epitopem związanym z domeną EGF6 DLL3.

135. Modulator DLL3 według 134, przy czym wspomniany modulator stanowi przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment.

136. Modulator DLL3 według 135, przy czym wspomniane przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment stanowi przeciwciało monoklonalne.

137. Modulator DLL3 według 136, przy czym wspomniany modulator DLL3 stanowi ADC.

138. Modulator DLL3 według 137, przy czym wspomniany ADC obejmuje pirolobenzodiazepinę.

139. Modulator DLL3 według 138 obejmujący ponadto łącznik.

140. Wyizolowany modulator DLL3, który wiąże się z epitopem związanym z domeną DSL z DLL3.

141. Modulator DLL3 według 140, przy czym wspomniany modulator stanowi przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment.

142. Modulator DLL3 według 141, przy czym wspomniane przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment stanowi przeciwciało monoklonalne.

143. Modulator DLL3 według 142, przy czym wspomniany modulator DLL3 stanowi ADC.

144. Modulator DLL3 według 143, przy czym wspomniany ADC obejmuje pirolobenzodiazepinę.

145. Modulator DLL3 według 144 obejmujący ponadto łącznik.

146. Wyizolowany modulator DLL3, który wiąże się z epitopem związanym z domeną N-końcową z

DLL3.

147. Modulator DLL3 według 146, przy czym wspomniany modulator stanowi przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment.

148. Modulator DLL3 według 147, przy czym wspomniane przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment stanowi przeciwciało monoklonalne.

149. Modulator DLL3 według 148, przy czym wspomniany modulator DLL3 stanowi ADC.

150. Modulator DLL3 według 149, przy czym wspomniany ADC obejmuje pirolobenzodiazepinę.

106

EP 2 817 338 B1

151. Modulator DLL3 według 150 obejmujący ponadto łącznik.

152. Wyizolowany modulator DLL3 znajdujący się z grupie epitopowej wybranej z grupy składającej się z grypy epitopowej A, grypy epitopowej B, grypy epitopowej C, grypy epitopowej D, grypy epitopowej E, grypy epitopowej F, grypy epitopowej G, grypy epitopowej H i grypy epitopowej I.

153. Wyizolowany modulator DLL3 znajdujący się w grupie epitopowej zdefiniowanej przez odniesienie do przeciwciała wybranego z grupy składającej się z SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8,

SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC.16.22, SC16.23,

SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39,

SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57,

SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78,

SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16,139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16.150.

154. Koniugat przeciwciało-lek o wzorze:

M-[L-D]n lub jego farmaceutycznie dopuszcza lna sól, w którym

a) M stanowi modulator DLL3;

b) L stanowi ewentualny łącznik;

c) D jest środkiem antyproliferacyjnym; a

d) n jest liczbą całkowitą od około do około 20.

155. Koniugat przeciwciało-lek według 154, przy czym wspomniany modulator DLL3 stanowi przeciwciało lub jego immunoreaktywny fragment.

156. Koniugat przeciwciało-lek według 155, w którym wspomniane przeciwciało stanowi przeciwciało monoklonalne.

157. Koniugat przeciwciało-lek według 156, w którym wspomniane przeciwciało pochodzi od przeciwciała wybranego z grupy składającej się z SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10,

SC16.25,

SC16.41,

SC16.58,

SC16.79,

SC16.106,

SC16.116,

SC16.126,

SC16.137,

SC16.148,

SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23,

SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.39,

SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57,

SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78,

SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.149 i SC16.150.

158. Koniugat przeciwciało-lek według 157, w którym wspomniane przeciwciało jest humanizowane.

159. Koniugat przeciwciało-lek według 154, w którym łącznik obejmuje łącznik podatny na cięcie.

107

EP 2 817 338 B1

160. Koniugat przeciwciało-lek według 159, w którym wspomnianym podatnym na cięcie łącznikiem jest łącznik peptydylowy.

161. Koniugat przeciwciało-lek według 154, przy czym wspomniany środek antyproliferacyjny obejmuje środek cytotoksyczny.

162. Koniugat przeciwciało-lek według 161, przy czym wspomniany środek cytotoksyczny stanowi pirolobenzodiazepinę.

163. Koniugat przeciwciało-lek według 162, przy czym wspomniana pirolobenzodiazepina stanowi dimer pirolobenzodiazepiny.

164. Modulator DLL3 obejmujący CDR z dowolnej spośród SEKW. NR ID: 20-203.

165. Modulator DLL3 według 164, przy czym wspomniany modulator obejmuje wiele CDR z dowolnej spośród SEKW. NR ID: 20-203.

166. Modulator DLL3 będący przeciwciałem, który konkuruje o wiązanie z białkiem DLL3 z przeciwciałem odniesienia wybranym z grupy składającej się z SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7,

SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, SC16.20, SC16.21, SC16.22,

SC16.23, SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38,

SC16.39, SC16.41, SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56,

SC16.57, SC16.58, SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16.67, SC16.68, SC16.72, SC16.73,

SC16.78, SC16.79, SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117, SC16.118, SC16.120, SC16.121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129, SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136, SC16.137, SC16.138, SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i SC16.150, przy czym wiązanie modulatora DDL3 będącego przeciwciałem do białka DLL3 jest hamowane o co najmniej 30%.

167. Modulator DLL3, który wiąże epitop białka DLL3 obejmujący aminokwasy Q93, P94, G95, A96 i P97 (SEKW. NR ID: 9).

168. Modulator DLL3, który wiąże epitop białka DLL3 obejmujący aminokwasy G203, R205 i P206 (SEKW. NR ID: 10).

PRZYKŁADY [0496] Niniejszy wynalazek, ogólnie opisany powyżej, będzie bardziej zrozumiały w odniesieniu do następujących przykładów, które są dostarczone w celu ilustracji i nie mają na celu ograniczenia niniejszego wynalazku. Przykłady nie mają na celu wskazania, że poniższe doświadczenia są wszystkimi lub jedynymi doświadczeniami. Jeśli nie podano inaczej, części są częściami wagowymi, masa cząsteczkowa jest wagowo średnią masą cząsteczkową, temperatura jest w stopniach Celsjusza, a ciśnienie jest atmosferyczne lub do niego zbliżo n e .

Przykład 1

Analiza ekspresji markera w wybranych nowotworach o cechach neuroendokrynnych [0497] Nowotwory neuroendokrynne (NET) powstałe w rozproszonym układzie endokrynnym są rzadkie, z częstością występowania 2-5 na 100000 osób, ale są bardzo agresywne. Nowotwory neuroendokrynne występują w nadnerczach, nerkach, przewodzie moczowo-płciowym (pęcherzu moczowym, gruczole

108

EP 2 817 338 B1 krokowym, jajniku, szyjce macicy i endometrium), trzustce, przewodzie pokarmowym (żołądku i jelicie grubym), tarczycy (rak rdzeniasty tarczycy) i płucu (drobnokomórkowy rak płuc, wielokomórkowy rak neuroendokrynny i rakowiak). Te nowotwory mogą wydzielać kilka hormonów, w tym serotoninę i / lub chromograninę A, które mogą powodować objawy osłabienia znane jako zespół rakowiaka. Te nowotwory można oznaczać dodatnimi markami immunohistochemicznymi, takimi jak enolaza specyficzna dla neuronu (NSE, znana również jako enolaza gamma, symbol genu = ENO2), CD56 / NCAM1 i synaptofizyna. Tradycyjne chemioterapie nie odniosły sukcesu w leczeniu NET, a śmiertelność z powodu przerzutów jest częstym wynikiem. Niestety, w większości przypadków operacja chirurgiczna jest jedynym potencjalnym wyleczeniem, pod warunkiem, że będzie mieć miejscie po wczesnym wykryciu i przed przerzutami nowotworu. W tym kontekście podjęto pracę, aby zidentyfikować nowe cele terapeutyczne związane z nowotworami mającymi cechy neuroendokrynne.

[0498] Aby zidentyfikować i scharakteryzować takie nowotwory, jakie występują u chorych na raka, opracowano i utrzymywano duży bank nowotworowy nie-tradycyjnych przeszczepów heterogenicznych (NTX) stosując techniki znane w dziedzinie. Bank nowotworowy NTX, obejmujący znaczną liczbę oddzielnych linii komórek nowotworowych, namnażano w myszach z niedoborem odporności przez wiele pasaży heterologicznych komórek nowotworowych otrzymanych pierwotnie od licznych pacjentów z rakiem, zaztakowanych różnymi złośliwymi guzami litymi nowotworów. (Należy zauważyć, że w niektórych Przykładach i na Figurach w niniejszym dokumencie numer pasażu badanej próbki jest wskazany przez p0-p # dołączony do oznaczenia próbki, gdzie p0 wskazuje na próbkę niepasażowaną otrzymaną bezpośrednio z guza pacjenta, a p# jest wskaźnikiem liczby pasaży nowotworu przez mysz przed badaniem). Ciągła dostępność dużej liczby odrębnych pasaży linii komórek nowotworowych NTX wczesnego pasażu mających dobrze określone rodowody znacznie ułatwia identyfikację i charakteryzację komórek oczyszczonych z linii komórkowych. W takich pracach zastosowanie minimalnie pasażowanych linii komórkowych NTX upraszcza eksperymentowanie in vivo i zapewnia łatwe do zweryfikowania wyniki. Ponadto nowotwory NTX o małej liczbie pasaży reagują na środki terapeutyczne, takie jak irynotekan (tj. Camptosar®) i schematy Cisplatyna/Etopozyd, co zapewnia klinicznie istotny wgląd w podstawowe mechanizmy kierujące wzrostem guza, oporność na obecne terapie i wznowę guza.

[0499] Gdy ustalono linie komórek nowotworowych NTX, ich fenotyp scharakteryzowano na różne sposoby w celu zbadania ogólnej ekspresji genów. W celu zidentyfikowania, które linie NTX w banku mogą być NET, wytworzono profile ekspresji genów za pomocą sekwencjonowania całego transkryptomu i/lub analizy mikromacierzy. W szczególności zbadano dane w celu zidentyfikowania nowotworów wyrażających wysokie poziomy konkretnych genów, o których wiadomo, że są podwyższone w NET lub wykorzystywane jako markery histochemiczne różnicowania neuroendokrynnego (np. ASCL1, NCAM1, CHGA), jak również nowotwory ze zmianami w genach szlaku NOTCH wskazującymi na tłumienie sygnalizacji NOTCH (np. zmniejszone poziomy receptorów NOTCH i zmiany w ligandach i cząsteczkach efektorowych).

[0500] Bardziej konkretnie, po ustaleniu różnych linii komórek nowotworowych NTX, jak to powszechnie robi się w przypadku ludzkich nowotworów u myszy z ciężkim niedoborem odporności, guzy poddano resekcji po osiągnięciu 800-2000 mm³, a komórki rozdzielono i zdyspergowano w zawiesinie, stosując znane w dziedzinie techniki trawienia enzymatycznego (patrz, na przykład, U.S.P.N. 2007/0292414).

[0501] Preparaty rozdzielonych komórek z tych linii NTX zostały następnie zubożone o mysie komórki, a następnie subpopulacje ludzkich komórek nowotworowych dalej wyizolowano za pomocą sortowania opartego na właściwościach fluorescencyjnych komórek i lizowano w buforze do lizy RLTplus RNA (Qiagen).

109

EP 2 817 338 B1

Następnie lizaty te przechowywano w temperaturze -80°C aż do zastosowania. Po rozmrożeniu całkowity

RNA wyekstrahowano z zastosowaniem zestawu do izolacji RNeasy isolation kit (Qiagen) zgodnie z instrukcjami dostawcy i oznaczono ilościowo na spektrofotometrze Nanodrop (Thermo Scientific) i Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies) ponownie z zastosowaniem protokołów producenta i zalecanych ustawień przyrządu. Otrzymane preparaty całkowitego RNA były odpowiednie do sekwencjonowania genetycznego i analizy ekspresji genów.

[0502] Sekwencjonowanie całego transkryptomu z zastosowaniem Applied Biosystems (ABI) SOLID (sekwencjonowanie przez Oligo Ligację / Detekcję) 4.5 lub SOLiD 5500x1 systemu sekwencjonowania następnej generacji (Life Technologies) przeprowadzono na próbkach RNA z linii NTX. cDNA wytworzono z próbek całkowitego RNA, stosując albo zmodyfikowany protokół dla całego transkryptomu (WT) z ABI zaprojektowany dla małego wkładu całkowitego RNA lub Ovation RNA-Seq System V2™ (NuGEN Technologies Inc.). Zmodyfikowany protokół WT o małym wkładzie wykorzystuje 1,0 ng całkowitego RNA w celu amplifikacji mRNA na końcu 3', co prowadzi do dużego zafałszowania 3' ekspresji mapowanego genu, podczas gdy system NuGen umożliwia bardziej konsekwentną amplifikację w całym transkrypcie i obejmuje amplifikację zarówno mRNA, jak i transkryptu nie-poliadenylowanego cDNA z zastosowaniem losowych heksamerów. Biblioteka cDNA została sfragmentowana i dodano adaptery kreskowe, aby umożliwić pulowanie bibliotek fragmentów z różnych próbek.

[0503] Platformy sekwencjonujące następnej generacji, SOLiD 4.5 i SOLiD 5500x1 firmy ABI, umożliwiają równoległe sekwencjonowanie transkryptomów z wielu linii NTX i sortowanych populacji. Bibliotekę cDNA skonstruowano z każdej próbki RNA, która jest sfragmentowana i kodowana kreskowo. Kody kreskowe na każdej bibliotece fragmentów pozwalają na pulowanie wielu próbek w równych stężeniach i biegną razem, zapewniając jednocześnie specyficzność próbki. Próbki pobierane są za pomocą PCR emulsyjnego, stosując system robotyki SOLiD™ BZ Bead™ firmy ABI, który zapewnia spójność próbki. Sekwencjonowanie sparowanych końców generuje 50-zasadowy odczyt w kierunku 5' do 3' i 25-zasadowy odczyt w kierunku 3' do 5' dla każdego klonalnie zamplifi kowanego fragmentu na pojedynczej perełce, która występuje w puli. W przypad ku platformy 5500x1, dla każdego zestawu 8 próbek spulowanych w wyżej wspomniany sposób, perełki są równomiernie zdeponowane do 6 pojedynczych ścieżek kanału na jednym chipie. Przeciętnie wygeneruje to więcej niż 50 milionów 50-zasadowych odczytów i 50 milionów 25-zasadowych odczytów dla każdej z 8 próbek i generuje bardzo dokładną reprezentację poziomu transkryptu mRNA w ko mó rkach nowotworowych. Dane wygenerowane przez platformę SOLiD zmapowały 34609 genów, jak opisano za pomocą RefSeq w wersji 47 z zastosowaniem NCBI w wersji hg19.2 opublikowanego ludzkiego geno mu i dostarczyły weryfikowalnych pomiarów poziomów RNA w większości próbek.

[0504] Platforma SOLiD jest zdolna do wychwytywania nie tylko ekspresji, ale SNP, znanych i nieznanych alternatywnych zdarzeń składania, małych niekodujących RNA oraz potencjalnie nowych odkryć egzonów opartych wyłącznie na odczycie (odczyty zmapowane unikatowo względem uprzednio nieprzypisanych lokalizacji genomowych). Tak więc, wykorzystanie tej platformy sekwencjonującej następnej generacji w połączeniu z prawnie zastrzeżonym oprogramowaniem do analizy danych i wizualizacji pozwoliło w ten sposób na odkrycie odmiennej ekspresji transkryptu, a także różnic i/lub preferencji dla konkretnych wariantów składania wyrażonych transkryptów mRNA. Dane sekwencjonowania z platformy SOLiD są nominalnie reprezentowane jako wartość ekspresji transkryptu z zastosowaniem metryki RPM (odczytów na milion) i RPKM (odczyt na kilobazę na milion), co umożliwia podstawową analizę różnic ekspresji jako standardową praktykę.

110

EP 2 817 338 B1 [0505] Sekwencjonowanie całego transkryptomu czterech guzów (LU73, LU64, LU86 i LU95) drobnokomórkowego raka płuca (SCLC), jednego guza jajnika (OV26) i wielokomórkowego raka neuroendokrynnego (LCNEC, LU37) spowodowało określenie powszechnie występujących wzorców ekspresji genów w NET (FIG. 4A). Bardziej konkretnie, te nowotwory miały wysoką ekspresję kilku markerów NET (ASCL1, NCAM1, CHGA), a także zmniejszone poziomy receptorów Notch i cząsteczek efektorowych (np. HES1, HEY1) i podwyższone markery supresji Notch (np. DLL3 i HBS6). W przeciwieństwie do tego, 4 normalne próbki płuc, 3 nowotwory gruczolakoraka płuc (LU137, LU146 i LU153) i 3 raka płaskonabłonkowego płuc (LU49, LU70 i LU76) wszystkie mają ekspresję różnych receptorów Notch i cząsteczek efektorowych i nie wykazują podwyższonej ekspresji supresorów Notch, takich jak HES6 i DLL3. [0506] Po zidentyfikowaniu, które NTX w banku nowotworowym są NET, każde przeanalizowano z zastosowaniem danych sekwencjonowania całego transkryptomu w celu znalezienia potencjalnych celów terapeutycznych regulowanych w górę w NET w porównaniu do nie-NET (w tym LU_SCC, LU_Ad i normalnego płuca). Wysoką ekspresję DLL3 stwierdzono w nowotworach NET NTX, w tym SCLC, LCNEC i OV26, w porównaniu z niską lub niewystępującą ekspresją w normalnym płucu, normalnym jajniku, innych liniach NTX OV, LU_Ad i LU_SCC NTX (FIG. 4B). Bardzo interesująca była wysoka ekspresja DLL3 w NET w stosunku do wielu typów normalnych tkanek, ponieważ DLL3 jest znanym supresorem sygnalizacji Notch. Biorąc to pod uwagę oraz w świetle wygenerowanych danych, DLL3 został wybrany do dalszej analizy jako potencjalny cel immunoterapeutyczny.

[0507] Ze stwierdzeniem, że DLL3 może okazać się realnym celem modulacji i leczenia pewnych zaburzeń proliferacyjnych, podjęto prace zmierzające do określenia wzoru ekspresji i poziomów wariantów DLL3. Jak omówiono powyżej, istnieją dwa znane warianty składania białek kodujących DLL3, które różnią się jedynie tym, że izoforma 1 ma wydłużony wewnątrzkomórkowy C-koniec (FIG. IE). Bardziej konkretnie, izoforma 2 jest białkiem 587 aminokwasowym (FIG. ID: SEKW. NR ID: 4) kodowanym przez wariant mRNA 2 (FIG. 1B; SEKW. NR ID: 2), który zawiera egzon 8a i 8c, podczas gdy izoforma 1 jest białkie m 618 aminokwasowym (Figura 1C, SEKW NR ID: 3) kodowanym przez wariant mRNA I (FIG. 1A, SEKW. NR ID: 1), zawierającym egzon 8b. Schematyczny wykres ilustrujący identyczną domenę zewnątrzkomórkową (BCD) izoformy 1 i izoformy 2 przedstawiono na FIG. 1F.

[0508] Ponownie, stosując dane całego transkryptomu otrzymane jak opisano powyżej, zbadano wybrane nowotwory NET w celu określenia wzorów ekspresji wspomnianych powyżej egzonów, które w rezultacie dostarczają stosunku ekspresji dwóch izoform. Jak pokazano na FIG. 5 stwierdzono, że chociaż stosunek ekspresji pomiędzy dwoma izoformami może się nieco zmieniać, w każdym nowotworze przeważała ekspresja izoformy 1. W tym kontekście należy zauważyć, że jak opisano powyżej, łączna ekspresja DLL3 (obydwu izoformy) w każdym z badanych nowotworów była podwyższona w odniesieniu do normalnych tkanek. W związku z tym, chociaż stosunki izoform mogą wskazywać na pewne typy nowotworów i odnosić się do selekcji genotypowych modulatorów, to nie jest tak istotne w odniesieniu do strategii fenotypowych modulatorów. Oznacza to, że ponieważ regiony ECD obu izoform DLL3 są identyczne, oczekuje się, że modulator fenotypowy według niniejszego ujawnienia ukierunkowany na region ECD (np. przeciwciało antyDLL3) będzie reagował z każdą izoformą. To bezwzględne poziomy ekspresji ECD DLL3 (niezależnie od izoformy), są tymi które kontrolują skuteczność takich strategii.

111

EP 2 817 338 B1

Przykład 2

Analiza mikromacierzy i RT-PCR ekspresji genu w wybranych nowotworach NTX z cechami neuroendokrynnymi [0509] W celu zide ntyfikowania dodatkowych NET w wyżej wymienionym banku NTX poza tymi, dla których istniały dane SOLiD dotyczące całego transkryptomu, zbadano większy zestaw linii NTX z zastosowaniem analizy mikromacierzy. W szczególności, 2-6 μg próbek całkowitego RNA pochodzących z całych guzów w 46 liniach NTX lub z 2 normalnych tkanek przeanalizowano z zastosowaniem platformy OneArray®microarray platform (Phalanx Biotech Group), która zawiera 29187 sond zaprojektowane wobec 192380 genów w ludzkim genomie. Bardziej konkretnie, otrzymano próbki RNA (jak opisano w Przykładzie 1) pochodzące od czterdziestu sześciu pacjentów z nowotworami NTX, o bejmującymi raki jelita grubego i odbytu (CR), czerniaka (SK), raka nerki (KD), płuc (LU), jajników (OV), endometrium (EM), sutka (BR), wątroby (LIV) lub trzustki (PA). Jako kontrole zastosowano normalne tkanki jelita grubego (NormCR) i normalne tkanki trzustki (NormPA). Jeszcze bardziej konkretnie nowotwory płuc były dalej subklasyfikowane jako drobnoko mórkowe raki płuc (SCLC), raki płaskonabłonkowe (SCC) lub wielokokomórkowe raki neuroendokrynne (LCNEC). Próbki RNA przeprowadzono w trzech powtórzeniach z zastosowaniem protokołów producenta, a otrzymane dane przeanalizowano stosując standardowe praktyki przemysłowe służące do normalizowania i transformowania zmierzonych wartości intensywności uzyskanych dla przedmiotowego genu w każdej próbce. W celu wytworzenia standardowego dendrogramu mikromacierzy dla tych 48 próbek zastosowano niezafałszowany (ang. unbiased) algorytm hierarchicznego klastrowania Pearson Spearman w pakiecie R/BioConductor o nazwie hclust.2. Jak wiadomo w dziedzinie R/BioConductor jest otwartym, statystycznym językiem programowania szeroko stosowanym w uczelniach finansach i przemyśle farmaceutycznym do analizy danych. Ogólnie nowotwory zostały rozmieszczone i sklastrowane na podstawie wzorów ekspresji genów, intensywności ekspresji itp.

[0510] Jak pokazano na FIG. 6A, dendrogram pochodzący z 48 próbek i wszystkich 19380 genów, sklastrował linie NTX razem na podstawie ich rodzaju nowotworu lub pochodzenia tkanki. Kilka nowotworów zazwyczaj związanych z fenotypa mi neuroendokrynnymi sklastrowanymi na gałęzi oznaczonej przez (1); te obejmujące raki skóry, liczne nowotwory płuc i inne NET. Co ciekawe, sub-gałąź, oznaczona przez (2), pokazała, że dwa wielkokomórkowe raki płuca z cechami neuroendokrynnymi (LU50.LCNEC i LU37.LCNEC) i drobnoko mórkowy rak płuc (LU102.SCLC) sklastrowały się z nowotworem jajnika (OV26) oraz nerki (KD66) (klaster C) co sugeruje, że te późniejsze nowotwory posiadały również fenotypy neuroendokrynne. Ponadto, na FIG. 6A przedstawiono klaster D, który składa się z 3 dodatkowych nowotworów SCLC, a po prawej małego klastra zawierającego dodatkowy NTX SCLC (LU100) i neuroendokrynny nowotwór endometrium (EM6), oczekuje się, że wszystkie posiadają pewne cechy neuroendokrynne, jak ogólnie wiadomo z literatury i doświadczenia patologogicznego w klinice. Fakt, że klaster G, składający się z raków płaskonabłonkowych płuc, można znaleźć na zupełnie innej gałęzi dendrogramu na FIG. 6A wskazuje, że klastrowanie nie jest prowadzone wyłącznie przez narząd pochodzenia dla nowotworu.

[0511] Bliższe zbadanie kolekcji markerów genów związanych z NET (FIG. 6B) pokazuje, że są one silnie wyrażane w nowotworach obejmujących klastery C i D, podczas gdy są one minimalnie wyrażane w nowotworach w Klastrze G (rak płaskonabłonkowy płuc), co sugeruje, że klastry C i D reprezentują NET lub nowotwory z fenotypem neuroendokrynnym. Bardziej konkretnie klaster C NET silnie wyraża ASCL1, CALCA, CHGA, SST i NKX2-1, podczas gdy klaster D NET silnie wyraża CHGA, ENO2 i NCAM1 , a właśnie

112

EP 2 817 338 B1 ekspresja tych genów fenotypu neuroendokrynnego jest częściowo odpowiedzialna za klastrowanie tych nowotworów. Ciekawą cechą jest silna ekspresja KIT w klastrze D, genu, o którym od czasu do czasu donoszono, że jest związany z nowotworami neuroendokrynnymi, ale w innych kontekstach wyraźnie powiązanego z onkogenezą. Jest to przeciwieństwo do guzów SCC w klastrze G, którym brak silnej ekspresji jakiegokolwiek z tych genów (FIG. 6B).

[0512] W odniesieniu do sygnalizacji Notch nowotwory w klastrze C wykazują fenotyp zgodny ze zmniejszeniem sygnalizacji Notch: brak ekspresji jakiegokolwiek receptora Notch, względny brak ekspresji JAG1 i HES1 oraz silne poziomy ekspresji ASCL1 (FIG. 6C). Co ciekawe, klaster D wykazuje wysoką ekspresję HES6, czynnika transkrypcyjnego, który może wspierać aktywność ASCL1 przez antagonizowanie aktywności HES1 poprzez tworzenie heterodimeru. Co najważniejsze, te dane z mikromacierzy wykazują wysokie poziomy transkrypcji DLL3 w nowotworach w klastrach C i D (w porównaniu do klastra G), co sugeruje, że w tych typach nowotworów DLL3 stanowi atrakcyjny cel terapeutyczny do leczenia NET.

[0513] W świetle powyższych wyników, ekspresję mRNA HES6 badano z różnych linii NTX i normalnych tkanek, stosując urządzenie Applied Biosystems 7900HT Machine (Life Technologies) w celu przeprowadzenia ilościowego RT-PCR w czasie rzeczywistym Taqman (qRT-PCR) zgodnie z protokołem producenta. RNA wyizolowano jak opisano powyżej i sprawdzono, aby zapewnić, że jakość była odpowiednia do analizy ekspresji genów. Zakupiono RNA z normalnych tkanek (Agilent Technologies i Life Technologies). 200 ng RNA zastosowano do syntezy cDNA z zastosowaniem zestawu cDNA archive kit (Life Technologies). cDNA zastosowano do analizy qRT-PCR na macierzach Taqman Low Density Arrays (TLDA, Life Technologies), które zawierały test HES6 Taqman w celu zmierzenia poziomów mRNA HES6.

[0514] Poziomy mRNA HES6 są pokazane dla każdej linii NTX lub próbki normalnej tkanki (pojedyncza kropka na wykresie) po normalizacji do kontroli endogennych. Normalizowane wartości są wykreślane w odniesieniu do średniej ekspresji w normalnych tkankach o podejrzewanej toksyczności (NormTox). Technika ta umożliwiła szybką identyfikację i charakterystykę różnych nowotworów mających cechy neuroendokrynne z banku nowotworowego NTX po prze z pomiar HBS6 i innych istotnych markerów. Na FIG. 6D zilustrowano ogólną nadekspresję HBS6 w próbkowanych nowotworowych o cechach neuroendokrynnych (np. LU-SCLC, LU-LCNEC) w porównaniu do normalnych tkanek, nowotworów sutka, okrężnicy, wątroby i innych wybranych nowotworów. Istotnie te dane z mikromacierzy i qPCR wskazują, że co najmniej niektóre nowotwory endometrium, nerki i jajnika mogą wykazywać cechy nowotworu neuroendokrynnego (FIG. 6A i 6D).

Przykład 3

Analiza RT- PCR DLL3 w nowotworach z cechami neuroendokrynnymi [0515] Aby potwierdzić dane generowane SOLiD i z mikromacierzy i rozszerzyć analizę na dodatkowe próbki NTX, ekspresję mRNA DLL3 analizowano za pomocą qRT-PCR z zastosowaniem próbek RNA z różnych linii NTX, pierwotnych biopsji i normalnych tkanek. Analizę ponownie przeprowadzono z zastosowaniem Applied Biosystems 7900HT Machine (Life Technologies), zasadniczo jak opisano bezpośrednio powyżej, ale zoptymalizowano pod kątem wykrywania DLL3. Ekspresja DLL3 jest przedstawiona w odniesieniu do średniej ekspresji w normalnych tkankach i znormalizowana do ekspresji endogennego kontrolnego genu ALAS 1. Jak widać na Fig. 7, badanie qRT-PCR ekspresji genu wykazało, że mRNA DLL3 jest podwyższony więcej niż 10000000 razy w populacjach NET w porównaniu z normalnymi tkanka mi . W tym przykładzie próbkowane nowotwory obejmują dodatkowe linie SCLC NTX poza tymi

113

EP 2 817 338 B1 badanymi wcześniej, a także wiele próbek RNA pochodzących z pierwotnych biopsji (p0). Zebrane dane pokazują, że ekspresja genu DLL3 jest znacząco regulowana w górę w nowotworach wykazujących cechy neuroendokrynne i biorąc pod uwagę, że ten sam wzór widziany jest w próbkach pierwotnej biopsji, to obserwowana regulacja w górę nie jest artefaktem wzrostu ludzkich guzów u myszy.

[0516] Ponadto, na FIG. 7 przedstawiono także trzy podtypy NSCLC, jak określone przez patologię kliniczną; LU25 jest rakiem wrzecionowatokomórkowym płuc, LU50 jest neuroendokrynnym rakiem wielokomórkowym (LCNEC), a LU85 jest rakiem płaskonabłonkowym (SCC). Najwyższą ekspresję DLL3 zaobserwowano w nowotworze LCNEC - LU50, chociaż podwyższone poziomy stwierdzono również w nowotworach SCC i wrzecionowatokomórkowych. KDY66 i OV26, odpowiednio nowotwory nerki i jajników klastrowały się na mikromacierzy z nowotworami SCLC i LCNEC (FIG. 6A), co sugeruje, że stanowią one guzy wykazujące cechy neuroendokrynne (tj. NET lub pNET). Taki wniosek potwierdzają wysokie poziomy mRNA DLL3 obserwowane w obu próbkach guza (FIG. 7). Podczas gdy wszystkie guzy wykazują uderzającą regulację w górę mRNA DLL3 w stosunku do normalnych tkanek (FIG. 7), porównanie guzów stwierdzonych zarówno na FIG. 6A jak i 7 pokazuje, że subtelne różnice w mierzonej ekspresji mRNA DLL3 na FIG. 7 odpowiadają zróżnicowanemu klastrowaniu na FIG. 6A; na przykład, klaster C zawiera KD66, LU50, OV26 i LU102, które znajdują się na wysokim końcu ekspresji DLL3, jak pokazano na FIG. 7, podczas gdy LU85 i LU100, z których każdy klastruje się z dala od klastrów C i D na FIG. 6A, znajdują się w dolnym końcu ekspresji DLL3 dla zmierzonych próbek guza. Guzy drobnoko mórkowego raka płuc w klastrze D na FIG. 6A (np. LU86, LU64 i LU95) wykazują pośrednie poziomy ekspresji mRNA DLL3 i równie dobrze mogą być podatne na leczenie modulatorami według niniejszego ujawnienia.

Przykład 4

Ekspresja mRNA DLL3 i białka w różnych próbkach guza [0517] Aby rozszerzyć analizę ekspresji DLL3 na szerszą macierz próbek guza, przeprowadzono qRT-PCR Taqman zasadniczo jak opisano w poprzednich Przykładach na 384-studzienkowej macierzy TissueScan™ qPCR (Origene Technologies). Ta macierz umożliwia porównanie ekspresji genów wśród 18 różnych typów guza litego, z wieloma próbkami pochodzącymi od pacjenta dla każdego typu nowotworu i z normalnej przyległej tkanki.

[0518] W tym celu, na FIG. 8A i 8B przedstawiono odpowiednio względne i bezwzględne poziomy ekspresji genu DLL3 w próbkach całych guzów (szare kropki) lub normalnej przyległej tkanki (NAT, białe kropki) od pacjentów z jednym z osiemnastu różnych typów guza litego. Dane są znormalizowane na FIG. 8A przeciwko średniej ekspresji genu w NAT dla każdego analizowanego typu nowotworu. Próbkom, w których DLL3 nie został wykryty, przypisano wartość Ct wynoszącą 50, co reprezentuje ostatni cykl amplifikacji w protokole doświadczalnym. Każda kropka reprezentuje pojedynczą próbkę tkanki o średniej geometrycznej reprezentowanej jako czarna linia. Stosując tę macierz Origene TissueScan Array, nadekspresję DLL3 zaobserwowano w podgrupie raka nadnercza, sutka, szyjki macicy, endometrium, płuc, jajnika, trzustki, tarczycy i pęcherza moczowego, z których wiele może reprezentować NET lub nowotwory o słabo zróżnicowanych fenotypach neuroendokrynnych. Podzbiór nowotworów płuca wykazał największą nadekspresję DLL3. Najwyższą ekspresję zaobserwowano w 2 nowotworach LCNEC na macierzy. Jak pokazano przez bezwzględną ekspresję genu na FIG. 8B, normalne jądra są jedyną normalną tkanką o wysokiej ekspresji DLL3. To sugeruje, że ekspresja DLL3 w NET i innych komórkach nowotworowych może odgrywać rolę w rozwoju nowotworów i/lub progresji nowotworu w szerokim zakresie nowotworów.

114

EP 2 817 338 B1 [0519] Biorąc pod uwagę podwyższone poziomy transkryptu DLL3 związane z różnymi nowotworami, podjęto prace zmierzające do wykazania odpowiadającego temu wzrostu ekspresji białka DLL3 w NET w stosunku do innych nowotworów. W tym celu opracowano kanapkową ELISA DLL3 z zastosowaniem platformy MSD Discovery Platform (Meso Scale Discovery, LLC) w celu wykrycia i określenia ilościowego ekspresji DLL3 w wybranych próbkach nowotworu NTX. W skrócie, próbki nowotworu NTX lizowano i całkowite stężenie białka, a także stężenie białka DLL3 mierzono w lizatach z zastosowaniem formatu kanapkowej ELISA w oparciu o wykrywanie elektrochemiluminescencji. Bardziej szczegółowo, stężenia DLL3 z próbek interpolowano z wartości elektrochemoiluminescencyjnych stosując standardową krzywą wytworzoną z oczyszczonego rekombinowanego białka i wyrażono na FIG. 8C jako nanogramy DLL3 na miligram całkowitego białka.

[0520] W szczególności guzy NTX wycięto myszom i błyskawicznie zamrożono na suchym lodzie/etanolu. Bufor do ekstrakcji białek (Biochain Institute, Inc.) dodawano do rozmrożonych kawałków guza, a guzy spulweryzowano z zastosowaniem systemu Tissue Lyser system (Qiagen). Lizaty oczyszczono przez odwirowanie (20000 g, 20 minut, 4°C) i oznaczano ilość białka z zastosowaniem kwasu bicinchoninowego (BCA). Lizaty białkowe przechowywano w temperaturze -80°C aż do analizy.

[0521] Płytki standardowe MSD (Meso Scale Discovery, LLC) powlekano przez noc w temperaturze 4°C 30 μl przeciwciała SC16.S4 (otrzymanego jak przedstawiono w Przykładzie 7 poniżej) przy 2 μg/ml w PBS. Płytki przemyto PBST i zablokowano w 150 μl roztworu MSD 3% Blocker A przez 1 godzinę. Płytki ponownie płukano w PBST. 25 μl przeciwciała SC16.4 (otrzymanego jak przedstawiono w Przykładzie 7 poniżej) skoniugowano ze znacznikiem MSD sulfo i dodano do przemytych płytek w ilości 0,5 μg / ml w 1% blokerze A MSD. Do studzienek dodano również 25 μl 10x rozcieńczonego lizatu w 1% blokerze A MSD lub seryjnie rozcieńczony rekombinowany standard DLL3 w 1% blokerze A MSD zawierającym 10% bufor do ekstrakcji białka i inkubowano przez 2 godziny. Płytki przemyto w PBST. Bufor MSD Read Buffer T ze środkiem powierzchniowo czynnym rozcieńczono do 1X w wodzie i do każdej studzienki dodano 150 pl. Płytki odczytywano na MSD Sector lmager 2400 za pomocą zintegrowanego oprogra mowania do analizy w celu uzyskania stężeń DLL3 w próbkach NTX via interpolacja. Wartości podzielono następnie przez całkowite stężenie białka w celu uzyskania nanogramów DLL3 na miligram całkowitego lizatu białka. Uzyskane stężenia przedstawiono na FIG. 8C, gdzie każdy punkt oznacza stężenia pochodzące z poje dynczej linii nowotworu NTX. Chociaż każdy punkt pochodzi z pojedynczej linii NTX, w większości przypadków badano wiele próbek biologicznych z tej samej linii NTX, a wartości zostały uśrednione, aby dostarczyć punktu danych.

[0522] W każdym razie na FIG. 8C pokazano, że najwyższą ekspresję DLL3 stwierdzono w SCLC, LCNEC, jak również w innych nowotworach neuroendokrynnych, w tym wybranych próbkach nerki i pojedynczym nowotworze jajnika. Na FIG. 8C pokazano również, że pewne linie czerniaka NTX wykazywały podwyższone wyrażanie białka DLL3, co jest szczególnie interesujące, ponieważ te linie NTX również klastrowały się w pobliżu linii NTX NET w analizie mikromacierzy przeprowadzonej w Przykładzie 4 (FIG. 6A).

[0523] Te dane w połączeniu z danymi transkrypcji dotyczącymi ekspresji DLL3 przedstawionymi powyżej silnie wzmacniają twierdzenie, że determinanty DLL3 stanowią atrakcyjne cele interwencji terapeutycznej.

Przykład 5

Ekspresja receptorów NOTCH i Delta-podobnych

Ligandy na powierzchni komórek wybranych linii nowotworów NTX

115

EP 2 817 338 B1 [0524] Aby dalej rozszerzyć obserwacje z Przykładów 1 i 2 powyżej, określono przez sekwencjonowanie SOLID lub qRT-PCR, że komórki wyizolowane z kilku nowotworów NTX stwierdzonych w klastrach C i D (KDY66, OV26, LU64; FIG. 6A) oraz nowotworu SCLC mają wysoką ekspresję DLL3 (LU73, FIG. 4 i 7) analizowano stosując cytometrię przepływową do określenia poziomów ekspresji białka dla różnych receptorów Notch i innych członków rodziny DLL. Ogólnie dane dotyczące ekspresji białek na podstawie cytometrii przepływowej wygenerowano stosując FACSCanto II (BD Biosciences) zgodnie z instrukcjami producenta. Dane na FIG. 9 pokazują pojedyncze komórki nowotworowe przedstawione jako wykresy histogramowe, w których barwienie tła przeciwciał kontroli izotypowej jest pokazane na szarych, wypełnionych histogramach, a ekspresja białka będącego przedmiotem zainteresowania, jak określono z zastosowaniem komercyjnie dostępnych przeciwciał, jest przedstawiona za pomocą pogrubionej, czarnej linii.

[0525] Jak pokazano graficznie na FIG. 9, w dowolnym z tych nowotworów zaobserwowano niewielką lub nie zaobserwowano ekspresji żadnego z receptorów Notch (np. NOTCH1-4), jak określono w odniesieniu do fluorescencji minus jeden (FMO) barwionych komórek kontrola-izotyp. Wskazano to graficznie za pomocą histogramów, a także numerycznie w zgłasza nych średnich intensywnościach fluorescencji (MFI) dla każdego pomiaru. Podobnie, komórki NTX pochodzące z dwóch raków płuc nie wykazywały ekspresji ani DLL1 ani DLL4. Niewielką ekspresję samego DLL4 (OV26) lub DLL1 i DLL4 (KDY66) można zaobserwować w przypadku dwóch nowotworów. Ogólnie rzecz biorąc, obserwacje te potwierdzają wyniki uzyskane i przedstawione w Przykładach 1 i 2 powyżej, że te typy nowotworów wykazują niewielką lub żadną ekspresję składników szlaku sygnalizacji Notch, co odpowiada utracie sygnalizacji Notch w NET lub słabo zróżnicowanych nowotworach z fenotypami neuroendokrynnymi.

Przykład 6

Wytwarzanie modulatorów anty-DLL3 [0526] Modulatory DLL3 w postaci mysich przeciwciał wytworzono zgodnie z instrukcjami w niniejszym dokumencie poprzez inokulację rekombinowanym ludzkim DLL3-Fc lub ludzkim DLL3-His (każdy zawierający dojrzały ECD DLL3 przedstawiony na FIG. 1C, SEKW. NR ID: 3) w dwóch oddzielnych kampaniach szczepień. Pod tym względem zaszczepiono ludzkimi rekombinowanymi DLL3 trzy szczepy myszy (Balb / c, CD-1 i FVB) w celu dostarczenia hybrydoma wydzielających modulatory będące mysimi przeciwciałami monoklonalnymi o wysokim powinowactwie.

[0527] Konstrukt fuzyjny hDLL3-Fc otrzymano z firmy Adipogen International (nr katalogowy AG-40A-0113), w której oczyszczono go z supernatantu komórek HEK 293 z nadekspresją DLL3-Fc, jak opisano w karcie produktu producenta. Zrekombinowane białko hDLL3-His oczyszczono z supernatantów komórek CHOK1 zaprojektowanych do nadekspresji hDLL3-His. 10 μg immunogenu hDLL3-Fc lub hDLL3-His zemulgowano z taką samą objętością TITERMAX® Gold (CytRx Corporation) lub adiuwantu glinowego i zastosowano do immunizacji każdej myszy. Otrzymane emulsje wstrzyknięto następnie trzem samicom myszy (po 1: Balblc, CD-1 i FVB) via drogą dopodeszwową.

[0528] Do badania przesiewowego mysich surowic pod kątem mysich przeciwciał IgG specyficznych wobec ludzkiego DLL3 zastosowano testy ELISA w fazie stałej. Dodatni sygnał powyżej tła wskazywał na przeciwciała specyficzne wobec DLL3. Pokrótce, 96-studzienkowe płytki (VWR International, nr kat. 610744) powlekano przez noc rekombinowanym DLL3-Hi s w ilości 0,5 μg / ml w buforze powlekającym BLISA. Po przemyciu PBS zawierającym 0,02% (obj./obj.) Tween 20 studzienki blokowano 3% (wag./obj.) BSA w PBS,

116

EP 2 817 338 B1

200 μl / studzienkę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej (RT). Surowicę mysią miareczkowano (1: 100, 1: 200, 1: 400 i 1: 800) i dodano do płytek powleczonych DLL3 w stężeniu 50 μl/studzienkę i inkubowano w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę. Płytki przemyto i następnie inkubowano z 50 μl/studzienkę koziej anty-mysiej IgG znakowanej HRP 1: 10000 w 3% BSA-PBS lub 2% FCS w PBS przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki ponownie przemyto i dodano 40 μl/studzienkę roztworu substratowego TMB (Thermo Scientific 34028) na 15 minut w temperaturze pokojowej. Po wywołaniu dodano równą objętość 2N H2SO4 w celu zatrzymania wywoływania substratu i płytki analizowano za pomocą spektrofotometru przy OD 450.

[0529] Immunizowane seropozytywne myszy uśmiercono i wycięto odprowadzające węzły chłonne (poplitealne i pachwinowe, i przyśrodkowe biodrowe, jeśli powiększone) i zastosowano jako źródło komórek wytwarzających przeciwciała . Zawiesinę pojedynczych komórek, komórek B, (228,9x10⁶ komórek) sfuzowano z niewydzielającymi komórkami szpiczaka P3x63Ag8.653 (ATCC # CRL-1580) w stosunku 1: 1 przez elektofuzję. Elektrofuzję przeprowadzono stosując system BTX Hybrimmune™ System, (BTX Harvard Apparatus) zgodnie z instrukcja mi producenta. Po zakończeniu procedury fuzji komórki ponownie zawieszono w pożywce do selekcji hybrydoma uzupełnionej azaseryną (Sigma # A9666), pożywce DMEM o wysokim stężeniu glukozy z pirogronianem sodu (Cellgro # kat. 15-017-CM) zawierającej 15% surowicy Fetal Clone I (Hyclone), 10 % BM Condimed (Roche Applied Sciences), 4 mM L-glutaminy, 100 jm penicyliny-streptomycyny i 50 μΜ 2-merkaptoetanolu, a następnie wysiano w trzech kolbach T225 w 90 ml pożywki selekcyjnej na kolbę. Następnie kolby umieszczono w nawilżanym inkubatorze w temperaturze 37°C, zawierającym 5% CO2 i 95% powietrza na 6-7 dni.

[0530] Po sześciu do siedmiu dni wzrostu bibliotekę składającą się z komórek hodowanych luzem w T225s wysiano w ilości 1 komórki na studzienkę w 96-studzienkowych płytkach Falcon z dnem w kształcie litery U, stosując sorter komórek Aria I. Wybrane hybrydoma hodowano następnie w 200 μl pożywki hodowlanej zawierającej 15% surowicy Fetal Clone I (Hyclone), 10% BM-Condimed (Roche Applied Sciences), 1 mM pirogronianu sodu, 4 mM L-glutaminy, 100 jm Penicylina-Streptamycyna, 50 μΜ 2-merkaptoetanolu i 100 μM hipoksantyny. Jakiekolwiek pozostałe nieużywane komórki biblioteki hybrydoma zostały zamrożone do przyszłych testów bibliotek. Po dziesięciu do jedenastu dni wzrostu, supernatanty z każdej studzienki wysianych komórek testowano pod kątem przeciwciał reaktywnych wobec DLL3 za pomocą testów ELISA i FACS.

[0531] Do badań przesiewowych 96-studzienkowye płytki ELISA powleczono denaturowanym ludzkim DLL3 lub lizatami komórkowymi 293 komórek nadwyrażających ludzkie DLL3 (otrzy ma ny w sposób omówiony poniżej), w buforze węglanu sodu przez noc w 4°C. Płytki przemyto i blokowano 3% BSA w PBS/Tween przez jedną godzinę w 37°C i stosowano natychmiast lub przechowywano w temperaturze 4°C. Nierozcieńczone supernatanty hybrydoma inkubowano na płytkach przez jedną godzinę w te mperaturze pokojowej. Płytki przemyto i sondowano znakowaną HRP kozią anty-mysią IgG rozcieńczoną 1: 10000 w 3% BSA-PBS przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki następnie inkubowano z roztworem substratu, jak opisano powyżej i odczytano przy OD 450. Studzienki zawierające immunoglobulinę, które preferencyjnie związały ludzkie DLL3, jak określono dzięki sygnałowi powyżej tła, zostały przeniesione i namnożone.

[0532] Studzienki dodatnie pod kątem wzrostu hybrydoma wydzielających mysią immunoglobulinę badano również przesiewowo pod względem specyficzności ludzkiego DLL3 i reaktywności krzyżowej Cynomolgus, szczurzego i mysiego DLL3 z zastosowaniem testu na bazie cytometrii przepływowej z 293 komórkami

117

EP 2 817 338 B1 zaprojektowanymi do nadmiernego wyrażania białek, albo ludzkiego DLL3 (h293-hDLL3), DLL3 Cynomolgus (h293-cDLL3), szczurzego DLL4 (h293-rDLL3) albo mysiego DLL3 (h293-mDLL3). Komórki h293-hDLL3 wytworzono przez transdukcję komórek 293T z zastosowaniem lentiwirusa wytworzonego z komercyjnego tentiwirusowego wektora bicistronowego (Open Biosystems), który wyrażał zarówno marker hDLL3, jak i marker GFP. Komórki h293-mDLL3 wytworzono przez transdukcję komórek 293T z zastosowaniem lentiwirusowego wektora bicistronowego wyrażającego zarówno mDLL3, jak i marker RFP, skonstruowanego w następujący sposób. Fragment DNA (FIG. 10A, SEKW. NR ID: 5) kodujący dojrzałe mysie białko DLL3 (FIG. 10B, SEKW. NR ID: 6) otrzymano przez amplifikację PCR z komercyjnego mysiego konstruktu DLL3 (Origene) i subklo nowa nego poniżej sekwencji peptydu sygnałowego IgGK uprze d n io zaprojektowanej powyżej miejsca wielokrotnego klonowania pCDH-EF1-MCS-IRES-RFP (System Biosciences) z zastosowaniem standardowych technik klonowania molekularnego. Podobnie, komórki h293-rDLL3 wytworzono przez transdukcję komórek 293T z zastosowaniem lentiwirusowego wektora bicistronowego wyrażającego zarówno szczurze DLL3, jak i marker GFP, skonstruowanego przez klonowanie syntetycznego fragmentu DNA (GeneWiz) zawierającego sekwencję optymalizowaną pod względem kodonów kodującą dojrzałe szczurze białko DLL3 (dostęp NP_446118.1, reszty 25 - 589) poniżej sekwencji peptydu sygnałowego IgK, uprzednio zaprojektowanej poniżej miejsca wielokrotnego klonowania pCDH-EF1-MCSIRES-GFP (System Biosciences) z zastosowaniem standardowych technik klonowania molekularnego. Wreszcie, sekwencję DLL3 (cDLL3) cynomolgus (np. Macaca fascicularis) wydedukowano z zastosowaniem ludzkiej sekwencji DLL3 do BLAST wobec publicznie dostępnych kontigów pełnego genomu Macaca fascicularis sekwencjonowanych metodą shotgun, a także składania sekwencji egzonów genu Cynomolgus, zakładając utrzymanie struktury egzonicznej w genie wśród gatunków. Zastosowano amplifikację PCR i bezpośrednie sekwencjonowanie poszczególnych egzonów 2 - 7 z genomowego DNA Cynomolgus (Zyagen) w celu potwierdzenia, że wydedukowana sekwencja była poprawna w regionie ECD białka. Sekwencję DNA cDLL3 (FIG. 10C, SEKW. NR ID: 7) kodującą białko cDLL3 (FIG. 10D, SEKW. NR ID: 8) wytworzono syntetycznie (GeneWiz) i subklonowano poniżej sekwencji sygnałowej IgGK uprze d n io zaprojektowanej powyżej miejsca wielokrotnego klonowania pCDH-EF1-MCS-IRES-GFP (System Biosciences) z zastosowaniem standardowych technik klonowania molekularnego. Transdukcja komórek 293T tym wektorem dała komórki h293-cDLL3.

[0533] W badaniach cytometrii przepływowej 50x10⁴ komórek h293 transdukowanych odpowiednio DLL3 ludzkim, cynomolgus, szczurzym lub mysim inkubowano przez 30 minut z 25-100 μΐ supernatantu hybrydoma. Komórki przemyto PBS, 2% FCS, dwukrotnie, a następnie inkubowano z 50 μΐ drugorzędowego, specyficznego wobec fragmentu Fc, koziego przeciwciała anty-mysia IgG skoniugowanego z DyLight 649 rozcieńczonym 1: 200 w PBS / 2% FCS. Po 15 minutach inkubacji komórki przemyto dwukrotnie PBS / 2% FCS i ponownie zawieszono w PBS / 2% FCS z DAPI i analizowano za pomocą cytometrii przepływowej stosując FACSCanto II zgodnie z instrukcjami producenta. Studzienki zawierające immunoglobulinę, która preferencyjnie wiązała komórki DLL3⁺ GFP⁺, zostały przeniesione i namnożone. Uzyskane specyficzne hybrydoma klonalne hDLL3 kriokonserwowano w pożywce do zamrażania CS-10 (Biolife Solutions) i przechowywano w ciekłym azocie. Przeciwciała, które związały komórki h293-hDLL3, h293-cDLL3, h293rDLL3 i / lub h293-mDLL3 zostały odnotowane jako krzyżowo reaktywne (patrz FIG. 12). Na podstawie tego testu wszystkie wybrane modulatory, które były krzyżowo reaktywne z mysim antygenem, także reagowały krzyżowo z antygenem szczurzym.

118

EP 2 817 338 B1 [0534] Analiza ELISA i cytometrii przepływowej potwierdziła, że oczyszczone przeciwciało z większości lub wszystkich tych hybrydoma wiązało DLL3 w sposób zależny od stężenia. Przeprowadzono jedną fuzję każdej kampanii immunizacyjnej i wysiano w 64 płytkach (6144 studzienek przy około 60 - 70% skuteczności klonowania). Kampania immunizacyjna hDLL3-Fc i badanie przesiewowe dały w przybliżeniu 90 mysich przeciwciał specyficznych wobec ludzkiego DLL3, z których kilka było reaktywnych krzyżowo z mysim DLL3. Kampania immunizacyjna hDLL3-His dała 50 dodatkowych mysich przeciwciał specyficznych dla ludzkiego DLL3, z których wiele reagowało krzyżowo z mysim DLL3.

Przykład 7

Sekwencjonowanie mysich modulatorów DLL3 [0535] W oparciu o powyższe, do sekwencjonowania i dalszej analizy wybrano kilka różnych przykładowych przeciwciał monoklonalnych, które wiążą immobilizowane ludzkie DLL3 lub ko mó rki h293-hDLL3 z najwyraźniej wysokim powinowactwem. Jak pokazano w sposób tabelaryczny na FIG. 11A i 11B, analiza sekwencji regionów zmiennych łańcucha lekkiego (FIG. 11A) i regionów zmiennych łańcucha ciężkiego (FIG. 11B) z wybranych przeciwciał monoklonalnych wygenerowanych w Przykładzie 6 potwierdziła, że wiele miało nowe regiony determinujące komple mentarność i często wykazywało nowe ułożenia VDJ. Należy zauważyć, że regiony determinujące komple mentarność przedstawione na FIG. 11A i 11B są określone jak w przypadku Chothia i wsp., powyżej.

[0536] Jako pierwszy krok w sekwencjonowaniu przykładowych modulatorów wybrane komórki hybrydoma zlizowano w odczynniku Trizol® (Trizol Plus RNA Purification System, Life Technologies) w celu wytworzenia RNA. W tym kontekście pomiędzy 10⁴ a 10⁵ komórek ponownie zawieszono w 1 ml Trizolu i silnie wstrząsano po dodaniu 200 μΐ chloroformu. Próbki wirowano w temperaturze 4°C przez 10 minut i fazę wodną przeniesiono do świeżej probówki mikrowirowniczej, do której dodano równą objętość izopropanolu. Probówki ponownie silnie wstrząsano i pozostawiono do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut, po czym odwirowano w temperaturze 4°C przez 10 minut. Powstałe peletki RNA przemyto raz 1 ml 70% etanolu i wysuszono krótko w temperaturze pokojowej przed ponownym zawieszeniem w 40 μl wody poddanej działaniu DEPC. Jakość preparatów RNA określono przez frakcjonowanie 3 μ! w 1% żelu agarozowym przed przechowywaniem w -80°C do momentu użycia.

[0537] Region zmienny łańcucha ciężkiego Ig każdej hybrydoma amplifikowano stosując mieszaninę starterów 5' zawierającą trzydzieści dwa startery sekwencji literowych specyficznych wobec myszy, zaprojektowanych do ukierunkowania na kompletny mysi repertuar VH, w kombinacji ze 3' mysim starterem CY specyficznym wobec wszystkich mysich izotopów Ig. Fragment PCR o wielkości 400 bp V_Hzsekwencjonowano z obu końców z zastosowaniem tych samych starterów PCR. Podobnie do amplifikacji i sekwencjonowania łańcucha lekkiego kappa zastosowano mieszaninę trzydziestu dwóch starterów 5' sekwencji liderowych Vk zaprojektowanych do amplifikacji każdej rodziny mysiego Vk w połączeniu z pojedynczym odwrotnym starterem specyficznym wobec mysiego regionu stałego kappa. Transkrypty VH i VL amplifikowano od 100 ng całkowitego RNA z zastosowaniem reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (RT-PCR).

[0538] W przypadku każdej hybrydoma przeprowadzono łącznie osiem reakcji RT-PCR: cztery dla łańcucha lekkiego Vk i cztery dla łańcucha ciężkiego V gamma (γ1). Do amplifikacji zastosowano zestaw One Step RT-PCR kit (Qiagen). Ten zestaw zapewnia połączenie Sensiscript i Omniscript Reverse Transcriptases, polimerazy DNA HotStarTaq, mieszanki dNTP, buforu i Q-Solution, nowego dodatku, który umożliwia

119

EP 2 817 338 B1 skuteczną amplifikację matryc "trudnych" (np. bogatych w GC). Przygotowano mieszaniny reakcyjne, które zawierały 3 μl RNA, 0,5 z 100 μM albo startera łańcucha ciężkiego albo łańcucha lekkiego kappa (zsyntetyzowany na zamówienie przez IDT), 5 μl 5 x buforu RT-PCR, 1 μl dNTP, 1 μl mieszaniny enzymów zawierającej odwrotną transkryptazę i polimerazę DNA oraz 0,4 μl inhibitora rybonukleazy RNasin (1 jednostka). Mieszanina reakcyjna zawiera wszystkie odczynniki wymagane zarówno do odwrotnej transkrypcji jak i PCR. Program termocyklera ustawiono dla etapu RT na 50°C przez 30 minut, 95°C przez 15 minut, a następnie 30 cykli PCR (95°C przez 30 sekund, 49°C przez 30 sekund, 72°C przez jedną minutę). Potem nastąpiła ostateczna inkubacja w 72°C przez 10 minut.

[0539] W celu przygotowania produktów PCR do bezpośredniego sekwencjonowania DNA, oczyszczono je stosując zestaw QIAquick™ PCR Purification Kit (Qiagen) zgodnie z protokołem producenta. DNA eluowano z kolumny typu spin, stosując 50 μl jałowej wody, a następnie sekwencjonowano bezpośrednio z obu nici. Wyekstrahowane produkty PCR bezpośrednio sekwencjonowano stosując startery specyficzne wobec regionu V. Sekwencje nukleotydowe analizowano z zastosowaniem IMGT w celu identyfikacji członków genowych V, D i J linii zarodkowej o najwyższej homologii sekwencji. Sekwencje pochodne porównywano ze znanymi sekwencjami DNA regionów V i J Ig linii zarodkowych z zastosowaniem V-BASE2 (Retter i wsp., powyżej) oraz przez dopasowanie genów VH i VL do mysiej bazy linii zarodkowej, aby dostarczyć przypisanych sekwencji przedstawionych na FIG. 11A i 11B.

[0540] Bardziej szczegółowo, na FIG. 11A przedstawiono ciągłe sekwencje aminokwasowe dziewięćdziesięciu dwóch nowych regionów zmiennych mysiego łańcucha lekkiego z przeciwciał anty-DLL3 (SEKW. NR ID: 20 - 202, liczby parzyste) i pięciu regionów zmiennych humanizowanego łańcucha lekkiego (SEKW. NR ID: 204 - 212, liczby parzyste) pochodzących od reprezentatywnych mysich łańcuchów lekkich. Podobnie, na FIG. 11B przedstawiono ciągłe sekwencje aminokwasowe dziewięćdziesięciu dwóch nowych regionów zmiennych mysiego łańcucha ciężkiego (SEKW. NR ID: 21-203, liczby nieparzyste) z tych samych przeciwciał anty-DLL3 i pięć regionów zmiennych humanizowanych łańcuchów ciężkich (SEKW. NR ID: 205 - 213, liczby nieparzyste) z tych samych mysich przeciwciał dostarczając humanizowane łańcuchy lekkie. Tak więc, wzięte razem FIG. 11A i 11B dostarczają opisanych sekwencji dziewięćdziesięciu dwóch funkcjonalnych mysich przeciwciał anty-DLL3 (określanych SC16.3, SC16.4, SC16.5, SC16.7, SC16.8, SC16.10, SC16.11, SC16.13, SC16.15, SC16.18, SC16.19, Sic16.20, SC16.21, SC16.22, SC16.23,

SC16.25, SC16.26, SC16.29, SC16.30, SC16.31, SC16.34, SC16.35, SC16.36, SC16.38, SC16.41,

SC16.42, SC16.45, SC16.47, SC16.49, SC16.50, SC16.52, SC16.55, SC16.56, SC16.57, SC16.58,

SC16.61, SC16.62, SC16.63, SC16.65, SC16,67, SC16.68, SC16.72, SC16.73, SC16.78, SC16.79,

SC16.80, SC16.81, SC16.84, SC16.88, SC16.101, SC16.103, SC16.104, SC16.105, SC16.106, SC16.107, SC16.108, SC16.109, SC16.110, SC16.111, SC16.113, SC16.114, SC16.115, SC16.116, SC16.117,

SC16.118, SC16.120, SC16,121, SC16.122, SC16.123, SC16.124, SC16.125, SC16.126, SC16.129,

SC16.130, SC16.131, SC16.132, SC16.133, SC16.134, SC16.135, SC16.136. SC16.137, SC16.138,

SC16.139, SC16.140, SC16.141, SC16.142, SC16.143, SC16.144, SC16.147, SC16.148, SC16.149 i

SC16,150) i pięciu humanizowanych przeciwciał (nazywanych hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 i hSC16.56). Należy zauważyć, że te same oznaczenia mogą odnosić się do klonu, który wytwarza przedmiotowe przeciwciało i, jako takie, zastosowanie dowolnego określonego oznaczenia powinno być interpretowane w kontekście otaczającego go ujawnienia.

[0541] Do celów niniejszego zgłoszenia SEKW. NR ID każdego konkretnego przeciwciała są sekwencyjne. Zatem mAb SC16.3 zawiera SEKW. NR ID: 20 i 21 odpowiednio dla regionów zmiennych łańcucha lekkiego

120

EP 2 817 338 B1 i ciężkiego. W tym kontekście SC16.4 zawiera SEKW. NR ID: 22 i 23, SC16.5 zawiera SEKW. NR ID: 24 i 25, i tak dalej. Ponadto, odpowiednie sekwencje kwasów nukleinowych dla każdej sekwencji aminokwasowej przeciwciała na FIG. 11A i 11B są dołączone do niniejszego zgłoszenia na złożonej z nim liście sekwencji. W przedmiotowej liście sekwencji zawarte sekwencje kwasów nukleinowych zawierają SEKW. NR ID, które są o dwieście większe od odpowiedniej sekwencji aminokwasowej (łańcuch lekki lub ciężki). Tak więc, sekwencje kwasu nukleinowego kodujące sekwencje aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego z mAb SC16.3 (tj. SEKW NR ID: 20 i 21) stanowią SEKW. NR ID: 220 i 221 w liście sekwencji. W tym kontekście sekwencje kwasów nukleinowych kodujące wszystkie ujawnione sekwencje aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego, włącznie z sekwencjami kodującymi humanizowane konstrukty, są ponumerowane w podobny sposób i stanowią SEKW. NR ID: 220 - 413.

Przykład 8

Humanizacja modulatorów DLL3 [0542] Jak wspomniano powyżej, pięć mysich przeciwciał z Przykładu 7 humanizowano stosując wszczepianie regionu determinującego komplementarność (CDR). Ludzkie zręby dla łańcuchów ciężkich i lekkich wybierano w oparciu o podobieństwo sekwencji i struktury w odniesieniu do funkcjonalnych genów ludzkiej linii zarodkowej. W tym względzie oceniono podobieństwo strukturalne przez porównanie mysiej struktury kanonicznej CDR do ludzkich kandydatów z tymi samymi strukturami kanonicznymi, jak opisano w Chothia i wsp. (powyżej).

[0543] Bardziej szczegółowo mysie przeciwciała SC16.13, SC16.15, SC16.25, SC16.34 i SC16.56 humanizowano stosując wspomaganą komputerowo metodę wszczepiania CDR (Abysis Database, UCL Business Plc.) oraz standardowe techniki inżynierii molekularnej w celu dostarczenia modulatorów hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 i hSC16.56. Ludzkie regiony zrębowe regionów zmiennych wybierano w oparciu o ich najwyższą homologię sekwencji do przedmiotowej mysiej sekwencji zrębowej i jej kanonicznej struktury. Do celów analizy humanizowania przyporządkowanie aminokwasów do każdej z domen CDR jest zgodne z numeracją według Kabata i wsp. (powyżej).

[0544] Procedury inżynierii molekularnej prowadzono stosując techniki rozpoznawane w dziedzinie. W tym celu całkowity mRNA wyekstrahowano z hybrydoma i amplifikowano jak przedstawiono w Przykładzie 7 bezpośrednio powyżej.

[0545] Z informacji o sekwencji nukleotydowej otrzymano dane dotyczące segmentów genowych V, D i J łańcuchów ciężkich i lekkich przedmiotowych mysich przeciwciał. Na podstawie danych o sekwencji zestawy nowych starterów specyficzne dla sekwencji liderowej VH i VK łańcucha lekkiego Ig przeciwciał zaprojektowano do klonowania rekombinowanego przeciwciała monoklona lnego . Następnie sekwencje V(D)-J zostały dopasowano z sekwencjami linii zarodkowej mysiej Ig. Uzyskane ułożenia genetyczne dla każdego z pięciu humanizowanych konstruktów przedstawiono w Tabeli 1 bezpośrednio poniżej.

TABELA 1

<td>mAb</td><td>ludzki VH</td><td>ludzki DH</td><td>ludzki JH</td><td>Zmiany FW</td><td>ludzki VK</td><td>ludzki JK</td><td>Zmiany FW</td>

<td>hSC16.13</td><td>IGHV2-5</td><td>IGHD1-1</td><td>JH6</td><td>Brak</td><td>IGKV-O2</td><td>JK1</td><td>Brak</td>

<td>hSC16.15</td><td>VH1-46</td><td>IGHD2-2</td><td>JH4</td><td>Brak</td><td>IGKV-L4</td><td>JK4</td><td>87F</td>

<td>hSC16.25</td><td>IGHV2-5</td><td>IGHD3-16</td><td>JH6</td><td>Brak</td><td>IGVK-A10</td><td>JK2</td><td>Brak</td>

121

EP 2 817 338 B1

<td>mAb</td><td>ludzki VH</td><td>ludzki DH</td><td>ludzki JH</td><td>Zmiany FW</td><td>ludzki VK</td><td>ludzki JK</td><td>Zmiany FW</td>

<td>hSC16.34</td><td>IGHV1-3</td><td>IGHD3-22</td><td>JH4</td><td>Brak</td><td>IGVK-A20</td><td>JK1</td><td>97F</td>

<td>hSC16.56</td><td>IGHV1-18</td><td>IGHD2-21</td><td>JH4</td><td>Brak</td><td>IGKV-L2</td><td>JK2</td><td>Brak</td>

[0546] Sekwencje przedstawione w TABELI 1 odpowiadają przypisanym sekwencjom łańcuchów ciężkich i lekkich przedstawionym na FIG. 11A i 11B dla przedmiotowych klonów. Bardziej szczegółowo, wpisy w

Tabeli 1 powyżej odpowiadają ciągłym sekwencjom regionu zmiennego przedstawionym przez SEKW. NR IDS: 204 i 205 (hSC16.13), SEKW. NR ID: 206 i 207 (hSC16.15), SEKW. NR ID: 208 i 209 (hSC16.25),

SEKW. NR ID: 210 i 211 (hSC16.34) i SEKW. NR ID: 212 i 213 (hSC16.56). Ponadto, w TABELI 1 pokazano, że bardzo mało zmian zrębu było koniecznych do utrzymania korzystnych właściwości modulatorów wiążących. W tym kontekście nie przeprowadzono żadnych zmian zrębu lub mutacji wstecznych w regionach zmiennych łańcucha ciężkiego, a w regionach zmiennych łańcucha lekkiego przeprowadzono tylko dwie modyfikacje zrębu (tj. 87F w hSC16.15 i hSC16.34).

[0547] Po humanizacji wszystkich wybranych przeciwciał przez wszczepienie CDR, uzyskane sekwencje aminokwasowe regionu zmiennego łańcucha lekkiego i ciężkiego zostały przeanalizowane w celu określenia ich homologii w odniesieniu do regionów zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego mysiego donora i ludzkiego akceptora. Wyniki, przedstawione bezpośrednio poniżej w Tabeli 2, odsłaniają, że humanizowane konstrukty konsekwentnie wykazywały większą homologię w odniesieniu do sekwencji ludzkiego akceptora niż z mysimi sekwencjami donorowymi. Bardziej dokładnie, mysie regiony zmienne łańcuchów ciężkich i lekkich wykazują podobną ogólną procentową homologię do najbliższego dopasowania ludzkich genów linii zarodkowej (85% -93%) w porównaniu z homologią humanizowanych przeciwciał i białkowymi sekwencjami donorowymi hybrydoma (74% 83%).

TABELA 2

<td>mAb</td><td>Homologia względem ludzkiego (akceptor CDR)</td><td>Homologia względem mysiego rodzicielskiego (donor CDR)</td>

<td>hSC16.13 HC</td><td>93%</td><td>81%</td>

<td>hSC16.13 LC</td><td>87%</td><td>77%</td>

<td>hSC16.15 HC</td><td>85%</td><td>83%</td>

<td>hSC16.15 LC</td><td>85%</td><td>83%</td>

<td>hSC16.25 HC</td><td>91%</td><td>83%</td>

<td>hSC16.25 LC</td><td>85%</td><td>79%</td>

<td>hSC16.34 HC</td><td>87%</td><td>79%</td>

<td>hSC16.34 LC</td><td>85%</td><td>81%</td>

<td>hSC16.56 HC</td><td>87%</td><td>74%</td>

<td>hSC16.56 LC</td><td>87%</td><td>76%</td>

122

EP 2 817 338 B1 [0548] Po badaniu i jak zostanie to omówione bardziej szczegółowo poniżej, każdy z humanizowanych konstruktów wykazywał korzystne właściwości wiązania mniej więcej porównywalne do tych wykazanych przez mysie przeciwciała rodzicielskie.

[0549] Czy humanizowane czy mysie, gdy sekwencje kwasów nukleinowych regionów zmiennych są określone, przeciwciała według niniejszego ujawnienia mogą być wyrażane i izolowane z zastosowaniem technik znanych w dziedzinie. W tym celu syntetyczne fragmenty DNA wybranego regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (humanizowanego lub mysiego) sklonowano w wektorze ekspresyjnym ludzkiej IgG1. Podobnie fragment DNA regionu zmiennego łańcucha lekkiego (znów humanizowanego lub mysiego) sklonowano do wektora ekspresyjnego ludzkiego łańcucha lekkiego. Wybrane przeciwciało było następnie wyrażane przez ko-transfekcję do komórek CHO otrzymanych konstruktów kwasów nukleinowych łańcucha ciężkiego i lekkiego.

[0550] Bardziej szczegółowo, jedna kompatybilna metoda wytwarzania przeciwciał obejmowała ukierunkowane klonowanie mysich lub humanizowanych genów regionu zmiennego (amplifikowanych z zastosowaniem PCR) do wybranych wektorów ekspresyjnych ludzkiej immunoglobuliny. Wszystkie startery stosowane w specyficznych wobec genu Ig PCR obejmowały miejsca restrykcyjne, które umożliwiały bezpośrednie klonowanie do wektorów ekspresyjnych zawierających ludzkie regiony stałe łańcucha ciężkiego i łańcucha lekkiego IgG1. Pokrótce, produkty PCR oczyszczano za pomocą zestawu Qiaquick PCR purification kit (Qiagen), a następnie trawiono odpowiednio AgeI i Xhol (dla łańcucha ciężkiego) oraz XmaI i DraIII (dla lekkiego łańcucha). Trawione produkty PCR oczyszczono przed ligacją do wektorów ekspresyjnych. Reakcje ligacji przeprowadzono w całkowitej objętości 10 pl z zastosowaniem 200 U ligazy DNA T4 (New England Biolabs), 7,5 pl strawionego i oczyszczonego specyficznego dla genu produktu PCR i 25ng zlinearyzowanego wektora DNA. Ko mpetentne bakterie E. coli DH10B (Life Technologies) transformowano via szok cieplny w 42°C z 3 pl produktu ligacji i wysiano na płytki z dodatkiem ampicyliny (100 pg/ml). Fragment AgeI-EcoRI regionu VH wprowadzono następnie do tych samych miejsc wektora ekspresyjnego pEE6.4HuIgG1 podczas gdy syntetyczną wstawkę XmaI-DraIII VK wklonowano do miejsc XmaI-DraIII odpowiedniego wektora ekspresyjnego pEE12.4Hu-Kappa.

[0551] Komórki wytwarzające wybrane przeciwciało wytwarzano przez transfekcję komórek HEK 293 odpowiednimi plazmidami z zastosowaniem 293fectin. W tym względzie plazmidowy DNA oczyszczono na kolumnach QIAprep Spin (Qiagen). Komórki ludzkiej zarodkowej nerki (HEK) 293T (Nr ATCC CRL-11268) hodowano na 150 mm płytkach (Falcon, Becton Dickinson) w standardowych warunkach w pożywce Eagle'a zmodyfikowanej przez Dulbecco (DMEM) uzupełnionej 10% inaktywowanym termicznie FCS, 100 pg/ml streptomycyny , 100 U/ml penicyliny G (wszystkie z Life Technologies).

[0552] Do przejściowych transfekcji komórki hodowano do 80% konfluencji. Równe ilości IgH i odpowiadającego im DNA wektora łańcucha IgL (12,5 pg każdego) dodano do 1,5 ml Opti-MEM zmieszanego z 50 pl odczynnika do transfekcji HEK 293 w 1,5 ml opti-MEM. Mieszaninę inkubowano przez 30 minut w temperaturze pokojowej i równomiernie rozprowadzono na płytce hodowlanej. Supernatanty zebrano trzy dni po transfekcji, zastąpiono 20 ml świeżej DMEM uzupełnionej 10% FBS i zebrano ponownie w 6 dniu po transfekcji. Supernatanty hodowlane oczyszczono ze szczątków komórek przez odwirowanie przy 800 x g przez 10 minut i przechowywano w 4°C. Rekombinowane chimeryczne i humanizowane przeciwciała oczyszczo no z perełkami Protein G (GE Healthcare) i przechowywano w odpowiednich warunkach.

Przykład 9

123

EP 2 817 338 B1

Właściwości modulatorów DLL3 [0553] W celu zbadania właściwości wiążących i immunochemicznych wybranych modulatorów DLL3, zastosowano różne metody jak przedstawione powyżej. Specyficznie, wiele modulatorów będących przeciwciałami scharakteryzowano pod względem powinowactwa, kinetyki, grupowania ze względu na epitop, lokalizacji wiązania i reaktywności krzyżowej w odniesieniu do rozpoznawania antygenu ludzkiego, małpy cinomolgus, szczurzego i mysiego (tj. stosując komórki i konstrukty z Przykładu 6) za pomocą metod znanych w dziedzinie, w tym cytometrii przepływowej. Powinowactwa i stałe kinetyczne kon i koff wybranych modulatorów mierzono stosując analizę interferometrii warstwy biologicznej na ForteBio RED (ForteBio, Inc.) lub rezonans plazmonów powierzchniowych z zastosowaniem Biacore 2000, zgodnie z instrukcjami producenta.

[0554] Wyniki charakterystyki przedstawiono w formie tabelarycznej na FIG. 12, gdzie można zauważyć, że wybrane modulatory na ogół wykazywały stosunkowo wysokie powinowactwa w zakresie nanomolarnym i w wielu przypadkach były reaktywne krzyżowo. Na FIG. 12 wymieniono ponadto empirycznie określoną grupę epitopową modulatora, jak również domenę DLL3 związaną z przedmiotowym modulatorem, określoną z zastosowaniem ekspresji fragmentu antygenu za pośrednictwem drożdży, tak jak opisano bardziej szczegółowo w Przykładzie 10 bezpośrednio poniżej. Dodatkowo, FIG. 12 obejmuje ponadto zdolność modulatorów do pośredniczenia w cytotoksycznym indukowanym zabijaniu komórek linii nowotworowej nerki NTX (% żywych komórek), określoną jak przedstawiono w Przykładzie 12 poniżej. Łącznie te dane wykazują różnorodne właściwości wiązania ujawnionych modulatorów, jak również ich potencjał do zastosowania w dziedzinie farmaceutycznej.

[0555] W odniesieniu do grupowania przeciwciała ze względu na epitop zastosowano ForteBio RED zgodnie z instrukcjami producenta w celu identyfikacji konkurujących przeciwciał, które wiązały się z tymi samymi lub różnymi grupami epitopowymi . W skrócie, przeciwciało odniesienia (Ab1) wychwycono na antymysim czipie do wychwytywania przeciwciał, następnie zastosowano wysokie stężenie nie wiążącego przeciwciała w celu zablokowania czipa i zebrano dane wyjściowe. Następnie monomeryczne rekombinowane ludzkie DLL3-Flag (Adipogen International) wychwycono za pomocą specyficznego przeciwciała (Ab1), a końcówkę zanurzono w studzience albo z tym samym przeciwciałem (Ab1) jako kontrolą albo w studzience z innym przeciwciałem testowym (Ab2). Jeśli zaobserwowano dodatkowe wiązanie z nowym przeciwciałem, wtedy Ab1 i Ab2 określono, że są w innej grupie epitopowej. Jeśli nie wystąpiło żadne dalsze wiązanie, jak określono przez porównanie poziomów wiązania z kontrolą Ab1, wtedy określono, że Ab2 jest w tej samej grupie epitopowej. Jak wiadomo w dziedzinie ten proces można rozszerzyć do badania przesiewowego dużych bibliotek unikalnych przeciwciał z zastosowaniem pełnego rzędu przeciwciał reprezentujących unikatowe grupy epitopowe w 96-studzienkowej płytce. W niniejszym przypad ku ten proces grupowania ze względu na epitop wykazał, że przesiane przeciwciała wiązały się z co najmniej dziewięcioma różnymi grupami epitopowymi (oznaczo nymi jako grupa epitopowa A przez 1 na FIG. 12) na białku DLL3. Na podstawie pozornej wielkości antygenu DLL3 (gdzie BCD ma około 56 kD) i zastosowanej metodologii grupowania ze względu na epitop, uważa się, że dziewięć zidentyfikowanych grup epitopowych stanowi większość grup epitopowych obecnych na zewnątrzko mórkowym antygenie DLL3. [0556] Oprócz oceny przykładowych modulatorów przedstawionych powyżej, przeprowadzono cytometrię przepływową, w celu potwierdzenia, że wybrane modulatory będące przeciwciałem SC16 mogą immunospecyficznie łączyć się z ludzkim DLL3 i określenia, czy te same modulatory reagują krzyżowo z DLL3 Cynomolgus, szczurzym i/lub mysim. Bardziej szczegółowo przykładowe mysie modulatory

124

EP 2 817 338 B1 analizowano za pomocą cytometrii przepływowej, z zastosowaniem FACSCanto II i komórek 293 wykazujących nadmierną ekspresję DLL3 mysiego, szczurzego, Cynomolgus lub ludzkiego (tj. H293-hDLL3, h293-cDLL3, h293-rDLL3 i h293-mDLL3 wyrażających GFP) zasadniczo jak opisane w Przykładzie 6 powyżej. W niektórych przypadkach, przykładowe mysie modulatory analizowano za pomocą cytometrii przepływowej, stosując FACSCanto II i komórki drożdży wykazujące DLL3 Cynomolgus, stosując metody opisane przez Cochran i wsp., (J Immunol Methods. 287 (1-2): 147-158 (2004).

[0557] Na podstawie cytometrii przepływowej stwierdzono, że wszystkie z wybranych modulatorów będących przeciwciałami wiążą się z ludzkim DLL3 nadmiernie wyrażanym się na komórkach 293 (dane nie pokazane), podczas gdy stwierdzono, że wiele badanych przeciwciał reaguje krzyżowo z DLL3 Cynomolgus i/lub mysim (wszystkie przeciwciała reagujące z mysim reagowały również ze szczurzym). W tym względzie, jak wymieniono na FIG. 12, stwierdzono, że osiem z trzynastu modulatorów, które immunospecyficznie reagują z ludzkim DLL3 reaguje również z mysim (lub szczurzym) DLL3. W szczególności stwierdzono, że mAb SC16.4, SC16.8, SC16.15, SC16.34, SC16.39, SC16.46, SC16.51 i SC16.56 reagują krzyżowo z mysim DLL3 w większym lub mniejszym stopniu, podczas gdy mAb SC16.7, SC16.10, SC16.13, SC16.25 i SC16.65 nie łączą się znacząco z mysim DLL3. Takie wyniki nie są nieoczekiwane, biorąc pod uwagę, że mysie DLL3 jest w około 83% homologiczne z izoformą 2 ludzkiego DLL3 (patrz FIG. 2B). Należy zauważyć, że ta reaktywność krzyżowa może być korzystnie wykorzystywana w kontekście niniejszego wynalazku poprzez zastosowanie modeli zwierzęcych w odkrywaniu i opracowywaniu leków.

[0558] Poza wymienionymi testami, analizowano humanizowane konstrukty hSC16.13, hSC16.15, hSC16.25, hSC16.34 i hSC16.56 z Przykładu 8 w celu określenia, czy proces wszczepiania CDR znacznie zmienił ich charakterystykę wiązania. W tym kontekście humanizowane konstrukty (z wszczepionym CDR) porównywano z "tradycyjnymi" chimerycznymi przeciwciałami, zawierającymi mysie rodzicielskie (lub donorowe) domeny zmienne łańcucha ciężkiego i lekkiego i ludzki region stały zasadniczo równoważny z zastosowanym w humanizowanych konstruktach. Z tymi konstruktami przeprowadzono rezonans plazmonów powierzchniowych (SPR) z zastosowaniem Biacore 2000 (GE Healthcare) w celu zidentyfikowania subtelnych zmian stałych szybkości spowodowanych procesem humanizacji.

[0559] Przykładowe wyniki dla jednego z badanych modulatorów (SC16.15) i tabelaryczne podsumowanie wyników dla każdego z humanizowanych i chimerycznych konstruktów przedstawiono na FIG. 13A - 13C. Na podstawie serii stężeń 25 i 12,5 nM ludzkiego antygenu DLL3 (generując ych krzywe od góry do dołu na FIG. 13A i 13B dla SC16.15) i stosując model wiązania Langmuir 1: 1, KD przeciwciała SC16.15 wiążącego się z ludzkim antygenem DLL3 oszacowano na 0,2 nM. Podobne doświadczenia prowadzono następnie z innymi humanizowanymi konstruktami i chimerycznymi konstruktami (dane nie pokazane) w celu dostarczenia wartości powinowactwa przedstawionych na FIG. 13C. Wyniki takie wskazywały, że proces humanizacji nie wpływał istotnie na powinowactwo modulatorów.

Przykład 10

Mapowanie domen i epitopów modulatorów DLL3 [0560] W celu scharakteryzowania i umiejscowienia epitopów, z którymi ujawnione przeciwciałowe modulatory DLL3 łączą się lub wiążą, przeprowadzono mapowanie epitopów na poziomie domeny stosując modyfikację protokołu opisanego przez Cochran i wsp., 2004 (powyżej). W skrócie poszczególne domeny DLL3 zawierające konkretne sekwencje aminokwasowe zostały wyrażone na powierzchni drożdży, a wiązanie przez każde przeciwciało DLL3 zostało określone przez cytometrię przepływową.

125

EP 2 817 338 B1 [0561] Bardziej szczegółowo, wytworzono konstrukty plazmidowe prezentacji drożdżowej w celu ekspresji następujących konstruktów: domena zewnątrzko mórkowa DLL3 (aminokwasy 27-466); chimera DLL1-DLL3, która składa się z regionu N-końcowego i domeny DSL DLL1 (aminokwasy 22-225) sfuzowanej z domenami EGF-podobnymi 1 do 6 DLL3 (aminokwasy 220-466); chimera DLL3-DLL1, która składa się z regionu Nkońcowego i domeny DSL DLL3 (aminokwasy 27-214) sfuzowanych z domenami EGF-podo bny mi 1 do 8 DLL1 (aminokwasy 222-518); domena EGF-podobna # 1 (aminokwasy 215-249); domena EGF-podobna # 2 (aminokwasy 274-310); domena EGF-podobna # 1 i # 2 (aminokwasy 215-310); domena EGF-podobna # 3 (aminokwasy 312-351); domena EGF-podobna # 4 (aminokwasy 353-389); domena EGF-podobna # 5 (aminokwasy 391-427); i domena EGF-podobna # 6 (aminokwasy 429-465). (Po informacje na temat domeny patrz ogólnie wejście Q9NYJ7 bazy danych UniProtKB/Swiss-Prot. Należy zauważyć, że numeracja aminokwasów jest odniesieniem do niepoddanego obróbce białka DLL3 z sekwencją liderową, taką jak przedstawiona w SEKW. NR ID 3). Do analizy regionu N-końcowego lub domen EGF jako całości, chimery z członkiem rodziny DLL1 (DLL1 -DLL3 i DLL3-DLL1) zastosowano w przeciwieństwie do fragmentów, aby zminimalizować potencjalne problemy ze zwijaniem białka. Poprzednio wykazano, że przeciwciała ze zmapowanymi domenami nie reagują krzyżowo z DLL1 wskazując, że jakiekolwiek wiązanie się z tymi konstruktami miało miejsce dzięki związaniu z częścią DLL3 konstruktu. Plazmidy te transformowano do drożdży, które następnie hodowano i indukowano jak opisano w Cochran i wsp.

[0562] Aby przetestować wiązanie z konkretnym konstruktem, 200000 indukowanych komórek drożdży wyrażających po żądany konstrukt przemyto dwukrotnie w PBS + 1 mg/ml BSA (PBSA) i inkubowano w 50 μl PBSA z biotynylowanym klonem 3F10 anty-HA (Roche Diagnostics) przy stężeniu 0,1 μg/ml i albo 50 nM oczyszczonego przeciwciała albo rozcieńczeniem 1:2 nieoczyszczonego supernatantu z hybrydoma hodowanych przez 7 dni. Komórki inkubowano przez 90 minut na lodzie, po czym nastąpiły 2 płukania w PBSA. Komórki inkubowano następnie w 50 μl PBSA z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi: dla mysich przeciwciał, streptawidynę skoniugowaną z Alexa 488 oraz kozie anty-mysie przeciwciało skoniugowane z Alexa 647 (obydwa z firmy Life Technologies) dodano przy 1 μg/ml każde, a dla humanizowanych lub chimerycznych przeciwciał, streptawidynę skoniugowaną z Alexa 647 (Life Technologies) i kozie anty-ludzkie przeciwciało skoniugowane z z R-fikoerytryną (Jackson Immunoresearch) dodano przy 1 μg/ml każde. Po dwudziestominutowej inkubacji na lodzie komórki przemyto dwukrotnie PBSA i analizowano na FACS Canto II. Przeciwciała, które wiązały się z chimerą DLL3-DLL1 zostały oznaczone jako wiążące się z regionem N-końcowym + DSL. Przeciwciała, które specyficznie wiązały się z epitopem obecnym na konkretnej domenie EGF-podobnej, zostały oznaczone jako wiążące się z jego odpowiednią domeną (FIG. 14A).

[0563] W celu sklasyfikowania epitopu jako konformacyjny (np. nieciągły) lub liniowy, drożdże prezentujące zewnątrzkomórkową domenę DLL3 poddano obróbce cieplnej przez 30 minut w 80°C, a następnie przemyto dwukrotnie w lodowatym PBSA. Drożdże prezentujące zdenaturowany antygen (zdenaturowane drożdże) poddano następnie temu samemu protokołowi barwienia i analizie cytometrią przepływową, jak opisano powyżej. Przeciwciała, które wiązały zarówno zdenaturowane, jak i natywne drożdże, zostały sklasyfikowane jako wiążące się z epitopem liniowym, podczas gdy przeciwciała, które wiązały drożdże natywne, ale nie zdenaturowane drożdże, zostały sklasyfikowane jako konformacyjnie specyficzne.

[0564] Schematyczne podsumowanie danych dotyczących mapowania epitopów na poziomie domeny, badanych przeciwciał, przedstawiono na FIG. 14A, z podkreślonymi przeciwciałami wiążącymi liniowy epitop i, gdzie to określono, odpowiednią grupą epitopową zanotowaną w nawiasie. Przegląd FIG. 14A pokazuje,

126

EP 2 817 338 B1 że większość modulatorów miała tendencję do mapowania do epitopów znajdujących się w regionie Nkońcowym/DSL DLL3 lub do drugiej domeny EGF-podobnej. Jak poprzednio nawiązano, na FIG. 12 przedstawiono podobne dane dotyczące określania grupy epitopowej i mapowania domen dla szeregu wybranych modulatorów w formie tabelarycznej.

[0565] W celu udokumentowania zdolności ujawnionych modulatorów do skutecznego wyeliminowania komórek nowotworowych pomimo wiązania się z różnymi regionami DLL3, dane dotyczące zabijania korelowały z domeną wiązania. Bardziej szczegółowo, na FIG. 14B przedstawiono zabijanie in vitro linii PDX KDY66 (otrzymanej jak przedstawiono w Przykładzie 12 poniżej), w którym pośredniczy modulator, wykreślone wobec domeny wiążącej wybranego modulatora. Te dane wskazują, że specyficzne wobec domeny zabijanie, w którym pośredniczy modulator, jest nieco zmienne, jak mierzone z zastosowaniem tego testu do zabijania in vitro. Jednak w przypad ku skutecznych modulatorów pojawia się ciekawy trend, w którym maksymalne zabijanie w każdej domenie wzrasta wraz ze przemieszczeniem się epitopu w kierunku N-końca w pierwotnej sekwencji. W szczególności, maksymalna skuteczność zabijania poprawia się od EGF6 do EGF2 i osiąga fazę plateau w domenie N-końcowej, EGF1 i EGF2. Dodatkowo z przeciwciał zbadanych w tym teście najwyżs zy odsetek skutecznych przeciwciał wiąże się w domenie N-końcowej. To sugeruje, że modulatory, które łączą się lub wiążą z domeną DSL lub regionem N-końcowym DLL3 mogą okazać się szczególnie skuteczne jako leki lub jako grupy docelowe dla środków cytotoksycznych.

[0566] Dokonano dokładnego mapowania epitopów na wybranych przeciwciałach stosując jedną z dwóch metod. W pierwszej metodzie zastosowano zestaw biblioteki peptydowej prezentacji fagowej Ph.D.-12 (New England Biolabs E8110S), stosowany zgodnie z instrukcjami producenta. W skrócie, przeciwciało do mapowania epitopów powleczono przez noc przy 50 μg/ml w 3 ml 0,1 M roztworu wodorowęglanu sodu, pH 8, na probówkę Nunc MaxiSorp (Nunc). Probówkę zablokowano 3% roztworem BSA w roztworze wodorowęglanu. Następnie umożliwiono wiązanie 10¹¹ fagów wejściowych w PBS + 0,1% Tween-20, po którym nastąpiło dziesięć kolejnych płukań przy 0,1% Tween-20 w celu wymycia niezwiązanego faga. Pozostałe fagi eluowano 1 ml 0,2 M glicyny przez 10 minut w temperaturze pokojowej z łagodnym mieszaniem, a następnie zobojętniono 150 μl 1 M Tris-HCl pH 9. Eluowane fagi ponownie amplifikowano i ponownie poddano panningowi 10¹¹ wejściowego faga, stosując 0,5% Tween-20 podczas etapów płukania w celu zwiększenia ostrości wyboru. DNA z 24 łysinek eluowanego faga z drugiej rundy wyizolowano stosując zestaw Qiaprep M13 Spin kit (Qiagen) i zsekwencjonowano. Wiązanie klonalnego faga potwierdzono stosując test ELISA, gdzie zmapowane przeciwciało lub przeciwciało kontrolne powleczono na płytce ELISA, blokowano i eksponowano na każdy klon faga. Wiązanie faga wykrywano z zastosowaniem przeciwciała anty-M13 skoniugowanego z peroksydazą chrzanową (GE Healthcare) oraz roztworu 1-Step Turbo TMB ELISA (Pierce). Sekwencje peptydowe faga ze specyficznie wiążącego faga dopasowano stosując Vector NTI (Life Technologies) wobec sekwencji peptydowej antygenu ECD w celu określenia epitopu wiązania. [0567] Alternatywnie, metodę prezentacji drożdżowej (Chao i wsp., Nat Protoc. 1 (2): 755-768, 2007) zastosowano do mapowania epitopów wybranych przeciwciał. W skrócie, biblioteki mutantów ECD DLL3 wytworzono za pomocą podatnego na błędy PCR, stosując analogi nukleotydowe 8-okso2'deoksyguanozyno-5'-trifosforan i 2'-deoksy-p-nukleozydo-5'-trifosforan (obydwa z firmy TriLink Bio) dla docelowej szybkości mutagenezy wynoszącej jedną mutację aminokwasową na klon. Zostały one stransformowane do formatu prezentacji drożdżowej. Stosując techniki opisane powyżej dla mapowania na poziomie domeny bibliotekę barwiono na HA i przeciwciało wiążące przy 50 nM. Za pomocą FACS Aria (BD) sortowano klony, które wykazały utratę wiązania w porównaniu z ECD DLL3 typu dzikiego. Te klony

127

EP 2 817 338 B1 ponownie hodowano i poddano kolejnej rundzie sortowania FACS na utratę wiązania z docelowym przeciwciałem. Z zastosowaniem zestawu Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep kit (Zymo Research) wyizolowano i zsekwencjonowano poszczególne klony BCD. Tam gdzie to konieczne, mutacje były ponownie formatowane jako pojedyncze klony-mutanty ECD z zastosowaniem zestawu Quikchange site directed mutagenesis kit (Agilent).

[0568] Poszczególne klony ECD były następnie przeszukiwano w celu określenia, czy utrata wiązania była spowodowana mutacją w epitopie, czy mutacją, która powodowała nieprawidłowe zwijanie. Mutacje obejmujące cysteinę, prolinę i kodony stop zostały automatycznie odrzucone ze względu na duże prawdopodobieństwo wystąpienia mutacji z nieprawidłowym zwijaniem. Pozostałe klony ECD następnie przeszukiwano pod kątem wiązania się z niekonkurującym, specyficznym konformacyjnie przeciwciałem. Uznano, że klony ECD, które utraciły wiązanie się z nieskonkurującym, specyficznym konformacyjnie przeciwciałem, zawierają mutacje prowadzące do nieprawidłowego zwijania, podczas gdy klony ECD zachowujące równoważne wiązanie jak ECD DLL3 typu dzikiego zostały uznane za prawidłowo zwinięte. W tej ostatniej grupie stwierdzono, że mutacje w klonach ECD znajdują się w epitopie. Wyniki są wymienione bezpośrednio poniżej w Tabeli 3.

TABELA 3

<td>Klon przeciwciała</td><td>Epitop</td><td>SEKW. NR ID:</td>

<td>SC16.23</td><td>Q93, P94, G95, A96, P97</td><td>9</td>

<td>SC16.34</td><td>G203, R205, P206</td><td>10</td>

<td>SC16.56</td><td>G203, R205, P206</td><td>10</td>

[0569] Bardziej szczegółowo podsumowanie wybranych przeciwciał z ich otrzymanymi epitopami zawierającymi reszty aminokwasowe zaangażowane w wiązanie przeciwciała są wymienione w TABELI 3. W tym kontekście przeciwciała SC16.34 i SC16.56 najwyraźniej oddziałują ze wspólnymi resztami aminokwasowymi, co jest zgodne z informacją dotyczącą grupowania ze względu na epitop i mapowania domen przedstawionych na FIG. 14A. Ponadto stwierdzono, że SC16.23 oddziałuje z odrębnym epitopem ciągłym i nie znaleziono go w grupie epitopowej z SC16.34 lub SC16.56. Należy zauważyć, że dla celów dodanej listy sekwencji SEKW. NR ID: 10 będzie zawierać aminokwas zastępczy w pozycji 204.

Przykład 11

Wykrywanie DLL3 oparte na cytometrii przepływowej na powierzchni komórek i barwienie immunohistochemiczne DDL3 w guzach [0570] W celu potwierdzenia charakteru immunospecyficznego ujawnionych modulatorów, zbadano przykładowe modulatory przeciwciała SC16 z zastosowaniem cytometrii przepływowej, w celu określenia ich zdolności do selektywnego rozpoznawania zmodyfikowanych linii komórkowych 293 wyrażających na swojej powierzchni białko DLL3. W tym kontekście komórki wyrażające DLL3 zostały wytworzone jak zasadniczo przedstawiono w Przykładzie 6, eksponowano na wybrane modulatory i badano metodą cytometrii prze pływowej, jak opisano w niniejszym dokumencie. W celu potwierdzenia specyficzności barwienia zastosowano kontrole barwione izotypowo i fluorescencji minus jeden (FMO). Jak pokazano za pomocą reprezentatywnych danych przedstawionych na FIG. 15 dla modulatora SC16.56, niektóre z przeciwciał SC16 (np. SC16.56) dały silne barwienie komórek 293-hDLL3 (FIG. 15B) i komórek 293-mDLL3 (FIG. 15C), 128

EP 2 817 338 B1 ale nie komórek rodzicielskich 293 niewyrażających DLL3 (FIG. 15A). Te dane pokazują via cytometria przepływowa, że ujawnione modulatory immunospecyficznie rozpo znają ludzki DLL3, a w przypadku

SC16.56, również mysie DLL3.

[0571] W celu potwierdzenia tych wniosków i wykazania, że ekspresję DLL3 można wykryć na ludzkich komórkach nowotworowych, ekspresję białka DLL3 na powierzchni wybranych guzów NTX oceniano metodą cytometrii przepływowej z zastosowaniem kilku przykładowych przeciwciał SC16. W tym celu dane dla jednego z tych przeciwciał, SC16.56 i trzy konkretne nowotwory, OV26, KDY66 i LU37 przedstawiono na FIG. 16. Bardziej szczegółowo, guzy NTX zbierano, rozdzielano i współbarwiono dostępnymi w handlu antymysim CD45, anty-mysim H-2Kd, anty-ludzkim EpCAM i opisanymi powyżej anty-ludzkimi/mysimi przeciwciałami DLL3 (SC16.56). Podobnie do opisanych powyżej doświadczeń barwienia 293, zastosowano kontrole barwione izotypowo i fluorescencji minus jeden (FMO) w celu potwierdzenia braku barwienia niespecyficznego. Jak widać na FIG. 16, barwienie anty-DLL3 było większe we frakcji ludzkich komórek nowotworowych NTX, jak wskazywało przesunięcie profilu fluorescencyjnego na prawo i zmiana wartości średniej intensywności fluorescencji (MFI) dla linii komórek nowotworowych jajników OV26 NTX (FIG. 16A), nerki KDY66 NTX (FIG. 16B) i płuca LU37 NTX (FIG. 16C). Guzy SCLC NTX były również barwione w identyczny sposób i podobnie wykazały dodatnią ekspresję DLL3 (dane nie przedstawione). Te dane sugerują, że białko DLL3 jest wyrażane na powierzchni różnych nowotworów NTX, a zatem podatne na modulowanie z zastosowaniem modulatorów typu przeciwciało anty-DLL3.

[0572] W celu dalszego potwierdzenia obecności białka DLL3 i zlokalizowania go w strukturze nowotworu, przeprowadzono immunohistochemię (IHC) na guzach NTX pochodzących od nowotworów pacjentów będących ludźmi, normalnych tkankach ludzkich i pierwotnych nowotworach SCLC. Bardziej szczegółowo IHC przeprowadzono na zatopionych w parafinie, utrwalonych w formalinie wycinkach tkanek (FFPE), stosując metodę wykrywania pośredniego, obejmującą mysie monoklonalne przeciwciało pierwszorzędowe przeciwko DLL3 (SC16.65), przeciwciała drugorzędowe skoniugowane z biotyną specyficzne wobec myszy, kompleks awidyna/biotyna sprzężony z peroksydazą chrzanową, amplifikację sygnału tyramidowego i wykrywanie DAB (Nakene PK 1968, 16: 557-60). Podczas barwienia guzów NTX pochodzących z nowotworów pacjenta będącego człowiekiem, zastosowano etap blokowania mysiego IgG w celu zmniejszenia tła ze względu na niespecyficzne wiązanie. SC16.65 najpierw walidowano i potwierdzono, że jest właściwe do IHC, wykazując specyficzne wybarwienie w ko mó rkach 293 nadmiernie wyrażających DLL3, ale nie w komórkach rodzicielskich 293 niewyrażających DLL3 i że wybarwienie zmniejszyło się w komórkach traktowanych szpilkami do włosów ukierunkowanymi na DLL3 zaprojektowanymi i walidowanymi do znokautowania ekspresji RNA i białka DLL3 (patrz Przykład 14 poniżej, dane nie przedstawione). IHC na panelu przeszczepów heterologicznych guzów NTX wykazało, że DLL3 zlokalizowane jest zarówno na błonie, jak i w cytoplazmie wielu nowotworów SCLC NTX i NET, które wcześniej były dodatnie pod kątem mRNA DLL3 (FIG. 16D). Intensywność wybarwienia punktowano od braku zabarwienia (-) do wysokiej ekspresji (+++), z procentowym udziałem dodatnich komórek. Barwienie normalnych tkanek ludzkich nie wykazywało wykrywalnej ekspresji DLL3 (FIG. 16E). Znacząco, barwienie pierwotnych próbek guzów SCLC potwierdziło, że 36/43 guzów było dodatnich wobec DLL3 (FIG. 16F). Przeprowadzono również barwienie chromagraniną A (CHGA) w celu potwierdzenia, że guzami były rzeczywiście guzy SCLC. Większość guzów, w których brakowało DLL3 również brakowało wybarwienia CHGA, wskazując, że te sekcje mogą nie zawierać tkanki nowotworowej lub że tkanka była naruszona podczas obróbki. Dwa guzy, które były dodatnie wobec DLL3, ale ujemne wobec CHGA, obydwa były guzami SCLC późniejszego stadium (IIIa). Dane te

129

EP 2 817 338 B1 sugerują, że DLL3 dostarcza skutecznego celu terapeutycznego, ponieważ nie jest zazwyczaj wyrażany w normalnych tkankach ludzkich, ale jest obecny w większości guzów SCLC.

Przykład 12

Modulatory DLL3 ułatwiają dostarczanie środków cytotoksycznych [0573] W celu określenia, czy modulatory przeciwciałowe DLL3 według niniejszego ujawnienia mogą pośredniczyć w dostarczaniu środka cytotoksycznego do żywych komórek, przeprowadzono test zabijania komórek in vitro z zastosowaniem losowo wybranych modulatorów przeciwciałowych DLL3.

[0574] Konkretnie, 2500 komórek/studzienkę ludzkiego KDY66, NET NTX wyrażającego endogenne DLL3, rozdzielono do zawiesiny pojedynczych komórek i wysiano na płytkach BD Primaria™ (BD Biosciences) w wolnej od surowice pożywce uzupełnionej czynnikiem wzrostu, co jest znane w tej dziedzinie, jeden dzień przed dodaniem przeciwciał i toksyny. Różne stężenia oczyszczonych modulatorów DLL3, takich jak te opisane w Przykładach 6 i 7 i stałe stężenie wynoszące 4nM anty-mysiego fragmentu Fab IgG kowalencyjnie połączonego z toksyną - saporyną (Advanced Targeting Systems, # IT-48) dodano do hodowli na siedem dni. Do zabijania na 293-hDLL3, 500 komórek/studzienkę wysiano w zawiesinie pojedynczych komórek i wysiano na płytki do hodowli tkankowej BD w DMEM z 10% FBS jeden dzień przed dodaniem przeciwciał i toksyny. Do hodowli dodano na trzy dni dwa stężenia różnych modulatorów DLL3 i stałe stężenie wynoszące 2nM anty-mysiego fragmentu Fab IgG kowalencyjnie połączonego z saporyną. Zdolność kompleksów saporyny do internalizacji i zabijania komórek określano przez zliczenie liczby żywotnych komórek z zastosowaniem Cell Titer Glo® (Promega) zgodnie z instrukcjami producenta. Surowe zliczenia luminescencji z zastosowaniem hodowli zawierających komórki z frag me nte m Fab-saporyna, ustalono jako 100% wartości odniesienia, a wszystkie inne zliczenia odpowiednio obliczono (określane jako "znormalizowane RLU"). Z zastosowaniem tego testu wykazano, że podzbiór przeciwciał DLL3 testowanych przy 500 i 50 pM zabił komórki KDY66, jak również podzbiór przeciwciał testowanych przy 250 i 25 pM na komórkach 293 nadmiernie wyrażających hDLL3 (FIG. 17A). Kontrole izotypowe nie wpływały na liczebność komórek, jak pokazano za pomocą słupków IgG2a, IgG2b i MOPC po lewej stronie wykresu (FIG. 17A). [0575] Podzbiór modulatorów DLL3 wykazujących skuteczne zabijanie w pierwszym teście opisanym powyżej testowano na aktywność w rozcieńczeniu do określonych wartości EC50. Dwa takie reprezentatywne przeciwciała, SC16.34 i SC16.15, przedstawiono na FIG. 17B, na której ustalono, że SC16.15 wykazały skuteczne zabijanie OV26, nowotworu NET NTX jajnika, z subpikomolarnym EC50 (np. 0,14 pM) względem profilu zabijania wykazanego przez SC16,34 (np. 5,7 pM). Ponieważ saporyna zabija komórki tylko po pobraniu do cytoplazmy, gdzie inaktywuje rybosomy, test ten pokazuje również, że internalizacja może wystąpić po związaniu przeciwciała swoistego wobec DLL3 do powierzchni komórki, bez potrzeby dodatkowego sieciowania lub dimeryzacji.

[0576] Wreszcie LU37 traktowano humanizowanym SC16.15 skoniugowanym z ADC1 lub z ADC1 humanizowanym kontrolnym IgG1 (skoniugowanym jak w Przykładzie 13 bezpośrednio poniżej). Konkretnie, 2500 komórek LU37 NTX umieszczono w każdej studzience na płytkach BD PrimariaTM (BD Biosciences) w wolnej od surowicy pożywce uzupełnionej czynnikiem wzrostu, co jest znane w dziedzinie, na jeden dzień przed dodaniem skoniugowanych przeciwciał. Do hodowli dodano różne stężenia huIgG1-ADC1 lub hSC16.15-ADC na siedem dni, a zdolność środka cytotoksycznego do zabijania określono przez zliczenie liczby komórek (jak wyszczególniono powyżej). Z zastosowaniem tego testu wykazano, że hSC16.15-ADC1

130

EP 2 817 338 B1 skutecznie zabija LU37. W przeciwieństwie do >1000ng/ml kontrolnego ADC potrzebnego do zabicia 50%

LU37, &lt;10 ng/ml hSC16.15-ADC1 zabiło 50% LU37 (FIG. 17C).

Przykład 13

Wytwarzanie koniugatów przeciwciało DLL3-lek [0577] Na podstawie powyższych wyników z saporyną i dalszej de monstracji wszechstronności niniejszego ujawnienia, koniugaty lek-przeciwciało anty-DLL3 (DLL3-ADC) wytworzono z zastosowaniem kowalencyjnie połączonych środków cytotoksycznych. Bardziej szczegółowo, wytworzono DLL3-ADC zawierające łącznik, jak opisany w niniejszym dokumencie, lub w poniższych odnośnikach oraz wybrane dimery pirolobenzodiazepiny (PBD), które zostały kowalencyjnie przyłączone do ujawnionych modulatorów (patrz np. U.S.P.Nr 2011/0256157 i 2012/0078028 i U.S.P.Nr 6,214,345).

[0578] Kombinacje łącznik-lek PBD zsyntetyzowano i oczyszczano za pomocą technik znanych w dziedzinie w świetle cytowanych odnośników. Choć różne dimery i łączniki PBD zastosowano do wytworzenia wybranych kombi nacji lek-łącznik, to każda jednostka łącząca zawierała końcowe ugrupowanie maleimidowe z wolną grupą sulfhydrylową. Z zastosowaniem tych łączników, wytworzono koniugaty via częściowa redukcja mAb za pomocą tris(2-karboksyetylo)-fosfiny (TCEP), a następnie reakcję zredukowanych reszt Cys z ładunkiem maleimido-łącznikowym.

[0579] Bardziej szczegółowo, wybrany przeciwciałowy modulator DLL3 został zredukowany 1,3 mola TCEP na mol mAb przez 2 godziny w 37°C w 25 mM Tris HCl pH 7,5 i 5 mM buforze EDTA. Reakcję pozostawiono do schłodzenia do 15°C i dodano ładunek łącznika w DMSO w stosunku 2,7 mol/mol mAb, a następnie dodatkową ilość DMSO do końcowego stężenia 6% (obj./obj.). Reakcję kontynuowano przez 1 godzinę. Nieprzereagowany lek-łącznik lek czapeczkowano przez dodanie nadmiaru N-acetylocysteiny. DLL3-ADC (lub SC16-ADC) następnie oczyszczono za pomocą kolumny jonowymiennej stosując system AKTA Explorer FPLC (G.E. Healthcare) w celu usunięcia zagregowanego przeciwciała o wysokiej masie cząsteczkowej, ws pół-rozpus zcza lnika i małych cząsteczek. Eluowany ADC poddano następnie wymianie buforu przez filtrację z przepływem stycznym (TFF) w buforze do formułowania, po czym dostosowano stężenie i dodano detergent. Końcowy ADC przeanalizowano pod kątem stężenia białka (przez pomiar UV), agregacji (SEC), stosunku leku do przeciwciała (DAR) za pomocą HPLC w fazie odwróconej (RP), obecności nieskoniugowanego przeciwciała metodą chromatografii HPLC oddziaływań hydrofobowych (HIC), niebiałkowych materiałów metodą RP HPLC i cytotoksyczności in vitro z zastosowaniem linii komórkowej wyrażającej DLL3.

[0580] Stosując wyżej wymienioną procedurę lub zasadniczo podobną metodologię, wytworzono wiele ADC (tj. M-[L-D]n) zawierających różne modulatory DLL3 i dimery PBD i testowano je w różnych modelach in vivo i in vitro. Dla celów niniejszych przykładów i niniejszych ujawnień, takie ADC można ogólnie nazwać DLL3ADC lub SC16-ADC. Odrębne identyfikatory ADC będą nazwane zgodnie z przeciwciałem (np. SC16.13) i oznaczeniem konkretnego łącznika-środka cytotoksycznego ADC1, ADC2 itp. Zatem przykładowe modulatory zgodne z niniejszym ujawnieniem mogą stanowić SC16.13-ADC1 lub SC16.67-ADC2, gdzie ADC1 i ADC2 reprezentują poszczególne środki cytotoksyczne dimerów PBD (i ewentualnie łącznik).

131

EP 2 817 338 B1

Przykład 14

Specyficzność toksyczności, w której pośredniczy koniugat przeciwciało anty-DLL3-lek [0581] W celu wykazania, że toksyczność koniugatów przeciwciało anty-DLL3-lek jest specyficzna względem komórek wykazujących ekspresję endogennego DLL3, przeprowadzono doświadczenia w celu wykazania, że komórki nowotworowe, o których wiadomo, że mają endogenną ekspresję DLL3, nie są już zabijane przez SC16-ADC in vitro, gdy ekspresja DLL3 jest tłumiona przez nokautowanie ekspresji mRNA i białka DLL3 z zastosowaniem RNA o strukturze krótkiej spinki do włosów (shRNA).

[0582] KDY66 jest przeszczepem heterologicznym pochodzącym od pacjenta z brodawkowatym rakiem nerkowokomórkowym, który wykazuje cechy neuroendokrynne i wyraża mRNA i białko DLL3 (np. patrz FIG. 7 i FIG. 16B). Ekspresja DLL3 została zmniejszona w komórkach KDY66 przez transdukcję shRNA ukierunkowanym na GIPZ lentiwirusowego ludzkiego DLL3. (Thermo Fisher Scientific Inc.) zawierającym shRNA anty-DLL3. Bardziej konkretnie wektor lentiwirusowy został wytworzony poprzez transfekcję komórek 293T bicistronowym plazmidem lentiwirusowym, wykazującym ekspresję shRNA anty-DLL3 (DLL3HP2) lub kontrolnym niewyciszającyma shRNA (DLL3NSHP) w obecności wirusowych plazmidów pakujących. Otrzymane cząstki lentiwirusowe zawarte w supernatancie zatężono i zebrano przez ultrawirowanie. Cząstki te następnie zastosowano do transdukcji hodowli komórek KDY66 i wprowadzania shRNA (tj. DLL3HP2 lub NSHP), w którym shRNA anty-DLL3 wiąże się z endogennym mRNA DLL3 i ukierunkowuje je do zniszczenia, zapobiegając tym samym translacji do białka DLL3. Obydwa konstrukty wektorowe zawierały niezależny moduł ekspresji GFP do weryfikacji udanej transdukcji i selekcji transdukowanych komórek. [0583] Po przeprowadzeniu transdukcji ekspresję DLL3 oceniano za pomocą cytometrii prze pływowej. Pokrótce, próbkę zawiesiny pojedynczych komórek, która uległa rozdzieleniu, komórek transdukowanych DLL3HP2 znakowano modulatorem DLL3 (SC16.34) skoniugowanym z Alexa Fluor 647 (Life Technologies) i analizowano na cytometrze przepływowym FACS Canto II w standardowych warunkach. Aby wykazywać zmniejszenie ekspresji białka DLL3 na powierzchni komórek transdukowanych DLL3HP2, intensywność fluorescencji porównywano z podobnie przygotowaną próbką komórek KDY66 DLL3NSHP barwionych niereaktywnym przeciwciałem kontrolnym (647-IgG1) i komórek KDY66 DLL3NSHP barwionych 647-DLL3. Stwierdzono, że komórki DLL3NSHP.KDY66 wykazywały ekspresję białka DLL3 zasadniczo odpowiadającą naiwnym komórkom KDY66 (dane nie przedstawione). Jak widać na FIG. 18A, ekspresja białka DLL3 na powierzchni została zmniejszona w komórkach transdukowanych DLL3HP2 w porównaniu z komórkami naiwnymi barwionymi tym samym przeciwciałem znakowanym AlexaFluor-647.

[0584] W celu zbadania konsekwencji ekspresji DLL3 na wzrost guza, komórki transdukowane DLL3HP2 komórki (DLL3^-) i naiwne komórki KDY66 (DLL3⁺) wszczepiono myszom z niedoborem odporności. Z próbki przygotowanej jak opisano powyżej, żywe ludzkie komórki GFP⁺ sortowano w celu zebrania komórek, które zawierają shRNA anty-DLL3. Kohortom pięciu myszy (140 komórek/mysz) wstrzyknięto albo komórki DLL3HP2 albo naiwne komórki KDY66, a wzrost guza był monitorowany co tydzień. Z każdej kohorty, u dwóch z pięciu biorców wyrosły guzy. Utworzenie guzów u dwóch biorców DLL3HP2.KDY66 było opóżnione w przybliżeniu około 22 dni po utworzeniu guza u dwóch naiwnych biorców KDY66 (FIG. 18B). To obserwowane opóźnienie wzrostu sugeruje, że ekspresja DLL3 może być połączona ze zwiększonym lub przyspieszonym tworzeniem guza, ponieważ nokaut DLL3 wpływa na wzrost guza.

[0585] Gdy osiągnęły one odpowiednią objętość do randomizacji (~ 160 mm³), guzy DLL3HP2 KDY66 i naiwne guzy KDY66 zebrano z myszy - biorców i zdyspergowano w zawiesinę pojedynczych komórek.

132

EP 2 817 338 B1

Kontynuowanie zmniejszenia ekspresji DLL3 (tj. to, że ekspresja DLL3 nie była indukowana podczas wzrostu in vivo) w komórkach DLL3HP2 potwierdzono w zawiesinach pojedynczych komórek nowotworowych za pomocą cytometrii przepływowej, jak opisano powyżej. W tym względzie na FIG. 18C pokazano, że transdukowane ko mó rki DLL3HP2 hodowane in vitro wykazują zmniejszoną ekspresję białka

DLL3 w porównaniu z komórkami naiwnymi hodowanymi w podobnych warunkach.

[0586] Stosując standardowe techniki biochemiczne, naiwne ko mó rki KDY66 lub ko mó rki DLL3HP2 KDY66 wysiano na 96-studzienkowe płytki i hodowano w pożywkach wolnych od surowicy. Do komórek w trzech powtórzeniach dodano serię rozcieńczeń koniugatów przeciwciało-lek, albo humanizowanego hSC16.56ADC1 (SC16-ADC1) albo humanizowanego IgG anty-hapten-ADC1 (jako kontrolę) wytworzonych jak przedstawiono powyżej. Po siedmiu dniach ekspozycji na koniugat przeciwciało-lek, ilość żywych komórek mierzono za pomocą wykrywania ATP na podstawie luminescencji w lizatach ko mórkowych każdej studzienki (Cell Titer Glo, Promega) zasadniczo jak przedstawiono w Przykładzie 12.

[0587] Podczas gdy 50% naiwnych komórek KDY66 zostało zabitych stosunkowo niewielką dawką 13,27 pM SC16-ADC, żadna dawka SC16-ADC1 nie była w stanie zabić nawet 20% komórek DLL3HP2.KDY66 (FIG. 18D i 18E). Warto zauważyć, że utrata ekspresji endogennego białka DLL3 spowodowała całkowitą utratę zabijania in vitro przez SC16-ADC1. Pokazuje to, że cytotoksyczność hSC16-ADC1 jest specyficznie ukierunkowana na komórki wyrażające DLL3 z niewielką, jeśli występuje, toksycznością niespecyficzną.

Przykład 15

Koniugowane modulatory DLL3 tłumią wzrost guza [0588] Na podstawie wspomnianych powyżej wyników podjęto prace w celu wykazania, że skoniugowane modulatory DLL3 według niniejszego ujawnienia zmniejszają i hamują wzrost ludzkich guzów wyrażających DLL3 in vivo. W związku z tym szereg wybranych modulatorów będących mysimi przeciwciałami było kowalencyjnie związanych ze środkiem cytotoksycznym PBD, a uzyskane ADC testowano w celu wykazania ich zdolności do tłumienia wzrostu ludzkiego guza NTX u myszy z niedoborem odporności.

[0589] W tym celu guzy NTX pochodzące od pacjenta hodowano podskórnie w pachwinach samic-biorców myszy NOD/SCID, stosując znane w tej dziedzinie techniki. Objętości guza i masy myszy monitorowano dwa razy w tygodniu. Gdy objętości guza osiągały 150-250 mm³, myszy losowo przydzielano do grup leczonych i wstrzykiwano im wskazane dawki SC16-ADC2 lub kontrolną IgG1 anty-hapten-ADC2 (każde wytworzone zasadniczo jak opisano w Przykładzie 13 powyżej, stosując dimer PBD ADC2) via wstrzyknięcie dootrzewnowe. Myszom podano trzy równe iniekcje, rozmieszczone w czasie równomiernie przez siedem dni. Po leczeniu monitorowano objętości guza i masy myszy, aż nowotwory przekroczyły 800 mm³ lub myszy zachorowały. W przypadku wszystkich testów u myszy leczonych nie wykazywano niekorzystnych skutków zdrowotnych poza tymi, które zazwyczaj występują u myszy z niedoborem odporności niosących guza NOD/SCID.

[0590] Na FIG. 19 przedstawiono wpływ ujawnionych ADC na wzrost guza u myszy niosących różne nowotwory płuc wykazujące cechy neuroendokrynne (dwa drobnokomórkowe raki płuca i jeden wielkokomórkowy rak płuca z cechami neuroendokrynnymi). Pod tym względem leczenie LU37, wielkokomórkowego raka neuroendokrynnego płuc, trzema przykładowymi modulatorami (SC16.13, SC16.46 i SC16.67) skoniugowanymi z ADC2 powodowało tłumienie wzrostu guza, trwające tak długo jak 20 dni, w przypad ku SC16.13-ADC2 i SC16.67-ADC2 (FIG. 19A); przeciwnie, chociaż SC16.46 umiarkowanie zmniejszał wzrost guza wykazał mniejszą aktywność niż inne badane modulatory. Podobnie, leczenie LU73,

133

EP 2 817 338 B1 drobnoko mórkowego raka płuca, czterema przykładowymi modulatorami (SC16.4, SC16.13, SC16.15 i SC16.46) powodowało trwałe remisje trwające, w niektórych przypadkach, ponad 120 dni po leczeniu (FIG. 19B). Jednakże, podobnie jak w przypadku przeciwciał badanych wobec LU37, przeciwciała badane wobec LU73 różniły się nieco okresem represji guza. Na koniec, leczenie LU86, innego drobnoko mórkowego raka płuca, dwoma skoniugowanymi modulatorami (SC16.46-ADC2 i SC16.67-ADC2) powodowało kurczenie się guza z czasem do progresji w jednym przypadku wynoszącym 40 dni (SC16.67-ADC2; FIG. 19C). Należy zauważyć, że na FIG. 19C dwie krzywe zasadniczo się pokrywają (mIgG1-ADC2 i SC16.46-ADC2) i trudno je odróżnić.

[0591] Zdumiewająca zdolność wielu skoniugowanych modulatorów do znacznego opóźnienia lub tłumienia wzrostu guza in vivo przez wydłużony czas dodatkowo waliduje zastosowanie DLL3 jako terapeutycznego celu leczenia zaburzeń pro liferacyjnych.

Przykłąd 16

Humanizowane modulatory DLL3 ADC tłumią wzrost guza [0592] Biorąc pod uwagę imponujące wyniki uzyskane przez DLL3-ADC2, przeprowadzono dodatkowe doświadczenia w celu wykazania skuteczności przykładowych humanizowanych modulatorów ADC w leczeniu różnych typów nowotworów (w tym raka jajników, płuc i nerek) in vivo. W szczególności, wybrane humanizowane przeciwciała anty-DLL3 (hSC16.13, hSC16.15, hSC16.34 i hSC16.56 wytworzone zgodnie z Przykładem 8 powyżej) skoniugowano (przez jednostkę łącznikową) z dwoma odrębnymi środkami cytotoksyczny mi PBD (ADC1 i ADC2), jak opisano powyżej i, z kontrolami, podawano myszom z niedoborem odporności z wszczepionym guzem NTX, jak przedstawiono w poprzednim Przykładzie. W każdym badaniu monitorowano objętości guzów i mysie masy zwierząt kontrolnych, dopóki guzy nie przekraczały 800 mm³lub myszy nie zachorowały. Wyniki tych doświadczeń przedstawiono na FIG. 20A do 20F.

[0593] Przegląd FIG. 20A - 20F pokazuje, że zmniejszenie objętości guza i trwałość remisji osiągnięto w różnych typach guzów, niektórych wykazujących cechy neuroendokrynne, po leczeniu 1 mg/kg hSC16-ADC. Na przykład, schematy leczenia, w których podawanie jest wyznaczone przez pionowe linie na przed miotowych FIG., dało całkowite i trwałe wyeliminowanie masy guza w raku jajnika z cechami neuroendokryn nymi (OV26, hSC16.15-ADC2, FIG. 20A), brodawkowatym raku nerkowokomórkowym z cechami neuroendokrynnymi (KDY66, hSC16.34-ADC1, FIG. 20E) i trzech drobnokomórkowych rakach płuc (LU86, hSC16.13-ADC1, FIG. 20B), (LU64, hSC16.13-ADC1, FIG. 20C, LU64, hSC16.13-ADC2 + hSC16.13-ADC1, FIG. 20D). Brak nawrotu guza obserwowano przez ponad 100 dni we wszystkich tych przypad kach, a w niektórych przypadkach ponad 225 dni po leczeniu, w którym myszy obserwowano przez wydłużony czas. Dodatkowo, leczenie ujawnionymi modulatorami spowodowało zmniejszenie objętości guza i supresję wzrostu w heteroprzeszczepie jasnokomórkowego raka nerkowokomórkowego, który wykazuje wysoki poziom DLL3 z zastosowaniem niższej dawki 0,5 mg/kg (KDY27, hSC16.56-ADC1, FIG. 20F).

[0594] Na koniec należy zauważyć, że pewne nawracające nowotwory pozostały wrażliwe na toksyczność hSC16-ADC. Osiemdziesiąt dni po początkowym leczeniu SC16.13-ADC2 zaobserwowano wznowę w LU64 (Fig. 20D). Leczenie nawracających nowotworów z hSC16.13-ADC1 spowodowało eliminację obserwowalnej masy guza, która utrzy mywała się przez ponad 100 dni po drugim leczeniu.

[0595] Ponownie, te wyniki wykazują zaskakującą wszechstronność i stosowalność modulatorów według niniejszego wynalazku w leczeniu różnych zaburzeń proliferacyjnych.

134

EP 2 817 338 B1

Przykład 17

Zmniejszanie częstości występowania komórek macierzystych raka przez koniugaty przeciwciało

DLL3-lek [0596] Jak pokazano w poprzednich Przykładach, ujawnione modulatory są bardzo skuteczne w hamowaniu wzrostu guza, zwłaszcza w postaci ADC. Ponadto, jak wykazano powyżej, ekspresja DLL3 jest związana z komórkami macierzystymi raka, o których powszechnie wiadomo, że są zarówno oporne na leki, jak i podsycają wznowę i przerzuty nowotworu. W związku z tym, aby wykazać, że leczenie DLL3-ADC zmniejsza potencjał wznowy linii NTX, przeprowadzono testy ograniczającego rozcieńczenia in vivo (LDA) w celu określenia częstości występowania komórek inicjujących nowotwór (TIC) w guzach drobnoko mórkowego raka płuc po leczeniu hSC16 .13-ADC1 (oznaczo ny SC16-ADC na FIG. 21).

[0597] Guzy po przeszczepie heterogenicznym drobnoko mórkowego raka płuc pochodzące od pacjenta (LU95 i LU64) hodowano podskórnie u myszy z niedoborem odporności. Gdy objętość guza wynosiła średnio 150 mm³ - 250 mm³, myszy losowo segregowano do dwóch grup po siedem myszy. Via iniekcja dootrzewnowa myszom wstrzykiwano w dniach 0, 4 i 7 (FIG. 21A i 21D, przerywane pionowe linie), albo ludzką IgG1-ADC1 (1 mg/kg, n = 7 myszy) jako kontrolę ujemną albo hSC16. 13-ADC1 (1 mg/kg, n = 7 myszy). W 8 dniu, dwie reprezentatywne myszy z każdej grupy poddano eutanazji, a ich guzy zbierano i zdyspergowano do zawiesin pojedynczokomórkowych. Jak pokazano na FIG. 21A i 21D, podczas gdy guzy leczone hIgG1-ADC1 (IgG1-ADC) nadal rosły u pięciu pozostałych myszy, u pięciu pozostałych myszy objętości guzów leczonych hSC16.13-ADC1 (SC16-ADC) zostały zmniejszone do zera lub prawie do zera. [0598] Stosując standardowe techniki cytometrii przepływowej i wyznakowane przeciwciało anty-DLL3 potwierdzono, że dwa zebrane guzy z każdej z dwóch grup leczenia mają podobnie dodatnią ekspresję DLL3. Następnie komórki nowotworowe z każdej odpowiedniej grupy leczonej spulowano i żywe komórki ludzkie wyizolowano za pomocą FACS stosując FACSAria III (Becton Dickenson) zgodnie z instrukcjami producenta i technikami znanymi w dziedzinie. W skrócie, komórki znakowano skoniugowanymi z FITC przeciwciałami anty-mysie H2Kd i anty-mysie CD45 (obydwa z firmy BioLegend, Inc.), a następnie ponownie zawieszono w 1 μg/ml DAPI. Uzyskaną zawiesinę następnie w standardowych warunkach sortowano DAPI" zebrano komórki ludzkie, mH2Kd" i mCD45" i odrzucono komórki mysie.

[0599] Kohortom pięciu myszy-biorców przeszczepiono następnie albo 2000, 500, 120 albo 30 sortowanych żywych ludzkich komórek z guzów traktowanych hSC16.13-ADC1. Dla porównania, kohortom pięciu myszybiorców przeszczepiono albo 1000, 250, 60 lub 15 żywych komórek ludzkich z guzów leczonych kontrolnym

IgG1-ADC1. Guzy u myszy-biorców mierzono co tydzień, a poszczególne myszy poddawano eutanazji, ₃ zanim guzy osiągnęły 1500 mm³. Po rozpoczęciu wzrostu guza badanie zakończono po czterech kolejnych tygodniach bez pojawienia się nowego guza u jakiejko lwiek dodatkowej myszy. W tym czasie myszy-biorcy były oceniane jako dodatnie lub ujemne dla wzrostu guza, z dodatnim wzrostem o objętości powyżej 100 ₃ mm³.

[0600] Wśród wszystkich wstrzykniętych dawek, biorcy komórek LU95 leczeni hSC16.13-ADC1 wytworzyli się tylko jeden guz, w porównaniu do dwunastu u biorców komórek LU95 leczonych IgG1-ADC1 (FIG. 21B). Podobnie, biorcy komórek LU64 leczeni SC16.13-ADC1 wytworzyli trzy guzy, w porównaniu do 13 guzów u biorców komórek LU64 leczonych IgG1-ADC1 (FIG. 21E).

[0601] Wykorzystując statystyki rozkładu Poissona (oprogramowanie L-Calc, Stemcell Technologies), wstrzyknięte dawki komórek u biorców z i bez guzów w 18 tygodni po przeszczepie zastosowano do

135

EP 2 817 338 B1 obliczenia częstości występowania komórek inicjujących guz w każdej populacji. Liczba TIC na 10000 żywych komórek ludzkich w LU95 zmniejszyła się ponad 100 razy, od 78,1 w guzach traktowanych IgG1ADC do 0,769 w guzach traktowanych hSC16.13-ADC1 (FIG. 21C, od 1: 128 komórek w leczonych kontrolą do 1: 12998 komórek w leczonych modulatorem). W LU64 liczba TIC została zmniejszona 16,6 raza, od 47,4 TIC do 2,86 TIC na 10000 żywych komórek ludzkich w guzach traktowanych odpowiednio IgG1-ADC1 lub hSC16.13-ADC1 (FIG. 21F, z 1: 211 komórek w leczonych kontrolą do 1: 3500 komórek w leczonych modulatorem). To znaczne zmniejszenie częstości występowania TIC (np. komórek macierzystych raka) pokazuje, że oprócz zmniejszenia objętości guzów, jak pokazano wcześniej, modulator według niniejszego ujawnienia znacząco i wyraźnie zmniejsza populacje komórek macierzystych raka, a co za tym idzie, wznowę, przerzuty oraz potencjał ponownego wzrostu guzów. To zmniejszenie potencjału wznowy i ponownego wzrostu jest mocno udowodnione przez znaczne przeżycie wolne od guza obserwowane w niniejszych Przykładach.

LISTA SEKWENCJI [0602] <110> STEM CENTRX, INC.

<120> NOWE MODULATORY I SPOSOBY STOSOWANIA <130> 11200.0013-00304 <140>

<141>

<150> 61/719,803 <151> 2012-10-29 <150> 61/603,173 <151> 2012-02-24 <160> 413 <170> PatentIn wersja 3.5 <210> 1 <211> 2387 <212> DNA <213> Homo sapiens ^[

136

EP 2 817 338 B1 <400> 1

<td>agatataagg</td><td>cttggaagcc</td><td>agcagctgcg</td><td>actcccgaga</td><td>cccccccacc</td><td>agaaggccat</td><td>60</td>

<td>ggtctcccca</td><td>cggatgtccg</td><td>ggctcctctc</td><td>ccagactgtg</td><td>atcctagcgc</td><td>tcattttcct</td><td>120</td>

<td>cccccagaca</td><td>cggcccgctg</td><td>gcgtcttcga</td><td>gctgcagatc</td><td>cactctttcg</td><td>ggccgggtcc</td><td>180</td>

<td>aggccctggg</td><td>gccccgcggt</td><td>ccccctgcag</td><td>cgcccggctc</td><td>ccctgccgcc</td><td>tcttcttcag</td><td>240</td>

<td>agtctgcctg</td><td>aagcctgggc</td><td>tctcagagga</td><td>ggccgccgag</td><td>tccccgtgcg</td><td>ccctgggcgc</td><td>300</td>

<td>ggcgctgagt</td><td>gcgcgcggac</td><td>cggtctacac</td><td>cgagcagccc</td><td>ggagcgcccg</td><td>cgcctgatct</td><td>360</td>

<td>cccactgccc</td><td>gacggcctct</td><td>tgcaggtgcc</td><td>cttccgggac</td><td>gcctggcctg</td><td>gcaccttctc</td><td>420</td>

<td>tttcatcatc</td><td>gaaacctgga</td><td>gagaggagtt</td><td>aggagaccag</td><td>attggagggc</td><td>ccgcctggag</td><td>480</td>

<td>cctgctggcg</td><td>cgcgtggctg</td><td>gcaggcggcg</td><td>cttggcagcc</td><td>ggaggcccgt</td><td>gggcccggga</td><td>540</td>

<td>cattcagcgc</td><td>gcaggcgcct</td><td>gggagctgcg</td><td>cttctcgtac</td><td>cgcgcgcgct</td><td>gcgagccgcc</td><td>600</td>

<td>tgccgtcggg</td><td>accgcgtgca</td><td>cgcgcctctg</td><td>ccgtccgcgc</td><td>agcgccccct</td><td>cgcggtgcgg</td><td>660</td>

<td>tccgggactg</td><td>cgcccctgcg</td><td>caccgctcga</td><td>ggacgaatgt</td><td>gaggcgccgc</td><td>tggtgtgccg</td><td>720</td>

<td>agcaggctgc</td><td>agccctgagc</td><td>atggcttctg</td><td>tgaacagccc</td><td>ggtgaatgcc</td><td>gatgcctaga</td><td>780</td>

<td>gggctggact</td><td>ggacccctct</td><td>gcacggtccc</td><td>tgtctccacc</td><td>agcagctgcc</td><td>tcagccccag</td><td>840</td>

<td>gggcccgtcc</td><td>tctgctacca</td><td>ccggatgcct</td><td>tgtccctggg</td><td>cctgggccct</td><td>gtgacgggaa</td><td>900</td>

<td>cccgtgtgcc</td><td>aatggaggca</td><td>gctgtagtga</td><td>gacacccagg</td><td>tcctttgaat</td><td>gcacctgccc</td><td>960</td>

<td>gcgtgggttc</td><td>tacgggctgc</td><td>ggtgtgaggt</td><td>gagcggggtg</td><td>acatgtgcag</td><td>atggaccctg</td><td>1020</td>

<td>cttcaacggc</td><td>ggcttgtgtg</td><td>tcgggggtgc</td><td>agaccctgac</td><td>tctgcctaca</td><td>tctgccactg</td><td>1080</td>

137

EP 2 817 338 B1

<td>cccacccggt</td><td>ttccaaggct</td><td>ccaactgtga</td><td>gaagagggtg</td><td>gaccggtgca</td><td>gcctgcagcc</td><td>1140</td>

<td>atgccgcaat</td><td>ggcggactct</td><td>gcctggacct</td><td>gggccacgcc</td><td>ctgcgctgcc</td><td>gctgccgcgc</td><td>1200</td>

<td>cggcttcgcg</td><td>ggtcctcgct</td><td>gcgagcacga</td><td>cctggacgac</td><td>tgcgcgggcc</td><td>gcgcctgcgc</td><td>1260</td>

<td>taacggcggc</td><td>acgtgtgtgg</td><td>agggcggcgg</td><td>cgcgcaccgc</td><td>tgctcctgcg</td><td>cgctgggctt</td><td>1320</td>

<td>cggcggccgc</td><td>gactgccgcg</td><td>agcgcgcgga</td><td>cccgtgcgcc</td><td>gcgcgcccct</td><td>gtgctcacgg</td><td>1380</td>

<td>cggccgctgc</td><td>tacgcccact</td><td>tctccggcct</td><td>cgtctgcgct</td><td>tgcgctcccg</td><td>gctacatggg</td><td>1440</td>

<td>agcgcggtgt</td><td>gagttcccag</td><td>tgcaccccga</td><td>cggcgcaagc</td><td>gccttgcccg</td><td>cggccccgcc</td><td>1500</td>

<td>gggcctcagg</td><td>cccggggacc</td><td>ctcagcgcta</td><td>ccttttgcct</td><td>ccggctctgg</td><td>gactgctcgt</td><td>1560</td>

<td>ggccgcgggc</td><td>gtggccggcg</td><td>ctgcgctctt</td><td>gctggtccac</td><td>gtgcgccgcc</td><td>gtggccactc</td><td>1620</td>

<td>ccaggatgct</td><td>gggtctcgct</td><td>tgctggctgg</td><td>gaccccggag</td><td>ccgtcagtcc</td><td>acgcactccc</td><td>1680</td>

<td>ggatgcactc</td><td>aacaacctaa</td><td>ggacgcagga</td><td>gggttccggg</td><td>gatggtccga</td><td>gctcgtccgt</td><td>1740</td>

<td>agattggaat</td><td>cgccctgaag</td><td>atgtagaccc</td><td>tcaagggatt</td><td>tatgtcatat</td><td>ctgctccttc</td><td>1800</td>

<td>catctacgct</td><td>cgggaggtag</td><td>cgacgcccct</td><td>tttccccccg</td><td>ctacacactg</td><td>ggcgcgctgg</td><td>1860</td>

<td>gcagaggcag</td><td>cacctgcttt</td><td>ttccctaccc</td><td>ttcctcgatt</td><td>ctgtccgtga</td><td>aatgaattgg</td><td>1920</td>

<td>gtagagtctc</td><td>tggaaggttt</td><td>taagcccatt</td><td>ttcagttcta</td><td>acttactttc</td><td>atcctatttt</td><td>1980</td>

<td>gcatccctct</td><td>tatcgttttg</td><td>agctacctgc</td><td>catcttctct</td><td>ttgaaaaacc</td><td>tatgggcttg</td><td>2040</td>

<td>aggaggtcac</td><td>gatgccgact</td><td>ccgccagagc</td><td>ttttccactg</td><td>attgtactca</td><td>gcggggaggc</td><td>2100</td>

<td>aggggaggca</td><td>gaggggcagc</td><td>ctctctaatg</td><td>cttcctactc</td><td>attttgtttc</td><td>taggcctgac</td><td>2160</td>

<td>gcgtctcctc</td><td>catccgcacc</td><td>tggagtcaga</td><td>gcgtggattt</td><td>ttgtatttgc</td><td>tcggtggtgc</td><td>2220</td>

<td>ccagtctctg</td><td>ccccagaggc</td><td>tttggagttc</td><td>aatcttgaag</td><td>gggtgtctgg</td><td>gggaacttta</td><td>2280</td>

<td>ctgttgcaag</td><td>ttgtaaataa</td><td>tggttattta</td><td>tatcctattt</td><td>tttctcaccc</td><td>catctctcta</td><td>2340</td>

<td>gaaacaccta</td><td>taaaggctat</td><td>tattgtgatc</td><td>agttttgact</td><td>aacaaaa</td><td></td><td>2387</td>

<210> 2 <211> 2052 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2

<td>agatataagg</td><td>cttggaagcc</td><td>agcagctgcg</td><td>actcccgaga</td><td>cccccccacc</td><td>agaaggccat</td><td>60</td>

<td>ggtctcccca</td><td>cggatgtccg</td><td>ggctcctctc</td><td>ccagactgtg</td><td>atcctagcgc</td><td>tcattttcct</td><td>120</td>

<td>cccccagaca</td><td>cggcccgctg</td><td>gcgtcttcga</td><td>gctgcagatc</td><td>cactctttcg</td><td>ggccgggtcc</td><td>180</td>

<td>aggccctggg</td><td>gccccgcggt</td><td>ccccctgcag</td><td>cgcccggctc</td><td>ccctgccgcc</td><td>tcttcttcag</td><td>240</td>

<td>agtctgcctg</td><td>aagcctgggc</td><td>tctcagagga</td><td>ggccgccgag</td><td>tccccgtgcg</td><td>ccctgggcgc</td><td>300</td>

<td>ggcgctgagt</td><td>gcgcgcggac</td><td>cggtctacac</td><td>cgagcagccc</td><td>ggagcgcccg</td><td>cgcctgatct</td><td>360</td>

138

EP 2 817 338 B1

<td>cccactgccc</td><td>gacggcctct</td><td>tgcaggtgcc</td><td>cttccgggac</td><td>gcctggcctg</td><td>gcaccttctc</td><td>420</td>

<td>tttcatcatc</td><td>gaaacctgga</td><td>gagaggagtt</td><td>aggagaccag</td><td>attggagggc</td><td>ccgcctggag</td><td>480</td>

<td>cctgctggcg</td><td>cgcgtggctg</td><td>gcaggcggcg</td><td>cttggcagcc</td><td>ggaggcccgt</td><td>gggcccggga</td><td>540</td>

<td>cattcagcgc</td><td>gcaggcgcct</td><td>gggagctgcg</td><td>cttctcgtac</td><td>cgcgcgcgct</td><td>gcgagccgcc</td><td>600</td>

<td>tgccgtcggg</td><td>accgcgtgca</td><td>cgcgcctctg</td><td>ccgtccgcgc</td><td>agcgccccct</td><td>cgcggtgcgg</td><td>660</td>

<td>tccgggactg</td><td>cgcccctgcg</td><td>caccgctcga</td><td>ggacgaatgt</td><td>gaggcgccgc</td><td>tggtgtgccg</td><td>720</td>

<td>agcaggctgc</td><td>agccctgagc</td><td>atggcttctg</td><td>tgaacagccc</td><td>ggtgaatgcc</td><td>gatgcctaga</td><td>780</td>

<td>gggctggact</td><td>ggacccctct</td><td>gcacggtccc</td><td>tgtctccacc</td><td>agcagctgcc</td><td>tcagccccag</td><td>840</td>

<td>gggcccgtcc</td><td>tctgctacca</td><td>ccggatgcct</td><td>tgtccctggg</td><td>cctgggccct</td><td>gtgacgggaa</td><td>900</td>

<td>cccgtgtgcc</td><td>aatggaggca</td><td>gctgtagtga</td><td>gacacccagg</td><td>tcctttgaat</td><td>gcacctgccc</td><td>960</td>

<td>gcgtgggttc</td><td>tacgggctgc</td><td>ggtgtgaggt</td><td>gagcggggtg</td><td>acatgtgcag</td><td>atggaccctg</td><td>1020</td>

<td>cttcaacggc</td><td>ggcttgtgtg</td><td>tcgggggtgc</td><td>agaccctgac</td><td>tctgcctaca</td><td>tctgccactg</td><td>1080</td>

<td>cccacccggt</td><td>ttccaaggct</td><td>ccaactgtga</td><td>gaagagggtg</td><td>gaccggtgca</td><td>gcctgcagcc</td><td>1140</td>

<td>atgccgcaat</td><td>ggcggactct</td><td>gcctggacct</td><td>gggccacgcc</td><td>ctgcgctgcc</td><td>gctgccgcgc</td><td>1200</td>

<td>cggcttcgcg</td><td>ggtcctcgct</td><td>gcgagcacga</td><td>cctggacgac</td><td>tgcgcgggcc</td><td>gcgcctgcgc</td><td>1260</td>

<td>taacggcggc</td><td>acgtgtgtgg</td><td>agggcggcgg</td><td>cgcgcaccgc</td><td>tgctcctgcg</td><td>cgctgggctt</td><td>1320</td>

<td>cggcggccgc</td><td>gactgccgcg</td><td>agcgcgcgga</td><td>cccgtgcgcc</td><td>gcgcgcccct</td><td>gtgctcacgg</td><td>1380</td>

<td>cggccgctgc</td><td>tacgcccact</td><td>tctccggcct</td><td>cgtctgcgct</td><td>tgcgctcccg</td><td>gctacatggg</td><td>1440</td>

<td>agcgcggtgt</td><td>gagttcccag</td><td>tgcaccccga</td><td>cggcgcaagc</td><td>gccttgcccg</td><td>cggccccgcc</td><td>1500</td>

<td>gggcctcagg</td><td>cccggggacc</td><td>ctcagcgcta</td><td>ccttttgcct</td><td>ccggctctgg</td><td>gactgctcgt</td><td>1560</td>

<td>ggccgcgggc</td><td>gtggccggcg</td><td>ctgcgctctt</td><td>gctggtccac</td><td>gtgcgccgcc</td><td>gtggccactc</td><td>1620</td>

<td>ccaggatgct</td><td>gggtctcgct</td><td>tgctggctgg</td><td>gaccccggag</td><td>ccgtcagtcc</td><td>acgcactccc</td><td>1680</td>

<td>ggatgcactc</td><td>aacaacctaa</td><td>ggacgcagga</td><td>gggttccggg</td><td>gatggtccga</td><td>gctcgtccgt</td><td>1740</td>

<td>agattggaat</td><td>cgccctgaag</td><td>atgtagaccc</td><td>tcaagggatt</td><td>tatgtcatat</td><td>ctgctccttc</td><td>1800</td>

<td>catctacgct</td><td>cgggaggcct</td><td>gacgcgtctc</td><td>ctccatccgc</td><td>acctggagtc</td><td>agagcgtgga</td><td>1860</td>

<td>tttttgtatt</td><td>tgctcggtgg</td><td>tgcccagtct</td><td>ctgccccaga</td><td>ggctttggag</td><td>ttcaatcttg</td><td>1920</td>

<td>aaggggtgtc</td><td>tgggggaact</td><td>ttactgttgc</td><td>aagttgtaaa</td><td>taatggttat</td><td>ttatatccta</td><td>1980</td>

<td>ttttttctca</td><td>ccccatctct</td><td>ctagaaacac</td><td>ctataaaggc</td><td>tattattgtg</td><td>atcagttttg</td><td>2040</td>

<td>actaacaaaa</td><td>aa</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>2052</td>

<210> 3 <211> 618 <212> PRT <213> Homo sapiens

139

EP 2 817 338 B1

<td colspan="2">&lt;400&gt; 3</td><td rowspan="2">Ser Pro</td><td rowspan="2">Arg 5</td><td rowspan="2">Met</td><td rowspan="2">Ser Gly Leu</td><td rowspan="2">Leu Ser Gin Thr Val 10</td><td rowspan="2">Ile 15</td><td rowspan="2">Leu</td>

<td>Met 1</td><td>Val</td>

<td>Ala</td><td>Leu</td><td>Ile Phe 20</td><td>Leu</td><td>Pro</td><td>Gin Thr Arg 25</td><td>Pro Ala Gly Val Phe 30</td><td>Glu</td><td>Leu</td>

<td>Gin</td><td>Ile</td><td>His Ser 35</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Pro Gly Pro 40</td><td>Gly Pro Gly Ala Pro 45</td><td>Arg</td><td>Ser</td>

<td>Pro</td><td>Cys 50</td><td>Ser Ala</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Pro Cys Arg 55</td><td>Leu Phe Phe Arg Val 60</td><td>Cys</td><td>Leu</td>

<td>Lys 65</td><td>Pro</td><td>Gly Leu</td><td>Ser</td><td>Glu 70</td><td>Glu Ala Ala</td><td>Glu Ser Pro Cys Ala 75</td><td>Leu</td><td>Gly 80</td>

<td>Ala</td><td>Ala</td><td>Leu Ser</td><td>Ala 85</td><td>Arg</td><td>Gly Pro Val</td><td>Tyr Thr Glu Gin Pro 90</td><td>Gly 95</td><td>Ala</td>

<td>Pro</td><td>Ala</td><td>Pro Asp 100</td><td>Leu</td><td>Pro</td><td>Leu Pro Asp 105</td><td>Gly Leu Leu Gin Val 110</td><td>Pro</td><td>Phe</td>

<td>Arg</td><td>Asp</td><td>Ala Trp 115</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Thr Phe Ser 120</td><td>Phe Ile Ile Glu Thr 125</td><td>Trp</td><td>Arg</td>

<td>Glu</td><td>Glu 130</td><td>Leu Gly</td><td>Asp</td><td>Gin</td><td>Ile Gly Gly 135</td><td>Pro Ala Trp Ser Leu 140</td><td>Leu</td><td>Ala</td>

<td>Arg 145</td><td>Val</td><td>Ala Gly</td><td>Arg</td><td>Arg 150</td><td>Arg Leu Ala</td><td>Ala Gly Gly Pro Trp 155</td><td>Ala</td><td>Arg 160</td>

<td>Asp</td><td>Ile</td><td>Gin Arg</td><td>Ala 165</td><td>Gly</td><td>Ala Trp Glu</td><td>Leu Arg Phe Ser Tyr 170</td><td>Arg 175</td><td>Ala</td>

<td>Arg</td><td>Cys</td><td>Glu Pro 180</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Val Gly Thr 185</td><td>Ala Cys Thr Arg Leu 190</td><td>Cys</td><td>Arg</td>

<td>Pro</td><td>Arg</td><td>Ser Ala 195</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Arg Cys Gly 200</td><td>Pro Gly Leu Arg Pro 205</td><td>Cys</td><td>Ala</td>

<td>Pro</td><td>Leu 210</td><td>Glu Asp</td><td>Glu</td><td>Cys</td><td>Glu Ala Pro 215</td><td>Leu Val Cys Arg Ala 220</td><td>Gly</td><td>Cys</td>

<td>Ser 225</td><td>Pro</td><td>Glu His</td><td>Gly</td><td>Phe 230</td><td>Cys Glu Gin</td><td>Pro Gly Glu Cys Arg 235</td><td>Cys</td><td>Leu 240</td>

<td>Glu</td><td>Gly</td><td>Trp Thr</td><td>Gly</td><td>Pro</td><td>Leu Cys Thr</td><td>Val Pro Val Ser Thr</td><td>Ser</td><td>Ser</td>

140

EP 2 817 338 B1

<img file="PL2817338T3_D0038.tif" />

141

EP 2 817 338 B1

Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu 500 505 510

Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gin Asp Ala Gly Ser Arg Leu 515 520 525

Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu 530 535 540

Asn Asn Leu Arg Thr Gin Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser

545 550 555 560

Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Gin Gly Ile Tyr Val

565 570 575

Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Val Ala Thr Pro Leu Phe 580 585 590

Pro Pro Leu His Thr Gly Arg Ala Gly Gin Arg Gin His Leu Leu Phe 595 600 605

Pro Tyr Pro Ser Ser Ile Leu Ser Val Lys 610 615 <210> 4 <211> 587 <212> PRT <213> Homo sapiens

<td colspan="11">&lt;400&gt; 4</td>

<td>Met Val 1</td><td>Ser Pro Arg 5</td><td>Met</td><td>Ser Gly Leu</td><td>Leu 10</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ile 15</td><td>Leu</td>

<td>Ala Leu</td><td>Ile Phe Leu 20</td><td>Pro</td><td>Gin Thr Arg 25</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Phe 30</td><td>Glu</td><td>Leu</td>

<td>Gin Ile</td><td>His Ser Phe 35</td><td>Gly</td><td>Pro Gly Pro 40</td><td>Gly</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Ala 45</td><td>Pro</td><td>Arg</td><td>Ser</td>

<td>Pro Cys 50</td><td>Ser Ala Arg</td><td>Leu</td><td>Pro Cys Arg 55</td><td>Leu</td><td>Phe</td><td>Phe 60</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Cys</td><td>Leu</td>

<td>Lys Pro 65</td><td>Gly Leu Ser</td><td>Glu 70</td><td>Glu Ala Ala</td><td>Glu</td><td>Ser 75</td><td>Pro</td><td>Cys</td><td>Ala</td><td>Leu</td><td>Gly 80</td>

<td>Ala Ala</td><td>Leu Ser Ala 85</td><td>Arg</td><td>Gly Pro Val</td><td>Tyr 90</td><td>Thr</td><td>Glu</td><td>Gin</td><td>Pro</td><td>Gly 95</td><td>Ala</td>

<td>Pro Ala</td><td>Pro Asp Leu</td><td>Pro</td><td>Leu Pro Asp</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Phe</td>

142

EP 2 817 338 B1

100 105 110

Arg Asp Ala Trp Pro Gly Thr Phe Ser Phe Ile Ile Glu Thr Trp Arg 115 120 125

Glu Glu Leu Gly Asp Gin Ile Gly Gly Pro Ala Trp Ser Leu Leu Ala 130 135 140

Arg Val Ala Gly Arg Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg 145 150 155 160

Asp Ile Gin Arg Ala Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala 165 170 175

Arg Cys Glu Pro Pro Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg 180 185 190

Pro Arg Ser Ala Pro Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala 195 200 205

Pro Leu Glu Asp Glu Cys Glu Ala Pro Leu Val Cys Arg Ala Gly Cys 210 215 220

Ser Pro Glu His Gly Phe Cys Glu Gin Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu 225 230 235 240

Glu Gly Trp Thr Gly Pro Leu Cys Thr Val Pro Val Ser Thr Ser Ser 245 250 255

Cys Leu Ser Pro Arg Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val 260 265 270

Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser 275 280 285

Cys Ser Glu Thr Pro Arg Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe 290 295 300

Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro 305 310 315 320

Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala 325 330 335

Tyr Ile Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gin Gly 340 345

Ser Asn Cys Glu Lys 350

143

EP 2 817 338 B1

Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gin Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys 355 360 365

Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala 370 375 380

Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys 385 390 395 400

Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser 405 410 415

Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro 420 425 430

Cys Ala Ala Arg Pro Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe 435 440 445

Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys 450 455 460

Glu Phe Pro Val His Pro Asp Gly Ala Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro 465 470 475 480

Pro Gly Leu Arg Pro Gly Asp Pro Gin Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala 485 490 495

Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu 500 505 510

Val His Val Arg Arg Arg Gly His Ser Gin Asp Ala Gly Ser Arg Leu 515 520 525

Leu Ala Gly Thr Pro Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu 530 535 540

Asn Asn Leu Arg Thr Gin Glu Gly Ser Gly Asp Gly Pro Ser Ser Ser 545 550 555 560

Val Asp Trp Asn Arg Pro Glu Asp Val Asp Pro Gin Gly Ile Tyr Val 565 570 575

Ile Ser Ala Pro Ser Ile Tyr Ala Arg Glu Ala 580 585 <210> 5 <211> 1686 <212> DNA <213> Mus sp.

144

EP 2 817 338 B1 <400> 5

<td>gctggtgtct</td><td>tcgagctaca</td><td>aattcattct</td><td>ttcgggccag</td><td>gcccaggcct</td><td>cgggacccca</td><td>60</td>

<td>cgctccccct</td><td>gcaacgcccg</td><td>aggcccttgc</td><td>cgcctcttct</td><td>tcagggtctg</td><td>cctgaagccc</td><td>120</td>

<td>ggagtctccc</td><td>aggaggccac</td><td>cgagtccctg</td><td>tgcgccctgg</td><td>gcgcagcact</td><td>gagcacgagc</td><td>180</td>

<td>gtcccggtct</td><td>atacggagca</td><td>ccccggagag</td><td>tcagcggctg</td><td>ccctgccgct</td><td>gcctgatggc</td><td>240</td>

<td>ctcgtacgtg</td><td>tgcccttccg</td><td>cgatgcttgg</td><td>ccgggcacct</td><td>tctccctcgt</td><td>cattgaaacc</td><td>300</td>

<td>tggagagagc</td><td>agctgggaga</td><td>gcatgctgga</td><td>gggcccgcct</td><td>ggaacctgct</td><td>agcacgtgtg</td><td>360</td>

<td>gtcggccgta</td><td>gacgcctggc</td><td>ggctgggggc</td><td>ccgtgggccc</td><td>gcgatgtgca</td><td>gcgcacaggc</td><td>420</td>

<td>acatgggagt</td><td>tgcacttctc</td><td>ctaccgcgcg</td><td>cggtgcgagc</td><td>cgcccgccgt</td><td>cggggccgcc</td><td>480</td>

<td>tgcgcgcgcc</td><td>tgtgccgctc</td><td>acgcagtgcc</td><td>ccctcgcggt</td><td>gtggcccggg</td><td>actgcgaccc</td><td>540</td>

<td>tgcacgccat</td><td>tcccagacga</td><td>gtgcgaagcc</td><td>ccgtctgtgt</td><td>gtcgaccagg</td><td>ctgcagcccc</td><td>600</td>

<td>gagcacggct</td><td>actgtgaaga</td><td>gcctgatgaa</td><td>tgccgttgcc</td><td>tggagggctg</td><td>gactggaccc</td><td>660</td>

<td>ctctgcacgg</td><td>tccctgtctc</td><td>caccagtagc</td><td>tgcctgaact</td><td>ccagggttcc</td><td>tggtcctgcc</td><td>720</td>

<td>agcactggat</td><td>gccttttacc</td><td>tgggcctgga</td><td>ccttgtgatg</td><td>ggaacccatg</td><td>tgccaatggg</td><td>780</td>

<td>ggcagctgta</td><td>gtgaaacctc</td><td>tggctccttt</td><td>gaatgtgcct</td><td>gtccccgggg</td><td>attctacggg</td><td>840</td>

<td>cttcgatgtg</td><td>aggtgagcgg</td><td>ggtcacgtgc</td><td>gcagatggac</td><td>cctgcttcaa</td><td>tggcggcttg</td><td>900</td>

<td>tgtgttggcg</td><td>gtgaagatcc</td><td>tgactctgcc</td><td>tatgtctgtc</td><td>attgcccacc</td><td>tggtttccaa</td><td>960</td>

<td>ggctctaact</td><td>gtgagaagag</td><td>ggtggaccgc</td><td>tgtagcctgc</td><td>agccatgtca</td><td>gaatggcggc</td><td>1020</td>

<td>ctctgcctgg</td><td>acctgggcca</td><td>cgcgttgcgc</td><td>tgccgctgtc</td><td>gcgcgggatt</td><td>cgccgggccg</td><td>1080</td>

<td>cgctgcgagc</td><td>acgacctgga</td><td>cgactgcgcc</td><td>ggccgcgcct</td><td>gtgccaacgg</td><td>cggcacgtgc</td><td>1140</td>

<td>gtggagggcg</td><td>gcggctcgcg</td><td>ccgctgctcc</td><td>tgtgcgctgg</td><td>gcttcggcgg</td><td>gcgcgactgc</td><td>1200</td>

<td>cgagaacgcg</td><td>ccgacccctg</td><td>cgcctcccgc</td><td>ccctgcgcgc</td><td>atggaggccg</td><td>ttgctacgcc</td><td>1260</td>

<td>cacttctctg</td><td>gcctggtctg</td><td>cgcctgcgcg</td><td>cccggctaca</td><td>tgggcgtgag</td><td>atgcgagttc</td><td>1320</td>

<td>gctgtgcgcc</td><td>cggacggcgc</td><td>ggacgcggtg</td><td>cccgccgccc</td><td>cgcggggcct</td><td>gaggcaggcg</td><td>1380</td>

<td>gatccacagc</td><td>gctttcttct</td><td>gcctcccgcc</td><td>ttggggctgc</td><td>tggtggccgc</td><td>cggtttggct</td><td>1440</td>

<td>ggcgccgcac</td><td>tcttggtcat</td><td>ccacgttcgc</td><td>cgccgaggtc</td><td>ctggccagga</td><td>taccgggact</td><td>1500</td>

<td>cgcctgcttt</td><td>ctgggacccg</td><td>ggagccttcg</td><td>gtccacacgc</td><td>tcccggatgc</td><td>actcaacaac</td><td>1560</td>

<td>ctgaggttac</td><td>aagacggtgc</td><td>tggggatggc</td><td>cccagttcgt</td><td>cggctgactg</td><td>gaatcatcct</td><td>1620</td>

<td>gaagatggag</td><td>actctagatc</td><td>catttatgtc</td><td>ataccagccc</td><td>cttccattta</td><td>tgcacgagag</td><td>1680</td>

gcctga 1686 <210> 6 <211> 561 <212> PRT <213> Mus sp.

145

EP 2 817 338 B1

<td colspan="6">&lt;400&gt; 6</td><td rowspan="3">His</td><td colspan="2" rowspan="2">Ser Phe Gly Pro Gly Pro</td><td rowspan="3">Gly</td>

<td rowspan="2">Ala 1</td><td rowspan="2">Gly</td><td rowspan="2">Val</td><td rowspan="2">Phe</td><td rowspan="2">Glu Leu Gin 5</td><td rowspan="2">Ile</td>

<td>10</td><td>15</td>

<td>Leu</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Pro 20</td><td>Arg Ser Pro</td><td>Cys</td><td>Asn 25</td><td>Ala Arg Gly Pro</td><td>Cys Arg 30</td><td>Leu</td>

<td>Phe</td><td>Phe</td><td>Arg 35</td><td>Val</td><td>Cys Leu Lys</td><td>Pro 40</td><td>Gly</td><td>Val Ser Gin Glu 45</td><td>Ala Thr</td><td>Glu</td>

<td>Ser</td><td>Leu 50</td><td>Cys</td><td>Ala</td><td>Leu Gly Ala 55</td><td>Ala</td><td>Leu</td><td>Ser Thr Ser Val 60</td><td>Pro Val</td><td>Tyr</td>

<td>Thr 65</td><td>Glu</td><td>His</td><td>Pro</td><td>Gly Glu Ser 70</td><td>Ala</td><td>Ala</td><td>Ala Leu Pro Leu 75</td><td>Pro Asp</td><td>Gly 80</td>

<td>Leu</td><td>Val</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Pro Phe Arg 85</td><td>Asp</td><td>Ala</td><td>Trp Pro Gly Thr 90</td><td>Phe Ser 95</td><td>Leu</td>

<td>Val</td><td>Ile</td><td>Glu</td><td>Thr 100</td><td>Trp Arg Glu</td><td>Gin</td><td>Leu 105</td><td>Gly Glu His Ala</td><td>Gly Gly 110</td><td>Pro</td>

<td>Ala</td><td>Trp</td><td>Asn 115</td><td>Leu</td><td>Leu Ala Arg</td><td>Val 120</td><td>Val</td><td>Gly Arg Arg Arg 125</td><td>Leu Ala</td><td>Ala</td>

<td>Gly</td><td>Gly 130</td><td>Pro</td><td>Trp</td><td>Ala Arg Asp 135</td><td>Val</td><td>Gin</td><td>Arg Thr Gly Thr 140</td><td>Trp Glu</td><td>Leu</td>

<td>His 145</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Arg Ala Arg 150</td><td>Cys</td><td>Glu</td><td>Pro Pro Ala Val 155</td><td>Gly Ala</td><td>Ala 160</td>

<td>Cys</td><td>Ala</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Cys Arg Ser 165</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Ala Pro Ser Arg 170</td><td>Cys Gly 175</td><td>Pro</td>

<td>Gly</td><td>Leu</td><td>Arg</td><td>Pro 180</td><td>Cys Thr Pro</td><td>Phe</td><td>Pro 185</td><td>Asp Glu Cys Glu</td><td>Ala Pro 190</td><td>Ser</td>

<td>Val</td><td>Cys</td><td>Arg 195</td><td>Pro</td><td>Gly Cys Ser</td><td>Pro 200</td><td>Glu</td><td>His Gly Tyr Cys 205</td><td>Glu Glu</td><td>Pro</td>

<td>Asp</td><td>Glu 210</td><td>Cys</td><td>Arg</td><td>Cys Leu Glu 215</td><td>Gly</td><td>Trp</td><td>Thr Gly Pro Leu 220</td><td>Cys Thr</td><td>Val</td>

<td>Pro 225</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ser Ser Cys 230</td><td>Leu</td><td>Asn</td><td>Ser Arg Val Pro 235</td><td>Gly Pro</td><td>Ala 240</td>

146

EP 2 817 338 B1

Ser Thr Gly Cys Leu Leu Pro Gly Pro Gly Pro Cys Asp Gly Asn Pro 245 250 255

Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Ser Gly Ser Phe Glu Cys 260 265 270

Ala Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys Glu Val Ser Gly Val 275 280 285

Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly Leu Cys Val Gly Gly 290 295 300

Glu Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Val Cys His Cys Pro Pro Gly Phe Gin 305 310 315 320

Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys Ser Leu Gin Pro Cys 325 330 335

Gin Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His Ala Leu Arg Cys Arg 340 345 350

Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu His Asp Leu Asp Asp 355 360 365

Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr Cys Val Glu Gly Gly 370 375 380

Gly Ser Arg Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe Gly Gly Arg Asp Cys 385 390 395 400

Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ser Arg Pro Cys Ala His Gly Gly 405 410 415

Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys Ala Cys Ala Pro Gly 420 425 430

Tyr Met Gly Val Arg Cys Glu Phe Ala Val Arg Pro Asp Gly Ala Asp 435 440 445

Ala Val Pro Ala Ala Pro Arg Gly Leu Arg Gin Ala Asp Pro Gin Arg 450 455 460

Phe Leu Leu Pro Pro Ala Leu Gly Leu Leu Val Ala Ala Gly Leu Ala 465 470 475 480

Gly Ala Ala Leu Leu Val Ile His Val Arg Arg Arg Gly Pro Gly Gin

147

EP 2 817 338 B1

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>485</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>490</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>495</td><td></td>

<td>Asp</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Thr 500</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Gly 505</td><td>Thr</td><td>Arg</td><td>Glu</td><td>Pro</td><td>Ser 510</td><td>Val</td><td>His</td>

<td>Thr</td><td>Leu</td><td>Pro 515</td><td>Asp</td><td>Ala</td><td>Leu</td><td>Asn</td><td>Asn 520</td><td>Leu</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Asp 525</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Gly</td>

<td>Asp</td><td>Gly 530</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ala 535</td><td>Asp</td><td>Trp</td><td>Asn</td><td>His</td><td>Pro 540</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>Asp</td>

<td>Ser 545</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Val 550</td><td>Ile</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Pro</td><td>Ser 555</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Arg</td><td>Glu 560</td>

Ala <210> 7 <211> 1794 <212> DNA <213> Macaca fascicularis <400> 7

<td>ccccaagcca</td><td>ggcccgctgg</td><td>cgtgttcgaa</td><td>ctgcagatcc</td><td>atagcttcgg</td><td>ccctggccct</td><td>60</td>

<td>ggacccggag</td><td>cccctagaag</td><td>cccttgttcc</td><td>gctagaggcc</td><td>cctgcagact</td><td>gttcttcaga</td><td>120</td>

<td>gtctgcctga</td><td>agcctggcct</td><td>gagcgaggag</td><td>gctgctgaga</td><td>gcccttgtgc</td><td>tctgggagct</td><td>180</td>

<td>gccctcagcg</td><td>ctaggggccc</td><td>tgtctacacc</td><td>gagcaacctg</td><td>aggctcccgc</td><td>tcccgatctg</td><td>240</td>

<td>cctctcccta</td><td>acggcctgct</td><td>gcaggtgccc</td><td>ttcagggatg</td><td>cttggcccgg</td><td>aaccttcagc</td><td>300</td>

<td>ctcatcatcg</td><td>agacctggag</td><td>ggaggaactc</td><td>ggagaccaga</td><td>ttggaggacc</td><td>cgcctggtcc</td><td>360</td>

<td>ctgctcgcta</td><td>gagtgacaag</td><td>aagaagaagg</td><td>ctggctgctg</td><td>gcggaccttg</td><td>ggctagagat</td><td>420</td>

<td>atccagagag</td><td>ctggcgcctg</td><td>ggagctcagg</td><td>ttcagctaca</td><td>gggccagatg</td><td>tgagctccct</td><td>480</td>

<td>gccgtgggca</td><td>ccgcttgtac</td><td>caggctgtgt</td><td>aggcccagat</td><td>ccgccccttc</td><td>cagatgtggc</td><td>540</td>

<td>cccggactca</td><td>gaccttgcgc</td><td>tcctctcgag</td><td>gacgagtgtg</td><td>aagctcctcc</td><td>cgtctgtagg</td><td>600</td>

<td>gccggatgca</td><td>gcctcgagca</td><td>cggcttctgt</td><td>gagcagcctg</td><td>gcgaatgtag</td><td>gtgcctcgaa</td><td>660</td>

<td>ggctggaccg</td><td>gccctctctg</td><td>tatggtgcct</td><td>gtctccacct</td><td>cctcctgtct</td><td>cggactgagg</td><td>720</td>

<td>ggcccttcct</td><td>ccgctacaac</td><td>cggatgtctg</td><td>gtccctggac</td><td>ctggaccttg</td><td>cgacggaaac</td><td>780</td>

<td>ccttgtgcca</td><td>acggaggctc</td><td>ctgtagcgag</td><td>acccccggaa</td><td>gctttgaatg</td><td>tacctgcccc</td><td>840</td>

<td>aggggctttt</td><td>acggcctcag</td><td>atgcgaggtc</td><td>agcggagtca</td><td>catgcgccga</td><td>cggaccctgc</td><td>900</td>

<td>tttaatggag</td><td>gactctgcgt</td><td>gggaggagcc</td><td>gaccctgata</td><td>gcgcttacat</td><td>ctgtcactgt</td><td>960</td>

<td>ccccccggct</td><td>ttcagggctc</td><td>caactgcgag</td><td>aagagggtcg</td><td>acaggtgctc</td><td>cctgcaaccc</td><td>1020</td>

148

EP 2 817 338 B1

<td>tgtagaaatg</td><td>gcggcctctg</td><td>cctggatctg</td><td>ggacatgctc</td><td>tcaggtgcag</td><td>atgtagagct</td><td>1080</td>

<td>ggattcgccg</td><td>gacccaggtg</td><td>cgagcatgat</td><td>ctcgacgatt</td><td>gtgctggcag</td><td>ggcctgcgct</td><td>1140</td>

<td>aatggaggaa</td><td>catgtgtgga</td><td>aggaggcgga</td><td>gcccacagat</td><td>gcagctgcgc</td><td>tctcggcttc</td><td>1200</td>

<td>ggcggaagag</td><td>actgcagaga</td><td>gagggctgac</td><td>ccttgtgccg</td><td>ccaggccttg</td><td>tgctcatggc</td><td>1260</td>

<td>ggaaggtgct</td><td>acgcccattt</td><td>ctccggactc</td><td>gtgtgcgcct</td><td>gcgcccctgg</td><td>atatatgggc</td><td>1320</td>

<td>gctaggtgcg</td><td>agtttcccgt</td><td>ccaccctgat</td><td>ggagtcagcg</td><td>ctctccctgc</td><td>cgctcctcct</td><td>1380</td>

<td>ggactgagac</td><td>ctggagatcc</td><td>tcagagatac</td><td>ctgctccctc</td><td>ctgccctcgg</td><td>actcctggtc</td><td>1440</td>

<td>gctgctggag</td><td>tcgctggagc</td><td>cgctctcctc</td><td>ctgggacacg</td><td>tcaggagaag</td><td>aggccacgcc</td><td>1500</td>

<td>caggatgctg</td><td>gaagcagact</td><td>gctggccgga</td><td>acacccgagc</td><td>cttccgtcca</td><td>tgccctgcct</td><td>1560</td>

<td>gacgccctca</td><td>acaacctgag</td><td>gacccaggag</td><td>ggccctggag</td><td>atgtgcctag</td><td>cagctccgtc</td><td>1620</td>

<td>gactggaaca</td><td>gacctgagga</td><td>tgtggactcc</td><td>aggggcatct</td><td>acgtgatcag</td><td>cgccccctcc</td><td>1680</td>

<td>atctatgcca</td><td>gggaggtcgc</td><td>catgcccctc</td><td>tttcctcctc</td><td>tgcatacagg</td><td>cagagccggc</td><td>1740</td>

<td>cagagacaga</td><td>acctgctctt</td><td>cccctacccc</td><td>agcagcatcc</td><td>tgtccgtgaa</td><td>gtga</td><td>1794</td>

<210> 8 <211> 597 <212> PRT <213> Macaca fascicularis

<td colspan="13">&lt;400&gt; 8</td>

<td>Pro Gin Ala Arg 1</td><td>Pro 5</td><td>Ala</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Phe</td><td>Glu 10</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Ile</td><td>His</td><td>Ser 15</td><td>Phe</td>

<td>Gly Pro Gly Pro 20</td><td>Gly</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Pro 25</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Cys</td><td>Ser 30</td><td>Ala</td><td>Arg</td>

<td>Gly Pro Cys Arg 35</td><td>Leu</td><td>Phe</td><td>Phe</td><td>Arg 40</td><td>Val</td><td>Cys</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Pro 45</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Ser</td>

<td>Glu Glu Ala Ala 50</td><td>Glu</td><td>Ser</td><td>Pro 55</td><td>Cys</td><td>Ala</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>Ala 60</td><td>Ala</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Ala</td>

<td>Arg Gly Pro Val 65</td><td>Tyr</td><td>Thr 70</td><td>Glu</td><td>Gin</td><td>Pro</td><td>Glu</td><td>Ala 75</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Pro</td><td>Asp</td><td>Leu 80</td>

<td>Pro Leu Pro Asn</td><td>Gly 85</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Val</td><td>Pro 90</td><td>Phe</td><td>Arg</td><td>Asp</td><td>Ala</td><td>Trp 95</td><td>Pro</td>

<td>Gly Thr Phe Ser 100</td><td>Leu</td><td>Ile</td><td>Ile</td><td>Glu</td><td>Thr 105</td><td>Trp</td><td>Arg</td><td>Glu</td><td>Glu</td><td>Leu 110</td><td>Gly</td><td>Asp</td>

<td>Gin Ile Gly Gly 115</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Trp</td><td>Ser 120</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Arg</td><td>Val 125</td><td>Thr</td><td>Arg</td><td>Arg</td>

149

EP 2 817 338 B1

Arg Arg Leu Ala Ala Gly Gly Pro Trp Ala Arg Asp Ile Gin Arg Ala 130 135 140

Gly Ala Trp Glu Leu Arg Phe Ser Tyr Arg Ala Arg Cys Glu Leu Pro 145 150 155 160

Ala Val Gly Thr Ala Cys Thr Arg Leu Cys Arg Pro Arg Ser Ala Pro 165 170 175

Ser Arg Cys Gly Pro Gly Leu Arg Pro Cys Ala Pro Leu Glu Asp Glu 180 185 190

Cys Glu Ala Pro Pro Val Cys Arg Ala Gly Cys Ser Leu Glu His Gly 195 200 205

Phe Cys Glu Gin Pro Gly Glu Cys Arg Cys Leu Glu Gly Trp Thr Gly 210 215 220

Pro Leu Cys Met Val Pro Val Ser Thr Ser Ser Cys Leu Gly Leu Arg 225 230 235 240

Gly Pro Ser Ser Ala Thr Thr Gly Cys Leu Val Pro Gly Pro Gly Pro 245 250 255

Cys Asp Gly Asn Pro Cys Ala Asn Gly Gly Ser Cys Ser Glu Thr Pro 260 265 270

Gly Ser Phe Glu Cys Thr Cys Pro Arg Gly Phe Tyr Gly Leu Arg Cys 275 280 285

Glu Val Ser Gly Val Thr Cys Ala Asp Gly Pro Cys Phe Asn Gly Gly 290 295 300

Leu Cys Val Gly Gly Ala Asp Pro Asp Ser Ala Tyr Ile Cys His Cys 305 310 315 320

Pro Pro Gly Phe Gin Gly Ser Asn Cys Glu Lys Arg Val Asp Arg Cys 325 330 335

Ser Leu Gin Pro Cys Arg Asn Gly Gly Leu Cys Leu Asp Leu Gly His 340 345 350

Ala Leu Arg Cys Arg Cys Arg Ala Gly Phe Ala Gly Pro Arg Cys Glu 355 360 365

His Asp Leu Asp Asp Cys Ala Gly Arg Ala Cys Ala Asn Gly Gly Thr

150

EP 2 817 338 B1

370 375 380

Cys Val Glu Gly Gly Gly Ala His Arg Cys Ser Cys Ala Leu Gly Phe 385 390 395 400

Gly Gly Arg Asp Cys Arg Glu Arg Ala Asp Pro Cys Ala Ala Arg Pro 405 410 415

Cys Ala His Gly Gly Arg Cys Tyr Ala His Phe Ser Gly Leu Val Cys 420 425 430

Ala Cys Ala Pro Gly Tyr Met Gly Ala Arg Cys Glu Phe Pro Val His 435 440 445

Pro Asp Gly Val Ser Ala Leu Pro Ala Ala Pro Pro Gly Leu Arg Pro 450 455 460

Gly Asp Pro Gin Arg Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Leu Gly Leu Leu Val 465 470 475 480

Ala Ala Gly Val Ala Gly Ala Ala Leu Leu Leu Gly His Val Arg Arg 485 490 495

Arg Gly His Ala Gin Asp Ala Gly Ser Arg Leu Leu Ala Gly Thr Pro 500 505 510

Glu Pro Ser Val His Ala Leu Pro Asp Ala Leu Asn Asn Leu Arg Thr 515 520 525

Gin Glu Gly Pro Gly Asp Val Pro Ser Ser Ser Val Asp Trp Asn Arg 530 535 540

Pro Glu Asp Val Asp Ser Arg Gly Ile Tyr Val Ile Ser Ala Pro Ser 545 550 555 560

Ile Tyr Ala Arg Glu Val Ala Met Pro Leu Phe Pro Pro Leu His Thr 565 570 575

Gly Arg Ala Gly Gin Arg Gin Asn Leu Leu Phe Pro Tyr Pro Ser Ser 580 585 590

Ile Leu Ser Val Lys 595 <210> 9 <211> 5 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9

Gin Pro Gly Ala Pro 1 5 <210> 10 <211> 4 <212> PRT <213> Homo sapiens

151

EP 2 817 338 B1 <220>

<221> MOD_RES <222> (2) .. (2) <223> Dowolny aminokwas <400> 10

Gly Xaa Arg Pro 1 <210> 11 <400> 11 000 <210> 12 <400> 12 000 <210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <400> 14 000 <210> 15 <400> 15 000 <210> 16 <400> 16 000 <210> 17 <400> 17 000 <210> 18 <400> 18 000 <210> 19 <400> 19 000 <210> 20 <211> 108 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

152

EP 2 817 338 B1

<td colspan="2">&lt;400&gt; 20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gin</td><td>Ile</td><td>Val</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Ile</td><td>Met</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Gly</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Glu</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Met</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Leu</td><td>His</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Trp</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Met</td><td>Glu</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Ala</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Ala</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>His</td><td>Gin</td><td>Tyr</td><td>His</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Pro</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Phe</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ile</td><td>Arg</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 21 <211> 123 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 21

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gin Pro Ser Gin

10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro Ala 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gin Val 65 70 75 80

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Ile Ala Asp Tyr Gly Gly Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr 100 105 110

Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120

153

EP 2 817 338 B1 <210> 22 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 22

Asp Ile Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30

<td>Leu</td><td>Asn</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>His</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td>

55 60

<td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Leu</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Ile</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Cys</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Asp</td><td>Met</td><td>Leu</td><td>Pro</td><td>Trp</td>

90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 23 <211> 117 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

154

EP 2 817 338 B1

<td colspan="7">&lt;400&gt; 23</td><td colspan="2" rowspan="2">Gly Pro</td><td rowspan="2">Glu 10</td><td rowspan="2">Leu</td><td rowspan="2">Lys</td><td rowspan="2">Lys</td><td rowspan="2">Pro</td><td rowspan="2">Gly 15</td><td rowspan="2">Glu</td>

<td>Gin 1</td><td>Ile</td><td colspan="3">Gin Leu Val 5</td><td colspan="2">Gin Ser</td>

<td>Thr</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Ile 20</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Ser 25</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Thr 30</td><td>Asp</td><td>Tyr</td>

<td>Ser</td><td>Met</td><td>His 35</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Gin</td><td>Ala 40</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Leu 45</td><td>Lys</td><td>Trp</td><td>Met</td>

<td>Gly</td><td>Trp 50</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Thr</td><td>Glu</td><td>Thr 55</td><td>Gly</td><td>Glu</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Tyr 60</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Phe</td>

<td>Lys 65</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ala</td><td>Phe 70</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Thr</td><td>Ser 75</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Tyr 80</td>

<td>Leu</td><td>Gin</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Asn 85</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Asn</td><td>Glu</td><td>Asp 90</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Phe 95</td><td>Cys</td>

<td>Ala</td><td>Arg</td><td>Tyr</td><td>Asp 100</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Met</td><td>Asp 105</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly 110</td><td>Thr</td><td>Ser</td>

<td>Val</td><td>Thr</td><td>Val 115</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<210> 24 <211> 106 5 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 24

Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Thr Arg Asn Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 25 15 <211> 124

155

EP 2 817 338 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 25

<td>Gin</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Glu</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Ile</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Gin</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Thr</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Ser</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ser</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Met</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Gly</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Arg</td><td>Gin</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Glu</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td>

40 45

Trp Leu Ala Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

<td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Lys</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Gin</td><td>Val</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Phe</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Cys</td><td>Ala</td><td>Arg</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Asn</td><td>Tyr</td><td>Val</td><td>Tyr</td><td>Asp</td><td>Pro</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Met</td><td>Asp</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 26 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

156

EP 2 817 338 B1

<td colspan="2">&lt;400&gt; 26</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Asn</td><td>Ile</td><td>Met</td><td>Met</td><td>Thr</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Gly</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Glu</td><td>Lys</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Met</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Leu</td><td>Tyr</td><td>Ser</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Asn</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Asn</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Gin</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Pro</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Arg</td><td>Glu</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Pro</td><td>Asp</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Thr</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Ile</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Gin</td><td>Val</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Val</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>His</td><td>Gin</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Trp</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Ile</td><td>Lys</td>

100 105 110 <210> 27 <211> 119 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 27

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr 20 25 30

Lys Met His Trp Val Lys Gin Ser His Val Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Arg Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Ala Thr Ser Tyr Asn Gin Asn Phe 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Asp Leu His Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Arg Tyr Asp Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 28 <211> 107

157

EP 2 817 338 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="2">&lt;400&gt; 28</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Glu</td><td>Ile</td><td>Gin</td><td>Met</td><td>Thr</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Met</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Gly</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Asp</td><td>Arg</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Gin</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Gin</td><td>Asp</td><td>Ile</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Asn</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Asn</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Phe</td><td>Leu</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Ile</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Glu</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Ser</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Phe</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Phe</td><td>Tyr</td><td>Glu</td><td>Phe</td><td>Pro</td><td>Phe</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 29 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

158

EP 2 817 338 B1 <400> 29

Gin Ala Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly 15 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn 20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Thr Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Phe 85 90 95

Ala Arg Ser Pro Tyr Asp Tyr His Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp 100 105 110

Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 30 <211> 108 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 30

Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Leu 15 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu 35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met 65 70 75

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Tyr His Arg Ser 85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 31 <211> 120

Thr

Tyr

Ile

Phe

Tyr

Cys

Gly

Gly

Ser

Trp

Ser

Glu

Pro

159

EP 2 817 338 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="2">&lt;400&gt; 31</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gin</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Glu</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Ile</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Gin</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Thr</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Ser</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ser</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Met</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Gly</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Arg</td><td>Gin</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Trp</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>His</td><td>Ile</td><td>Trp</td><td>Trp</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Arg</td><td>Tyr</td><td>Asn</td><td>Pro</td><td>Val</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Lys</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Val</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Phe</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ile</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Cys</td><td>Ala</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Val</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 120 <210> 32 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

160

EP 2 817 338 B1

<td colspan="2">&lt;400&gt; 32</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Asp 1</td><td>Val</td><td>Glu</td><td>Met</td><td>Thr 5</td><td>Gin</td><td>Thr</td><td>Pro</td><td>Leu</td><td>Thr 10</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Ile 15</td><td>Gly</td>

<td>Gin</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Ser 20</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ser 25</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Ser 30</td><td>Asp</td><td>Ser</td>

<td>Asp</td><td>Gly</td><td>Lys 35</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>Asn</td><td>Trp 40</td><td>Met</td><td>Phe</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Pro 45</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Ser</td>

<td>Pro</td><td>Lys 50</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Leu 55</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Asp 60</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td>

<td>Asp 65</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Ser 70</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp 75</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ile 80</td>

<td>Ser</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Glu</td><td>Ala 85</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>Val 90</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Trp</td><td>Gin 95</td><td>Gly</td>

<td>Lys</td><td>His</td><td>Phe</td><td>Pro 100</td><td>Trp</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Gly 105</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu 110</td><td>Ile</td><td>Lys</td>

<210> 33 <211> 117 5 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 33

Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Ser Met His Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met 35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Val Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp Phe

55 60

Met Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80

Leu Gin Ile Asn Asn Leu Glu Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Phe Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser 100 105 110

Val Thr Val Ser Ser 115

161

EP 2 817 338 B1 <210> 34 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="2">&lt;400&gt; 34</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gin</td><td>Ile</td><td>Val</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Leu</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Gly</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Glu</td><td>Lys</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Met</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Met</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Met</td><td>Glu</td><td>Ala</td><td>Glu</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Asp</td><td>Ala</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Trp</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Pro</td><td>Phe</td><td>Thr</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Phe</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 35 <211> 124 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

162

EP 2 817 338 B1 <400> 35

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gin Pro Ser 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr 20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gly Lys Gly Leu 35 40 45

Trp Leu Ala His Ile Trp Trp Asp Asp Val Lys Arg Tyr Asn Pro 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Ser Gin 65 70 75

Phe Leu Lys Ile Ala Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Ile Val Ser Phe Asp Asn Asp Val Val Ser Ala Met 100 105 110

Gin

Ser

Glu

Ala

Val

Tyr

Asp

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 36 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 36

<img file="PL2817338T3_D0039.tif" />

Gly

Asn

Ile

Gly

Ser Gly Ser Gly Thr Gin Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Met Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gin Ala Tyr Asp Val Pro Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 <210> 37 15 <211> 117

163

EP 2 817 338 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="7">&lt;400&gt; 37</td><td colspan="5" rowspan="2">Gly Ala Glu Leu Ala 10</td><td rowspan="2">Lys</td><td rowspan="2">Pro</td><td rowspan="2">Gly 15</td><td rowspan="2">Ala</td>

<td colspan="2">Gin Val 1</td><td colspan="2">Gin Leu</td><td>Gin 5</td><td>Gin</td><td>Ser</td>

<td>Ser</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Met</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Arg</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Trp</td><td>Ile</td><td>His</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Pro</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Glu</td><td>Phe</td><td>Asn</td><td>Gin</td><td>Asn</td><td>Phe</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Lys</td><td>Asp</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Ser</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Met</td><td>Gin</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Val</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Ala</td><td>Arg</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Phe</td><td>Phe</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Thr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 <210> 38 <211> 108 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

164

EP 2 817 338 B1

<td colspan="5">&lt;400&gt; 38</td><td colspan="3" rowspan="3">Gin Thr Thr</td><td rowspan="3">Ser</td><td colspan="6" rowspan="2">Ser Leu Ser Ala Ser Leu</td><td rowspan="3">Gly</td>

<td rowspan="2">Asp 1</td><td rowspan="2">Ile</td><td colspan="2" rowspan="2">Gin Met</td><td rowspan="2">Thr 5</td>

<td colspan="4">10</td><td colspan="2">15</td>

<td>Asp</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Arg</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Asn</td><td>Ile</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Asn</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>His</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Pro</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Ile</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Glu</td><td>Arg</td><td>Pro</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td>Arg</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 39 <211> 117 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 39

Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Glu 15 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30

Trp Met Asp Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Glu Ile Arg Asn Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60

Ser Val Lys Gly Lys Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Arg 65 70 75 80

Val Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Ala Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95

Tyr Cys Thr Ala Tyr Ser Asn Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110

Val Thr Val Ser Thr 115

165

EP 2 817 338 B1 <210> 40 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="5">&lt;400&gt; 40</td><td colspan="3" rowspan="3">Gin Ser Pro</td><td rowspan="3">Ser</td><td colspan="6" rowspan="2">Ser Leu Ser Ala Ser Leu</td><td rowspan="3">Gly</td>

<td rowspan="2">Asp 1</td><td rowspan="2">Ile</td><td colspan="2" rowspan="2">Gin Met</td><td rowspan="2">Thr 5</td>

<td colspan="3">10</td><td colspan="3">15</td>

<td>Gly</td><td>Lys</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Asp</td><td>Ile</td><td>His</td><td>Lys</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Val</td><td>Ala</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>His</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Pro</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>His</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Pro</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Ile</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Tyr</td><td>Asn</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Tyr</td><td>Thr</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Phe</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td>Arg</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 41 <211> 118 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

166

EP 2 817 338 B1

<td colspan="8">&lt;400&gt; 41</td><td rowspan="3">Ala</td><td colspan="7" rowspan="2">Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala</td>

<td colspan="2" rowspan="2">Glu Val 1</td><td colspan="2" rowspan="2">Gin Leu</td><td rowspan="2">Gin 5</td><td rowspan="2">Gin</td><td rowspan="2">Ser</td><td rowspan="2">Gly</td>

<td colspan="2">10</td><td colspan="5">15</td>

<td>Ser</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Phe</td><td>Asn</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td>Asp</td><td>Ser</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Leu</td><td>His</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Pro</td><td>Glu</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Asp</td><td>Pro</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>Glu</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Pro</td><td>Asn</td><td>Phe</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gin</td><td>Asp</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>Asp</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Tyr</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Leu</td><td>Gin</td><td>Leu</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Ala</td><td>Tyr</td><td>Gly</td><td>Asn</td><td>Tyr</td><td>Val</td><td>Arg</td><td>His</td><td>Phe</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Thr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Thr</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 <210> 42 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 42

Glu Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Gin Ala Thr Gin Asp Ile Val Lys Asn 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Pro Pro Ser Phe Leu Ile 35 40 45

Tyr Tyr Ala Thr Glu Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Arg Asn Leu Glu Ser 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Asp His Tyr Cys Leu Gin Phe Tyr Glu Phe Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105 <210> 43 15 <211> 121

167

EP 2 817 338 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="4">&lt;400&gt; 43</td><td colspan="11" rowspan="2">Gin Gin Ser Gly Thr Glu Leu Val Arg Pro Gly</td><td rowspan="3">Thr</td>

<td colspan="2" rowspan="2">Gin Val 1</td><td rowspan="2">Gin</td><td rowspan="2">Leu</td>

<td colspan="3">5</td><td colspan="4">10</td><td colspan="4">15</td>

<td>Ser</td><td>Val</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Asn</td><td>His</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Ile</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Val</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>His</td><td>Tyr</td><td>Asn</td><td>Glu</td><td>Lys</td><td>Phe</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Lys</td><td>Asp</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Tyr</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Met</td><td>His</td><td>Leu</td><td>Asn</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Val</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Cys</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Ala</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Tyr</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>His</td><td>Glu</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Met</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Gin</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 120 <210> 44 <211> 113 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 44

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly

168

EP 2 817 338 B1

10 15

Gin Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser 20 25 30

Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Glu Pro Gly Gin 35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Val Ser Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Gly Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

His Tyr Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110

Lys <210> 45 <211> 124 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 45

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Ser 20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Arg Ile Tyr Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

169

EP 2 817 338 B1

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td>95</td>

<td>Ala</td><td>Met</td><td>Gly</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Asn</td><td>Tyr</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Tyr Tyr</td><td>Ser</td><td>Met Asp</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td>

115 120 <210> 46 <211> 105 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="5">&lt;400&gt; 46</td><td colspan="3" rowspan="3">Gin Thr Thr</td><td rowspan="3">Ser</td><td colspan="6" rowspan="2">Ser Leu Ser Ala Ser Leu</td><td rowspan="3">Gly</td>

<td rowspan="2">Asp 1</td><td rowspan="2">Ile</td><td colspan="2" rowspan="2">Gin Met</td><td rowspan="2">Thr 5</td>

<td colspan="5">10</td><td>15</td>

<td>Asp</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Arg</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Asp</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td>Asn</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Asn</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Leu</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>His</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Gin</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Ile</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Cys</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Pro</td><td>Phe</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 47 <211> 120 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 47

Gin Val Gin Leu Gin Gin Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

170

EP 2 817 338 B1

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Glu Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Tyr Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Asp Tyr Gly Asn Pro Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110

Gly Ser Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 108 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 48

Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Lys Val Thr Leu Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Arg 20 25 30

Tyr Leu Tyr Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Ile Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Ser Tyr Phe Cys His Gin Trp Ser Asn Tyr Pro 85 90 95

Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 49 <211> 124 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja

171

EP 2 817 338 B1 <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 49

<td colspan="2">Gin Val 1</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Lys 5</td><td>Glu</td><td>Ser</td><td colspan="3">Gly Pro Gly 10</td><td>Ile</td><td>Leu</td><td colspan="2">Gin Pro</td><td colspan="2">Ser Gin 15</td>

<td>Thr</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Ser</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ser</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Asn</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Ile</td><td>Gly</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Arg</td><td>Gin</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Trp</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>His</td><td>Ile</td><td>Trp</td><td>Trp</td><td>Asn</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Lys</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Asn</td><td>Pro</td><td>Ser</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Lys</td><td>Glu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Asn</td><td>Gin</td><td>Val</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Phe</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Asn</td><td>Val</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Phe</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Cys</td><td>Val</td><td>Gin</td><td>Ile</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Asp</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Val</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td></td><td></td><td>115</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>120</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<210> 50 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 50

Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly 15 10 15

172

EP 2 817 338 B1

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met 20 25 30

His Trp Tyr Gin Gin Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr 35 40 45

Asp Ser Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu 65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr 85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 51 <211> 124 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 51

Gin Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gin Pro Ser Gin 15 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30

Gly Met Gly Val Gly Trp Ile Arg Gin Pro Ser Gly Glu Gly Leu Glu 35 40 45

Trp Leu Thr Asp Ile Trp Trp Asp Asp Asn Lys Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Ser Asn Gin Val 65 70 75 80

Phe Leu Asn Ile Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr 85 90 95

Cys Ala Arg Arg Val Asn Tyr Tyr Tyr Asp Pro Tyr Tyr Ala Met Asp 100 105 110

Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 52 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja

173

EP 2 817 338 B1 <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 52

<td>Asp 1</td><td>Val</td><td>Glu</td><td>Met</td><td>Thr 5</td><td>Gin</td><td>Thr</td><td>Pro</td><td>Leu</td><td>Thr 10</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Ile 15</td><td>Gly</td>

<td>Gin</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Ser 20</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ser 25</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Ser 30</td><td>Asp</td><td>Ser</td>

<td>Asp</td><td>Gly</td><td>Lys 35</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>Asn</td><td>Trp 40</td><td>Met</td><td>Phe</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Pro 45</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Ser</td>

<td>Pro</td><td>Lys 50</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Leu 55</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Asp 60</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td>

<td>Asp 65</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Ser 70</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp 75</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ile 80</td>

<td>Ser</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Glu</td><td>Ala 85</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>Val 90</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Trp</td><td>Gin 95</td><td>Gly</td>

<td>Lys</td><td>His</td><td>Phe</td><td>Pro 100</td><td>Trp</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Gly 105</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu 110</td><td>Ile</td><td>Lys</td>

<210> 53 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 53

Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 15 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

<td>Ser</td><td>Met</td><td>His 35</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Gin</td><td>Ala 40</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Leu 45</td><td>Lys</td><td>Trp</td><td>Met</td>

<td>Gly</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Thr</td><td>Glu</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Glu</td><td>Pro</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Phe</td>

55 60

Met Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Phe 65 70 75 80

Leu Gin Ile Asn Asn Leu Glu Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95

Ala Arg Phe Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Ser 100 105 110

174

EP 2 817 338 B1 <210> 54 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="16">&lt;400&gt; 54</td>

<td>Gin 1</td><td>Ile</td><td colspan="2">Val Leu</td><td colspan="3">Thr Gin Ser 5</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Ile 10</td><td>Met</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Pro 15</td><td>Gly</td>

<td>Glu</td><td>Lys</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Met</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>His</td><td>Trp</td><td>Phe</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Thr</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Met</td><td>Glu</td><td>Ala</td><td>Glu</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Asp</td><td>Ala</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Tyr</td><td>Pro</td><td>Tyr</td><td>Thr</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Phe</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Val</td><td>Glu</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 55 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

175

EP 2 817 338 B1

<td colspan="4">&lt;400&gt; 55</td><td colspan="11" rowspan="2">Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly</td><td rowspan="3">Ala</td>

<td colspan="2" rowspan="2">Gin Val 1</td><td rowspan="2">Gin</td><td rowspan="2">Leu</td>

<td colspan="3">5</td><td colspan="4">10</td><td colspan="4">15</td>

<td>Ser</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Asp</td><td>Gin</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Glu</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Gly</td><td>Asn</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Asn</td><td>Glu</td><td>Lys</td><td>Phe</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Lys</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Tyr</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Met</td><td>Gin</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Val</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Cys</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Ala</td><td>Arg</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Ala</td><td>Trp</td><td>Phe</td><td>Ala</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Gin</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 120 <210> 56 <211> 108 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 56

Gin Ile Val Leu Thr Gin Ser Pro Thr Ile Met Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Val Thr Met Thr Cys Thr Ala Ser Ser Ser Val Thr Ser Ser 20 25 30

Tyr Leu His Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Leu Trp 35 40 45

Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu 65 70 75 80

Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gin Phe His Arg Ser Pro 85 90 95

Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

176

EP 2 817 338 B1 <210> 57 <211> 120 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="2">&lt;400&gt; 57</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gin</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Glu</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Ile</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Gin</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Thr</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Ser</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ser</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Met</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Gly</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Arg</td><td>Gin</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Trp</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>His</td><td>Ile</td><td>Trp</td><td>Trp</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Arg</td><td>Tyr</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Ala</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Lys</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Gin</td><td>Val</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Phe</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ile</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Asp</td><td>Ala</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Cys</td><td>Ala</td><td>Arg</td><td>Ile</td><td>Val</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>His</td><td>Pro</td><td>Pro</td><td>Phe</td><td>Ala</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 120 <210> 58 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

177

EP 2 817 338 B1

<td colspan="15">&lt;400&gt; 58</td>

<td>Asp 1</td><td>Ile Val</td><td>Leu</td><td>Thr 5</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Leu</td><td>Ser 10</td><td>Leu</td><td>Pro</td><td>Val</td><td>Asn</td><td>Ile 15</td><td>Gly</td>

<td>Asp</td><td>Gin Ala</td><td>Ser 20</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ser 25</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Leu 30</td><td>Asn</td><td>Ser</td>

<td>Asp</td><td>Gly Phe 35</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>Asp</td><td>Trp 40</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Pro 45</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Ser</td>

<td>Pro</td><td>Gin Phe 50</td><td>Leu</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Leu 55</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Arg</td><td>Phe 60</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td>

<td>Asp 65</td><td>Arg Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser 70</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp 75</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ile 80</td>

<td>Ser</td><td>Arg Val</td><td>Glu</td><td>Ala 85</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>Val 90</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Phe</td><td>Gin 95</td><td>Ser</td>

<td>Asn</td><td>Tyr Leu</td><td>Pro</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>Arg</td>

100 105 110 <210> 59 <211> 119 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 59

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Arg Phe 20 25 30

Tyr Met His Trp Val Lys Gin Ser Pro Glu Asn Ser Leu Glu Trp Gly 35 40 45

Glu Ile Asn Pro Ser Thr Gly Gly Thr Ile Ser Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Lys Ser Leu Thr Ser Glu Glu Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Thr Arg Gly Tyr Gly Ser Asn Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly 100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Thr 115

178

EP 2 817 338 B1 <210> 60 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="4">&lt;400&gt; 60</td><td colspan="2" rowspan="2">Thr Gin 5</td><td rowspan="2">Thr</td><td rowspan="2">Pro</td><td rowspan="2">Lys</td><td rowspan="2">Phe 10</td><td colspan="3" rowspan="2">Leu Leu Val</td><td rowspan="2">Ser</td><td rowspan="2">Ala 15</td><td rowspan="2">Gly</td>

<td>Ser 1</td><td>Ile</td><td colspan="2">Val Met</td>

<td>Asp</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Thr 20</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala 25</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Ser 30</td><td>Asn</td><td>Asp</td>

<td>Val</td><td>Ala</td><td>Trp 35</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro 40</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Lys 45</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Ile</td>

<td>Tyr</td><td>Tyr 50</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Arg</td><td>Tyr 55</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Asp 60</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Gly</td>

<td>Ser 65</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp 70</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Ile 75</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Gin</td><td>Ala 80</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Val 85</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Cys</td><td>Gin</td><td>Gin 90</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Pro 95</td><td>Trp</td>

<td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 61 <211> 118 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

179

EP 2 817 338 B1

<td colspan="6">&lt;400&gt; 61</td><td rowspan="3">Ser</td><td colspan="8" rowspan="2">Gly Pro Glu Leu Lys Arg Pro Gly</td><td rowspan="3">Glu</td>

<td rowspan="2">Gin 1</td><td rowspan="2">Ile</td><td rowspan="2">Gin</td><td colspan="3" rowspan="2">Leu Val Gin 5</td>

<td colspan="3">10</td><td colspan="5">15</td>

<td>Thr</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Asn</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Met</td><td>Asn</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Gin</td><td>Ala</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Trp</td><td>Met</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Asp</td><td>Pro</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Phe</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Lys</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ala</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Tyr</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Leu</td><td>Gin</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Asn</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Cys</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Ala</td><td>Arg</td><td>Ile</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Asn</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Thr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 <210> 62 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 62

Asp Ile Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp Ile Ser Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gin 65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gin Gin Gly Asn Thr Leu Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 63 <211> 121

180

EP 2 817 338 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="2">&lt;400&gt; 63</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Asp</td><td>Val</td><td>Gin</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Glu</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Ser</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Gin</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Ser</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Trp</td><td>Asn</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Arg</td><td>Gin</td><td>Phe</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Asn</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Trp</td><td>Met</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Asn</td><td>Pro</td><td>Ser</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Arg</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Lys</td><td>Asn</td><td>Gin</td><td>Phe</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Phe</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Leu</td><td>Asn</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Cys</td><td>Ala</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Met</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Gin</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 120 <210> 64 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

181

EP 2 817 338 B1 <400> 64

Glu Thr Thr Val Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Thr Thr 15 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Arg Cys Ile Thr Thr Pro Asp Ile Asp Asp 20 25 30

Met Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Glu Pro Pro Asn Leu Leu 35 40 45

Ser Glu Gly Asn Ser Leu Arg Pro Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 50 55 60

Ser Gly Tyr Gly Thr Asn Phe Val Phe Thr Ile Glu Asn Thr Leu 65 70 75

Glu Asp Val Ala Asp Tyr Tyr Cys Leu Gin Ser Asp Asn Met Pro 85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 65 <211> 117 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 65

Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Pro Gly 15 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr 20 25 30

Trp Met His Trp Val Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp 35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Glu Tyr Asn Gin Lys 50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala 65 70 75

Met Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ser Val Tyr Tyr 85 90 95

Ala Arg Lys Gly Ser Asn Arg Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Leu Val Thr Val Ser 115 <210> 66 <211> 104

Gly

Asp

Ile

Ser

Ser

Phe

Ala

Tyr

Ile

Phe

Tyr

Cys

Thr

182

EP 2 817 338 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="16">&lt;400&gt; 66</td>

<td>Gin 1</td><td>Ile</td><td colspan="2">Val Leu</td><td colspan="3">Thr Gin Ser 5</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Ile 10</td><td>Met</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Pro 15</td><td>Gly</td>

<td>Glu</td><td>Lys</td><td>Val</td><td>Thr 20</td><td>Met</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Ser</td><td>Ala 25</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ile</td><td>Asn 30</td><td>Tyr</td><td>Met</td>

<td>His</td><td>Trp</td><td>Tyr 35</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Gly 40</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Lys</td><td>Arg 45</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Tyr</td>

<td>Asp</td><td>Thr 50</td><td>Ser</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Ser 55</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ala</td><td>Arg 60</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td>

<td>Gly 65</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Tyr 70</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser 75</td><td>Ser</td><td>Met</td><td>Glu</td><td>Ala</td><td>Glu 80</td>

<td>Asp</td><td>Ala</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr 85</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>His</td><td>Gin</td><td>Arg 90</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Trp</td><td>Thr</td><td>Phe 95</td><td>Gly</td>

<td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 <210> 67 <211> 116 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 67

Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Val Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

183

EP 2 817 338 B1

25 30

Tyr Ile His Trp Val Lys Gin Arg Pro Glu Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Thr Lys Tyr Asp Pro Lys Phe 50 55 60

Gin Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

70 75 80

Leu Gin Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

90 95

Ala Arg Pro Thr Gly Tyr Phe Glu Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu 100 105 110

Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 108 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 68

Asp Ile Gin Met Thr Gin Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gin Asp Val Ile Asn Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Arg Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Ser Glu Arg Pro Tyr

90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 <210> 69 <211> 117

184

EP 2 817 338 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 69

<td>Glu 1</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu 5</td><td>Glu</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Gly 10</td><td>Leu</td><td>Val</td><td>Gin</td><td>Phe</td><td>Gly 15</td><td>Gly</td>

<td>Ser</td><td>Met</td><td>Lys</td><td>Leu 20</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Ala</td><td>Ala</td><td>Ser 25</td><td>Gly</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Ser 30</td><td>Asp</td><td>Ala</td>

<td>Trp</td><td>Met</td><td>Asp 35</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Arg</td><td>Gin</td><td>Ser 40</td><td>Pro</td><td>Glu</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Leu 45</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Val</td>

<td>Ala</td><td>Glu 50</td><td>Ile</td><td>Arg</td><td>Asn</td><td>Lys</td><td>Ala 55</td><td>Asn</td><td>Asn</td><td>His</td><td>Ala</td><td>Thr 60</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Pro</td><td>Glu</td>

<td>Ser 65</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Phe 70</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Asp 75</td><td>Asp</td><td>Ser</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Arg 80</td>

<td>Val</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Met 85</td><td>Asn</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Arg</td><td>Ala 90</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Ile 95</td><td>Tyr</td>

<td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Thr</td><td>Gly 100</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Phe</td><td>Ala 105</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly 110</td><td>Thr</td><td>Leu</td>

Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 70 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 70

<td>Asp</td><td>Val</td><td>Leu</td><td>Met</td><td>Thr</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Gly</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Asp</td><td>Gin</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Asn</td><td>Ile</td><td>Val</td><td>His</td><td>Ser</td>

25 30

185

EP 2 817 338 B1

Asp Arg Tyr Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Met Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Thr His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 71 <211> 118 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="3">&lt;400&gt; 71</td><td rowspan="2">Leu</td><td rowspan="2">Val 5</td><td rowspan="2">Gin</td><td rowspan="2">Ser</td><td rowspan="2">Gly</td><td colspan="3" rowspan="2">Pro Glu Leu 10</td><td rowspan="2">Lys</td><td rowspan="2">Lys</td><td rowspan="2">Pro</td><td rowspan="2">Gly 15</td><td rowspan="2">Glu</td>

<td>Gin 1</td><td>Ile</td><td>Gin</td>

<td>Thr</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>Ala</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Met</td><td>Gin</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Met</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Phe</td><td>Lys</td><td>Trp</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Thr</td><td>His</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Glu</td><td>Pro</td><td>Lys</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Phe</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Lys</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ala</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Tyr</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Leu</td><td>Gin</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Asp</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Phe</td><td>Cys</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Ala</td><td>Pro</td><td>Leu</td><td>Trp</td><td>Ser</td><td>Asp</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Phe</td><td>Ala</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Thr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 <210> 72 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja

186

EP 2 817 338 B1 <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="5">&lt;400&gt; 72</td><td rowspan="2">Gin</td><td colspan="2" rowspan="2">Ser Pro</td><td rowspan="2">Ser</td><td rowspan="2">Ser 10</td><td rowspan="2">Met</td><td rowspan="2">Ser</td><td rowspan="2">Ala</td><td rowspan="2">Ser</td><td rowspan="2">Leu 15</td><td rowspan="2">Gly</td>

<td>Glu 1</td><td>Ile</td><td colspan="2">Gin Met</td><td>Thr 5</td>

<td>Asp</td><td>Arg</td><td>Ile</td><td>Thr 20</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Gin</td><td>Ala 25</td><td>Thr</td><td>Gin</td><td>Asp</td><td>Ile</td><td>Val 30</td><td>Lys</td><td>Asn</td>

<td>Leu</td><td>Asn</td><td>Trp 35</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro 40</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Pro</td><td>Ser 45</td><td>Phe</td><td>Leu</td><td>Ile</td>

<td>Tyr</td><td>Tyr 50</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>Ala 55</td><td>Glu</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ala 60</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td>

<td>Ser 65</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Asp 70</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile 75</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Ser 80</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Phe</td><td>Ala</td><td>Asp 85</td><td>Tyr</td><td>His</td><td>Cys</td><td>Leu</td><td>Gin 90</td><td>Phe</td><td>Tyr</td><td>Glu</td><td>Phe</td><td>Pro 95</td><td>Phe</td>

<td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 73 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja 10 <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 73

<td>Gin</td><td>Val</td><td>Gin</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Val</td><td>Arg</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Thr</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Ser</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Asn</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Ile</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Ile</td>

40 45

187

EP 2 817 338 B1

<td>Gly</td><td>Val</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>His</td><td>Tyr</td><td>Asn</td><td>Glu</td><td>Lys</td><td>Phe</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Lys</td><td>Asp</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Val</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>His</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Met</td><td>Gin</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Val</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Cys</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Ala</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Tyr</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Asn</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Met</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Gin</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 120 <210> 74 <211> 112 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="2">&lt;400&gt; 74</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Asp 1</td><td>Val</td><td>Val</td><td>Leu</td><td>Thr 5</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Leu</td><td>Ser 10</td><td>Leu</td><td>Pro</td><td>Val</td><td>Asn</td><td>Ile 15</td><td>Gly</td>

<td>Asp</td><td>Gin</td><td>Ala</td><td>Ser 20</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ser 25</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Leu 30</td><td>Asn</td><td>Ser</td>

<td>Asp</td><td>Gly</td><td>Phe 35</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>Asp</td><td>Trp 40</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Pro 45</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Ser</td>

<td>Pro</td><td>Gin 50</td><td>Phe</td><td>Leu</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Leu 55</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Arg</td><td>Phe 60</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td>

<td>Asp 65</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser 70</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp 75</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ile 80</td>

<td>Ser</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Glu</td><td>Ala 85</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>Val 90</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Phe</td><td>Gin 95</td><td>Ser</td>

<td>Asn</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>Pro 100</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Ala 105</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu 110</td><td>Leu</td><td>Arg</td>

<210> 75 <211> 119 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

188

EP 2 817 338 B1

<td colspan="8">&lt;400&gt; 75</td><td rowspan="2">Pro</td><td rowspan="2">Glu 10</td><td rowspan="2">Leu</td><td rowspan="2">Val</td><td rowspan="2">Lys</td><td rowspan="2">Pro</td><td rowspan="2">Gly 15</td><td rowspan="2">Ala</td>

<td colspan="2">Glu Val 1</td><td colspan="2">Gin Leu</td><td>Gin 5</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Gly</td>

<td>Ser</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Phe</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Met</td><td>His</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Glu</td><td>Asn</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Glu</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Asn</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Phe</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Lys</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Asp</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Tyr</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Met</td><td>Gin</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Glu</td><td>Glu</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Val</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Thr</td><td>Arg</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Cys</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Asp</td><td>Val</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Gly</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Thr</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 <210> 76 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 76

Asp Ile Lys Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30

Leu Ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gin Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Thr Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp Glu Phe Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 77 <211> 117

189

EP 2 817 338 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="4">&lt;400&gt; 77</td><td colspan="6" rowspan="2">Gin Gin Ser Gly Pro Glu</td><td rowspan="3">Leu</td><td rowspan="3">Val</td><td colspan="2" rowspan="3">Lys Pro</td><td rowspan="3">Gly 15</td><td rowspan="3">Thr</td>

<td colspan="2" rowspan="2">Gin Val 1</td><td rowspan="2">Gin</td><td rowspan="2">Leu</td>

<td colspan="3">5</td><td colspan="3">10</td>

<td>Leu</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Asp</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Trp</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>Asn</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Glu</td><td>Lys</td><td>Phe</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Lys</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Tyr</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Met</td><td>Gin</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Glu</td><td>Asn</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Val</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Cys</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Ala</td><td>Arg</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Pro</td><td>Phe</td><td>Ala</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Leu</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 <210> 78 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

190

EP 2 817 338 B1

<td colspan="5">&lt;400&gt; 78</td><td colspan="3" rowspan="3">Gin Thr Thr</td><td rowspan="3">Ser</td><td colspan="6" rowspan="2">Ser Leu Ser Ala Ser Leu</td><td rowspan="3">Gly</td>

<td rowspan="2">Asp 1</td><td rowspan="2">Ile</td><td colspan="2" rowspan="2">Gin Met</td><td rowspan="2">Thr 5</td>

<td colspan="5">10</td><td>15</td>

<td>Asp</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Arg</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Asp</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Asn</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>His</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Gin</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Ile</td><td>Ala</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Cys</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Asn</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Arg</td><td>Thr</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Phe</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 79 <211> 121 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 79

Glu Val Gin Leu Val Glu Cys Gly Gly Cys Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

Tyr Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Glu Ile Ser Ile Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val 50 55 60

Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

70 75 80

Leu Glu Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Glu Gly Tyr Asp Tyr Asp Val Arg Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110

Gin Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser 115 120

191

EP 2 817 338 B1 <210> 80 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="5">&lt;400&gt; 80</td><td colspan="3" rowspan="3">Gin Ser Pro</td><td rowspan="3">Ser</td><td colspan="6" rowspan="2">Ser Met Phe Ala Ser Leu</td><td rowspan="3">Gly</td>

<td rowspan="2">Asp 1</td><td rowspan="2">Ile</td><td colspan="2" rowspan="2">Gin Met</td><td rowspan="2">Ile 5</td>

<td colspan="4">10</td><td colspan="2">15</td>

<td>Asp</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Arg</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Ile</td><td>Arg</td><td>Gly</td><td>Thr</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Asp</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Asn</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Asn</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Gly</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Ser</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Phe</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Asn</td><td>Ala</td><td>Tyr</td><td>Pro</td><td>Leu</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 81 <211> 119 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

192

EP 2 817 338 B1

<td colspan="4">&lt;400&gt; 81</td><td rowspan="2">Lys 5</td><td rowspan="2">Glu</td><td colspan="2" rowspan="2">Ser Gly</td><td rowspan="2">Pro</td><td colspan="3" rowspan="2">Gly Leu Val 10</td><td rowspan="2">Ala</td><td rowspan="2">Pro</td><td rowspan="2">Ser 15</td><td rowspan="2">Gin</td>

<td>Gin 1</td><td>Val</td><td colspan="2">Gin Leu</td>

<td>Ser</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Ala</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Phe</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Ala</td><td>Ile</td><td>His</td><td>Trp</td><td>Phe</td><td>Arg</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Leu</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Val</td><td>Ile</td><td>Trp</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>Asn</td><td>Tyr</td><td>Asn</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Leu</td><td>Met</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Lys</td><td>Asp</td><td>Asn</td><td>Ser</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Val</td><td>Phe</td><td>Leu</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Lys</td><td>Met</td><td>Asn</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Thr</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Met</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Ala</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Arg</td><td>Asp</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Asp</td><td>Asn</td><td>Asn</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Met</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Thr</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 <210> 82 <211> 108 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 82

Asp Ile Lys Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly 15 10 15

Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gin Asp Ile Asn Ser Tyr 20 25 30

Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile 35 40 45

Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Gin Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr 65 70 75 80

Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Gin Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 83 <211> 117

193

EP 2 817 338 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="4">&lt;400&gt; 83</td><td colspan="6" rowspan="2">Val Glu Ser Gly Gly Gly</td><td rowspan="3">Leu</td><td rowspan="3">Val</td><td colspan="2" rowspan="3">Gin Pro</td><td rowspan="3">Lys 15</td><td rowspan="3">Gly</td>

<td colspan="2" rowspan="2">Glu Val 1</td><td rowspan="2">Gin</td><td rowspan="2">Leu</td>

<td colspan="3">5</td><td colspan="3">10</td>

<td>Ser</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Leu 20</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Ala</td><td>Val</td><td>Ser 25</td><td>Ala</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Thr 30</td><td>Thr</td><td>Tyr</td>

<td>Ala</td><td>Met</td><td>Asn 35</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Arg</td><td>Gin</td><td>Ala 40</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Leu 45</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Val</td>

<td>Ala</td><td>Arg 50</td><td>Ile</td><td>Arg</td><td>Asn</td><td>Lys</td><td>Ser 55</td><td>Asn</td><td>Asn</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Thr 60</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Asp</td>

<td>Ser 65</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Asp</td><td>Arg</td><td>Phe 70</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Asp 75</td><td>Asp</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Met 80</td>

<td>Leu</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Met 85</td><td>Asn</td><td>Asn</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ile 90</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Met 95</td><td>Tyr</td>

<td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Val</td><td>Phe 100</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Val 105</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Gly 110</td><td>Thr</td><td>Leu</td>

<td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

115 <210> 84 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

194

EP 2 817 338 B1 <400> 84

<td>Ser 1</td><td>Ile</td><td>Val</td><td>Met</td><td>Thr 5</td><td>Gin</td><td>Thr</td><td>Pro</td>

<td>Asp</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Thr 20</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Lys</td>

<td>Val</td><td>Val</td><td>Trp 35</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro 40</td>

<td>Tyr</td><td>Tyr 50</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Arg</td><td>Tyr 55</td><td>Thr</td>

<td>Ser 65</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp 70</td><td>Phe</td><td>Ser</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Val 85</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Cys</td>

<td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Gly 100</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td>

<210> 85 <211> 118 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło

Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala 10 15

Ala Ser Gin Ser Val Ser Asn 25 30

Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu 45

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala 60

Phe Thr Ile Ser Thr Val Gin 75

Gin Gin Asp Tyr Thr Ser Pro 90 95

Glu Ile Arg 105 <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 85

Gin Ile Gin Leu Val Gin Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly 15 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn 20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp 35 40 45

Ala Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Asp Asp 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala 65 70 75

Leu Gin Ile Ile Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe 85 90 95

Ala Arg Ile Gly Asp Ser Ser Pro Ser Asp Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 86 <211> 107

Gly

Asp

Ile

Gly

Ala

Trp

Glu

Tyr

Met

Phe

Ser

Cys

Thr

195

EP 2 817 338 B1 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="10">&lt;400&gt; 86</td><td rowspan="2">Met</td><td rowspan="2">Ser</td><td rowspan="2">Ile</td><td rowspan="2">Ser</td><td rowspan="2">Val 15</td><td rowspan="2">Gly</td>

<td>Asp 1</td><td>Ile</td><td colspan="2">Val Met</td><td colspan="2">Thr Gin 5</td><td>Ser</td><td>His</td><td>Lys</td><td>Phe 10</td>

<td>Asp</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Ser 20</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala 25</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Asp</td><td>Val</td><td>Ser 30</td><td>Ile</td><td>Phe</td>

<td>Val</td><td>Ala</td><td>Trp 35</td><td>Tyr</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>Lys</td><td>Pro 40</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Lys 45</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Ile</td>

<td>Tyr</td><td>Ser 50</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Arg</td><td>Tyr 55</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Asp 60</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Gly</td>

<td>Ser 65</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Asp 70</td><td>Phe</td><td>Ile</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Ile 75</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Gin</td><td>Ala 80</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Ala</td><td>Val 85</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Gin</td><td>Gin 90</td><td>His</td><td>Tyr</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Pro 95</td><td>Phe</td>

<td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Ile</td><td>Arg</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 87 <211> 118 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 87

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Gly 15 10 15

196

EP 2 817 338 B1

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Asp Met Ser Trp Val Arg Gin Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ala Thr Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Val Arg Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gin Met Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gin Ala Ile Gly Thr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 <210> 88 <211> 107 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 88

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ser Ser Val Gly 15 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Gin Gly Lys Ser Pro Gin Leu Leu Val 35 40 45

Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gin Phe Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gin His His Tyr Asp Ser Pro Leu 85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Arg 100 105 <210> 89 <211> 120 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja

197

EP 2 817 338 B1 <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 89

<td colspan="2" rowspan="2">Asp Val 1</td><td colspan="2" rowspan="2">Gin Leu</td><td colspan="8">Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val</td><td rowspan="2">Gin</td><td rowspan="2">Pro</td><td rowspan="2">Gly 15</td><td rowspan="2">Gly</td>

<td>5</td><td colspan="7">10</td>

<td>Ser</td><td>Arg</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Ala</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Phe</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Met</td><td>His</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Arg</td><td>Gin</td><td>Ala</td><td>Pro</td><td>Glu</td><td>Lys</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Val</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ala</td><td>Tyr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Asn</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Val</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Lys</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Asp</td><td>Asn</td><td>Pro</td><td>Lys</td><td>Asn</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Phe</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Leu</td><td>Gin</td><td>Met</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Met</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Ala</td><td>Arg</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Gly</td><td>Asn</td><td>Tyr</td><td>Asp</td><td>Ala</td><td>Met</td><td>Asp</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Gin</td>

<td></td><td></td><td></td><td>100</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>105</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>110</td><td></td><td></td>

<td>Gly</td><td>Thr</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td></td><td></td><td>115</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>120</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<210> 90 <211> 113 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 90

Asp Ile Val Met Thr Gin Ser Thr Ser Ser Leu Ala Met Ser Val Gly 15 10 15

Gin Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gin Ser Leu Leu Asn Ser

198

EP 2 817 338 B1

25 30

Ser Asn Gin Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Glu Pro Gly Gin 35 40 45

Ser Pro Lys Leu Leu Val Ser Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val 50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 65 70 75 80

Ile Ser Gly Val Gin Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 85 90 95

His Tyr Ser Ile Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu 100 105 110

Lys <210> 91 <211> 120 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<400> 91

Glu Val Leu Leu Gin Arg Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Val Thr Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30

Asn Met Asp Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Asn Ile Asn Thr Tyr Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Pro Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Arg Leu Arg Tyr Gly Gly His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin

100 105 110

Gly Thr Ala Leu Thr Val Ser Ser 115 120

199

EP 2 817 338 B1 <210> 92 <211> 108 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa"

<td colspan="2">&lt;400&gt; 92</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Asp</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td>Met</td><td>Thr</td><td>Gin</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Met</td><td>Tyr</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Gly</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Glu</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Lys</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gin</td><td>Asp</td><td>Ile</td><td>Asn</td><td>Ser</td><td>Phe</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>Ser</td><td>Trp</td><td>Phe</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Lys</td><td>Ser</td><td>Pro</td><td>Lys</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Ile</td>

<td></td><td></td><td>35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>45</td><td></td><td></td><td></td>

<td>Tyr</td><td>Arg</td><td>Ala</td><td>Asn</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Val</td><td>Asp</td><td>Gly</td><td>Val</td><td>Pro</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Gly</td>

<td></td><td>50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Ser</td><td>Gly</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Gin</td><td>Glu</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Tyr</td>

<td>65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>80</td>

<td>Glu</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Leu</td><td>Gin</td><td>Tyr</td><td>Asp</td><td>Glu</td><td>Phe</td><td>Pro</td><td>Tyr</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td>85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>95</td><td></td>

<td>Thr</td><td>Phe</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Ile</td><td>Lys</td><td>Arg</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

100 105 <210> 93 <211> 117 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" <400> 93

<td>Glu</td><td>Val</td><td>Met</td><td>Leu</td><td>Val</td><td>Glu</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Val</td><td>Lys</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Gly</td>

<td>1</td><td></td><td></td><td></td><td>5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>15</td><td></td>

<td>Ser</td><td>Leu</td><td>Lys</td><td>Leu</td><td>Ser</td><td>Cys</td><td>Ala</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Phe</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Tyr</td>

25 30

200

EP 2 817 338 B1

<td>Ala</td><td>Met</td><td>Ser 35</td><td>Trp</td><td>Val</td><td>Arg</td><td>Gin</td><td>Thr 40</td><td>Pro</td><td>Glu</td><td>Lys</td><td>Arg</td><td>Leu 45</td><td>Glu</td><td>Trp</td><td>Val</td>

<td>Ala</td><td>Tyr 50</td><td>Ile</td><td>Ser</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Gly 55</td><td>Asp</td><td>His</td><td>Ile</td><td>Tyr</td><td>Tyr 60</td><td>Pro</td><td>Asp</td><td>Ser</td><td>Val</td>

<td>Arg 65</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Phe</td><td>Thr</td><td>Ile 70</td><td>Ser</td><td>Arg</td><td>Asp</td><td>Asn</td><td>Ala 75</td><td>Lys</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>Tyr 80</td>

<td>Leu</td><td>Gin</td><td>Met</td><td>Ser</td><td>Ser 85</td><td>Leu</td><td>Arg</td><td>Ser</td><td>Glu</td><td>Asp 90</td><td>Thr</td><td>Ala</td><td>Leu</td><td>Tyr</td><td>Asp 95</td><td>Cys</td>

<td>Ala</td><td>Arg</td><td>Val</td><td>Arg 100</td><td>Asp</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Phe</td><td>Asp 105</td><td>Val</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Ala</td><td>Gly 110</td><td>Thr</td><td>Thr</td>

Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 94 <211> 106 <212> PRT <213> Sztuczna sekwencja <220>

<221> źródło <223>/uwaga="Opis sztucznej sekwencji: syntetyczna polipeptydowa" 10 <400> 94

<td>Gin 1</td><td colspan="2">Ile Val</td><td>Leu</td><td>Thr 5</td><td>Gin</td><td colspan="3">Ser Pro Ala</td><td>Ile 10</td><td>Met</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Pro 15</td><td>Gly</td>

<td>Glu</td><td>Lys</td><td>Val</td><td>Thr</td><td>Met</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>Ser</td><td>Ala</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Ser</td><td>Val</td><td>Ser</td><td>Tyr</td><td>Met</td>

<td></td><td></td><td></td><td>20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td>30</td><td></td><td></td>