Method of preventing virus:cell fusion by inhibiting the function of the fusion initiation region in RNA viruses having class I membrane fusogenic envelope proteins

[0001] To zgłoszenie zastrzega korzyść z tymczasowego zgłoszenia w USA o numerze seryjnym 60/517,181, złożonego 4 listopada 2003 r.

DZIEDZINA WYNALAZKU [0002] Niniejszy wynalazek dotyczy peptydów do stosowania w zapobieganiu lub hamowaniu zakażenia wirusowego przez retrowirusa komórki (zapobiegając w ten sposób dostarczaniu genomu wirusa do cytoplazmy komórki, co jest krokiem niezbędnym do zakażenia wirusem). Niniejszy wynalazek dostarcza kompozycje oraz ich zastosowania do zapobiegania zakażeniu retrowirusem przez zakłócanie jego regionu inicjowania fuzji (ang. fusion initiation region, FIR).

WPROWADZENIE [0003] Wszystkie wirusy muszą związać się z oraz wniknąć do swoich komórek docelowych aby mogły się replikować. W przypadku otoczkowych wirusów zwierzęcych, w tym wirusów RNA zawierających błonowe białka fuzyjne klasy I (wirusy typu I), proces obejmuje (a) związanie wirionu do komórki docelowej, (b) fuzję otoczki wirusa z błoną plazmatyczną lub wewnętrzną błoną komórkową, (c) destabilizację otoczki wirusa i błony komórkowej obszaru poddanego fuzji dla utworzenia poru fuzji, (d) przeniesienie RNA wirusa przez ten por i (e) modyfikację funkcji komórkowej przez RNA wirusa.

[0004] Fuzja błony wirusa i otoczki komórki, etapy (b) i (c) powyżej, zachodzi przez oddziaływanie przezbłonowej glikoproteiny wirusa (białka fuzyjnego) z białkami powierzchniowymi i błonami komórki docelowej. Oddziaływania te powodują zmiany konformacyjne w białku fuzyjnym, które powodują umieszczenie peptydu fuzyjnego wirusa w docelowej błonie komórkowej. Po tym umieszczeniu następują dalsze zmiany konformacyjne w białku fuzyjnym, które powodują silne zbliżenie otoczki wirusa i błon komórkowych powodując fuzję dwuwarstwowych błon.

[0005] Wirus nie jest w stanie się rozprzestrzeniać i rozmnażać w komórce gospodarza, jeżeli ten proces fuzji zostanie przerwany. Zamierzone przerwanie tego procesu fuzji można osiągnąć kierując peptydy i mimetyki peptydów homologicznych do sekwencji białek fuzyjnych, przeciwciał rozpoznających białka fuzyjne i innych czynników działających przeciw białku fuzyjnemu.

TŁO WYNALAZKU

Podobieństwa strukturalne między białkami fuzyjnymi klasy I wirusów RNA.

[0006] Hemaglutynina 2 (HA2) wirusa grypy, ortomyksowirusa, to prototypowe białko fuzyjne klasy I wirusa RNA zawierające na końcu aminowym domenę hydrofobową, określane jako peptyd fuzyjny, które jest odsłaniane podczas rozszczepiania białka prekursorowego hemaglutyniny. Błonowe białka fuzyjne wirusów RNA z kilku różnych rodzin, w tym arenawirusy, koronawirusy, filowirusy, ortomyksowirusy, paramyksowirusy i retrowirusy, mają kilka wspólnych cech strukturalnych z HA2 i były określane jako białka fuzyjne wirusów klasy I. Zaobserwowano, że białko fuzyjne HIV-1, glikoproteina przezbłonowa i inne białka przezbłonowe retrowirusów, takich jak ortomyksowirusy i paramyksowirusy, posiadają hydrofobową domenę peptydu fuzyjnego odsłanianą podczas rozszczepienia prekursora (gp160) (Gallaher, 1987; Gonzalez-Scarano i wsp., 1987). Na podstawie tych podobieństw i algorytmów komputerowych prognozujących konfiguracje białek zasugerowano (Gallaher i wsp., 1989), że część zewnętrzna (ektodomena, koniec aminowy) białka przezbłonowego HIV-1 i białek przezbłonowych innych retrowirusów, mogą pasować do szkieletu budowy HA2, co określono za pomocą krystalografii rentgenowskiej (Wilson, Skehel i Wiley, 1981).

[0007] Na podstawie tych obserwacji prognozowano, że białka przezbłonowe retrowirusów zawierają, oprócz peptydu fuzyjnego, kilka cech strukturalnych wspólnych ze znaną budową HA2, w tym wydłużoną helisę końca aminowego (N-helisa, zazwyczaj nazywana „heptadowym powtórzeniem” lub „suwakiem leucynowym”), helisę końca karboksylowego (C-helisa) i motyw aromatyczny proksymalny do domeny przezbłonowej. Obecność przynajmniej czterech spośród tych pięciu domen definiuje białko otoczki wirusa jako białko fuzyjne klasy I. Ten model przezbłonowego białka retrowirusowego został następnie potwierdzony za pomocą oznaczeń strukturalnych i analiz mutacyjnych (Chan i wsp., 1997; Kowalski i wsp., 1991; Weissenhorn i wsp., 1997). Wspólne motywy strukturalne występują nie tylko w białkach fuzyjnych ortomyksowirusów i retrowirusów, ale także paramyksowirusów, filowirusów (takich jak wirus Ebola, EboV) (Gallaher, 1996) i arenawirusów (Gallaher, DiSimone i Buchmeier, 2001). Model strukturalny białka fuzyjnego EboV (GP2) według Gallahera także został potwierdzony metodami krystalografii rentgenowskiej (Malashkevich i wsp., 1999; Weissenhorn i wsp., 1998).

[0008] Figura 1 przedstawia pięć opisanych wcześniej domen białek fuzyjnych sześciu rodzin wirusów typu I. Białka fuzyjne rozpoczynają się hydrofobowym peptydem fuzyjnym, kończą peptydem zakotwiczającym i zawierają wydłużoną alfa helisę końca aminowego (N-helisa, zwykle nazywana „heptadowym powtórzeniem” lub ‘'suwakiem leucynowym”), alfa helisę końca karboksylowego (C-helisa) (Carr i Kim, 1993; Suarez i wsp., 2000; Wilson, Skehel i Wiley, 1981) i niekiedy motyw aromatyczny proksymalny do otoczki wirionu. Przedstawiono także szóstą domenę, region inicjowania fuzji (FIR), odkryty przez twórców niniejszego wynalazku.

Hamowanie fuzji wirusów typu I [0009] Wcześniejsze próby twórców niniejszego wynalazku (Garry) oraz innych badaczy mające na celu zaprojektowanie peptydów i mimetyków peptydów, przeciwciał i innych czynników hamujących fuzję w wirusach typu I koncentrowały się na peptydzie fuzyjnym, N-helisie i C-helisie białek fuzyjnych. W przypadku peptydów fuzyjnych, analogów ortomyksowirusów i paramyksowirusów (Richardson, Scheid i Choppin, 1980) oraz domen peptydu fuzyjnego HIV-1 (Gallaher i wsp., 1992; Owens i wsp., 1990; Silburn i wsp., 1998) stwierdzono blokowanie zakażenia wirusowego, przypuszczalnie wskutek tworzenia nieaktywnych heteroagregatów. Peptydy odpowiadające częściom N-helisy i C-helisy okazały się być także skuteczne w hamowaniu zakażenia wirusem, zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Na przykład, 17-aminokwasowy peptyd odpowiadający części końca karboksylowego N-helisy białka fuzyjnego HIV-1, zdefiniowany jako region CS3, blokował zakażenie wirusem HIV (Qureshi i wsp., 1990). Ponadto, na podstawie modelu strukturalnego białka fuzyjnego opracowano inne N-helisowe i C-helisowe peptydy hamujące (Wild, Greenwell i Matthews, 1993; Wild i wsp., 1992), w tym C-helisowy peptydowy lek anty-HIV-1 DP178 (T-20 lub FUZEON®). DP178 pokrywa się z C-helisą oraz aromatyczną domeną kotwicząco-proksymalną i hamuje fuzję wirion HIV-1:komórka przy bardzo niskich stężeniach (50% hamowania przy 1,7 nM) możliwych do uzyskania w warunkach in vivo po iniekcji. W badaniu klinicznym, 100 mg/dobę DP178 powodowało około 100krotną redukcję obciążenia HIV-1 w osoczu zakażonych osób (Kilby i wsp., 1998). Wynik ten dał silną motywację do poszukiwania innych peptydów hamujących HIV-1 opartych o budowę białka przezbłonowego (Pozniak, 2001; Sodroski, 1999). Wykazano także, że inhibitory peptydowe paramyksowirusów hamują replikację wirusową (Lambert i wsp., 1996; Young i wsp., 1999). Badania prowadzone przez Watanabe i współpracowników sugerują, że podobne podejście do ukierunkowania na N-helisę i C-helisę GP2 wirusa EboV może także prowadzić do uzyskania użytecznych inhibitorów (Watanabe i wsp., 2000). Wykazano także, że przeciwciała zobojętniające skierowane przeciwko częściom domen białka fuzyjnego powodują hamowanie fuzji wirion:komórka.

Obserwacje dla HIV-1 [0010] Wiele badań poświęcono hamowaniu fuzji w przypadku ludzkiego wirusa niedoboru odporności HIV-1, jednego z wirusów RNA typu I. Bolognesi i wsp. (5,464,933) i twórcy niniejszego wynalazku (Garry, USPN 5,567,805) twierdzą, że wywoływane za pośrednictwem wirusa HIV zabijanie komórki może być zahamowane przez wprowadzenie pep3 tydów wiążących części przezbłonowego białka fuzyjnego wirionu HIV-1. Region wiążący Bolognesi DP178, opisany na Figurze 7 jako FUZEON®, leży głównie na C-helisie i znajduje się na zewnątrz regionu inicjowania fuzji (FIR), co opisano w niniejszym zgłoszeniu. Bolognesi wykazuje hamowanie, ale nie opisuje sposobu hamowania. Twórcy niniejszego wynalazku (Garry) wykazali wcześniej hamowanie w regionie CS3 TM HIV-1 opisanym jako CS3 na Figurze 7, ale nie zidentyfikowali sposobu hamowania sugerując tylko, że występuje hamowanie oddziaływania CS3:receptor CS3. Nieoczekiwane odkrycie FIR przez twórców niniejszego wynalazku (zgodnie z bieżącym opisem) i fakt, że sekwencje CS3 leżą w regionie FIR wskazuje, że opisane w patencie USPN 5,567,805 wiązanie CS3:receptor CS3 to w rzeczywistości wiązanie występujące między częścią CS3 FIR i częściami błony komórkowej, do której część CS3 FIR wykazuje powinowactwo. Ponadto, chociaż Melikyan, Watanabe, Bewley i inni opisali hamowanie fuzji za pomocą wprowadzonych peptydów, nie wyjaśnili oni mechanizmów zachodzenia tego hamowania. Odpowiednio, położenie peptydu FUZEON® jest odległe od FIR, co silnie sugeruje, że w regionie FUZEON® działają inne elementy procesu fuzji. WO 88/08429 opisuje peptydy HIV do stosowania w immunoterapii. Donoszono o syntezie peptydu HIV i jego stosowaniu dla wytworzenia przeciwciał do leczenia zakażenia HIV (Viveros i wsp., 2000). Donoszono także o badaniach superhelisy HIV typu 1 gp41 (Chan i wsp., 1998).

[0011] W świetle powyż szego jest jasne, że w dziedzinie nauki istnieje potrzeba stworzenia bardziej efektywnych środków identyfikacji tych regionów wirusów, które biorą udział w procesie zakażania i kompozycji skutecznych w zapobieganiu lub hamowaniu zakażenia wirusowego. Opisany i ujawniony wynalazek zapewnia skuteczne rozwiązanie tych potrzeb.

STRESZCZENIE WYNALAZKU [0012] Według pierwszego aspektu wynalazku, zapewniono wyizolowany peptyd wybrany z grupy zawierającej:

(a) peptyd mający sekwencję aminokwasową składającą się z SEQ ID NO: 7, (b) peptyd składający się z od 8 do 40 przyległych reszt aminokwasowych o SEQ

ID NO: 7 i nie zawierający reszt 65-81 SEQ ID NO: 21 (konserwatywna sekwencja 3 białka przezbłonowego ludzkiego wirusa 1 niedoboru odporności; HIV-1 TM

CS3), (c) analog peptydu mający sekwencję aminokwasową składającą się z SEQ ID NO: 7, która zawiera jedną lub więcej substytucji konserwatywnych aminokwasów i gdzie większość reszt analogu jest identyczna do sekwencji SEQ ID NO: 7; oraz (d) analog peptydu składaj ący się z od 8 do 40 przyległych reszt aminokwasowych o SEQ ID NO: 7, która zawiera jedną lub więcej substytucji konserwatywnych aminokwasów i gdzie większość reszt analogu jest identyczna do sekwencji od 8 do 40 przyległych reszt aminokwasowych o SEQ ID NO: 7; gdzie analog nie zawiera reszt aminokwasowych 65-81 SEQ ID NO: 21, do stosowania w hamowaniu fuzji wirus:komórka w ramach leczenia zakażenia retrowirusem.

[0013] Peptyd może obejmować grupę acetylową, grupę karbobenzoksylową, grupę dansylową, grupę t-butyloksykarbonylową, grupę hydrofobową lub grupę makrocząsteczkową na końcu aminowym peptydu. Ponadto, takie peptydy mogą obejmować grupę amidową, grupę hydrofobową lub grupę makrocząsteczkową na końcu karboksylowym peptydu. Zakażenie retrowirusem może być zakażeniem wirusem HIV-1.

[0014] Według drugiego aspektu wynalazku zapewniono zastosowanie peptydu zdefiniowanego w powyższym pierwszym aspekcie do przygotowywania leku do leczenia zakażenia retrowirusowego u pacjenta. Zakażenie retrowirusem może być zakażeniem wirusem

HIV-1.

[0015] Według trzeciego aspektu według wynalazku zapewniono cząsteczkę rekombinowanego DNA, która umożliwia lub stymuluje pacjenta do wytwarzania peptydu zdefinio4 wanego w powyższym pierwszym aspekcie do leczenia zakażenia retrowirusowego u pacjenta. Aspekt ten obejmuje stosowanie cząsteczki rekombinowanego DNA, która umożliwia lub stymuluje pacjenta do wytwarzania peptydu zdefiniowanego w powyższym pierwszym aspekcie do przygotowywania leku do leczenia zakażenia retrowirusowego u pacjenta. Zakażenie retrowirusem może być zakażeniem wirusem HIV-1.

[0016] Według czwartego aspektu wynalazku zapewniono czynnik hamowania fuzji wirusowej zawierający peptyd mający sekwencję aminokwasową składającą się z od 8 do 50 reszt aminokwasów do stosowania w leczeniu zakażenia retrowirusowego, gdzie peptyd zawiera sekwencję aminokwasową peptydu według pierwszego aspektu powyżej. Czynnik hamowania fuzji wirusowej może obejmować grupę acetylową, grupę karbobenzoksylową, grupę dansylową, grupę t-butyloksykarbonylową, grupę hydrofobową lub grupę makrocząsteczkową na jego końcu aminowym. Ponadto, czynnik hamowania fuzji wirusowej może obejmować grupę amidową, grupę hydrofobową lub grupę makrocząsteczkową na jego końcu karboksylowym. Aspekt ten obejmuje stosowanie czynnika hamowania fuzji wirusowej według tego aspektu do przygotowywania leku do leczenia zakażenia retrowirusowego u pacjenta.

ILUSTRUJĄCE PRZYKŁADY WYKONANIA WYNALAZKU

Szósta domena wirusów RNA zawierających błonowe białka fuzyjne klasy I [0017] Arenawirusy, koronawirusy, filowirusy, ortomyksowirusy, paramyksowirusy i retrowirusy to sześć rodzin wirusów RNA, które obecnie zidentyfikowano jako zawierające otoczkowe białka fuzji z błoną klasy I. Białka fuzyjne tych wirusów typu I zostały wcześniej wykazane przez twórców niniejszego wynalazku (Garry) i innych jako zawierające pięć konserwatywnych motywów lub domen (Carr i Kim, 1993; Gallaher i wsp., 1989; Suarez i wsp., 2000; Wilson, Skehel i Wiley, 1981). Domeny te zawierają peptyd fuzyjny, N-helisę, C-helisę i motyw aromatyczny, z których wszystkie są ektodomenami i peptyd zakotwiczający będący endodomeną.

[0018] Za pomocą analiz obliczeniowych, modeli struktury drugorzędowej, obliczeń hydrofobowości międzyfazowej i innych technik, twórcy niniejszego wynalazku dokonali zaskakującego odkrycia wysoce konserwatywnej szóstej domeny, która występuje w białkach fuzyjnych szerokiego zakresu wirusów (ta szósta domena została tu opisana). Wirusy posiadające tę domenę zawierają w sposób nieograniczający wyżej wymienione sześć klas wirusów RNA. Aby podkreślić kluczową funkcję tej nowo odkrytej domeny będącej ektodomeną, domena jest tu określana jako region inicjowania fuzji (FIR) wirusów.

[0019] Stosowane tu pojęcie „wydłużona” alfa helisa odnosi się do alfa helisy zawierającej więcej niż cztery „zwoje helisy alfa” (zwłaszcza ponad 14 aminokwasów).

[0020] Inne przykłady wykonania zapewniają „czynniki”, które twórcy nieoczekiwanie odkryli jako skuteczne w zapobieganiu lub hamowaniu zakażenia wirusowego i/lub fuzji wirus:komórka.

[0021] Stosowane tu pojęcie „czynniki” obejmuje w sposób nieograniczający izolowane peptydy lub funkcjonalne segmenty peptydów (lub ich analogów) nowo opisanych domen regionu inicjowania fuzji (FIR), mimetyki peptydów („mimetyk peptydu” odnosi się do dowolnego związku lub substancji, która mogłaby służyć jako substytut peptydu oddziałującego z FIR i która jest dowolnym związkiem naśladującym właściwości funkcjonalnego segmentu FIR), przeciwciała swoiste wobec funkcjonalnych domen FIR (np. przeciwciała idiotypowe lub przeciwciała anty-idiotypowe) i inne związki cząsteczkowe, które zakłócają wiązanie i/lub fuzję wirus:komórka.

[0022] Stosowane tu pojęcia „funkcjonalny segment” lub „funkcjonalny fragment” regionu inicjowania fuzji (FIR) odnosi się do fragmentu zdolnego do hamowania fuzji wirus:komórka, hamowania zakaźności wirusa, zdolnej do aktywowania przeciwciała zdolnego do rozpoznawania i swoistego wiązania do FIR i/lub zakłócania zakażenia komórki za pośrednictwem FIR.

[0023] Stosowane tu pojęcia „analog peptydu” i „zmodyfikowany peptyd” są korzystnie definiowane jako peptyd FIR zmodyfikowany tak, aby zawierał grupę aminową, grupę acetylową, grupę hydrofobową (na przykład karbobenzoksylową, dansylową lub tbutyloksykarbonylową) lub grupę nośnika makrocząsteczkowego (na przykład koniugat lipidu, glikol polietylenowy, węglodowan lub białko) na końcu aminowym. Dodatkowa klasa analogów peptydu FIR zawiera grupę karboksylową, grupę amidową, grupę hydrofobową lub grupę nośnika makrocząsteczkowego na końcu karboksylowym. Inne analogi peptydów są definiowane jako peptydy FIR, gdzie przynajmniej jedno wiązanie łączące sąsiadujące reszty aminokwasowe jest wiązaniem niepeptydowym (na przykład wiązaniem imidowym, estrowym, hydrazynowym, semikarbazydowym lub azowym), peptydy z przynajmniej jedną resztą aminokwasową w konfiguracjach izomeru D lub peptydem z odwróconą kolejnością aminokwasów. Dodatkowe analogi peptydów są peptydami FIR zawierającymi przynajmniej jedną substytucję aminokwasową, gdzie pierwsza reszta aminokwasowa jest podstawiona drugą inną resztą aminokwasową (podstawienie aminokwasu może być podstawieniem konserwatywnym lub niekonserwatywnym). Stosowane tu takie analogi peptydów mogą obejmować analogiczne sekwencje aminokwasowe, gdzie analogiczne sekwencje zawierają większość identycznych lub podobnych chemicznie aminokwasów w takiej samej kolejności jak w pierwotnych sekwencjach.

[0024] Stosowane tu pojęcie „region inicjowania fuzji” (FIR) ogólnie odnosi się do regionu białka fuzji wirusowej zaangażowanego w początkowy etap lub etapy zakażenia wirusowego i/lub fuzji z komórką gospodarza.

[0025] Stosowane tu pojęcie „mimetyk peptydu” zawiera w sposób nieograniczający związki organiczne lub inne związki chemiczne, które przypominają peptyd FIR pod względem struktury lub funkcji. Przykłady mimetyków peptydów zawierają w sposób nieograniczający związki organiczne zawierające funkcjonalne grupy boczne aminokwasu lub peptydu, ale w których brak jest szkieletu węglowego/azotowego lub wiązań peptydowych. Mimetyk peptydu odnosi się także do związków naśladujących działanie tych funkcyjnych grup bocznych z innymi resztami.

[0026] Inne cząsteczki, takie jak przeciwciała idiotypowe lub antyidiotypowe lub białka wybrane metodami ekspozycji fagowej wiążące się do peptydów, analogów peptydów lub mimetyków peptydu opisane w niniejszym zgłoszeniu mogą także działać jak inhibitory zakażenia wirusowego i/lub fuzji wirus:komórka. W opisie niniejszego wynalazku rozważane są także plazmidy lub wirusy rekombinowane lub inne cząsteczki bądź związki, które umożliwiają lub stymulują u pacjenta wytwarzanie analogu związków hamujących. Dla przykładu, rekombinowane białko wytwarzane w zmodyfikowanej komórce bakteryjnej, grzybowej lub ssaczej, może zostać użyte do wytwarzania immunogennego analogu FIR lub białka fuzji wirusa. Podobnie u osoby można indukować odpowiedź antyidiotypową za pomocą zmodyfikowanego białka zawierającego sekwencję odpowiadającą miejscu wiązania przeciwciała swoistego dla FIR.

[0027] Stosowane tu pojęcie „peptyd fuzyjny” korzystnie odnosi się do sekwencji hydrofobowej znajdującej się w pobliżu lub na końcu aminowym białka fuzji wirusowej klasy I (patrz Gallaher i wsp., 1987; 1992).

[0028] Stosowany tu termin „zasadniczo oczyszczony” peptyd lub analog peptydu korzystnie odnosi się do peptydu lub analogu peptydu mającego czystość ponad około 80%. Korzystniej „zasadniczo oczyszczony” odnosi się do peptydu lub analogu peptydu mającego czystość ponad około 90% lub ponad około 95%. Najkorzystniej odnosi się to do peptydu lub analogu peptydu mającego czystość ponad 96%, 97%, 98% lub 99%. Funkcjonalnie, „zasadniczo czysty” oznacza brak zanieczyszczeń w stopniu czyniącym go odpowiednim do opisanych tu celów. Sposoby oceny czystości są dobrze znane znawcy. Odpowiednie techniki obejmują w sposób nieograniczający chromatografię gazową (GC) połączoną ze spektrofotometrią mas, analizę za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej (HPLC) oraz oznaczenia funkcjonalne w systemach hodowli komórek, czyli między innymi ocenę cytotoksyczności.

[0029] Stosowane tu pojęcie „stabilny analog” odnosi się do peptydu mającego czynny farmakologicznie czas półtrwania w układach biologicznych. Rozważane są biologiczne czasy półtrwania ponad 60 minut.

[0030] Stosowane tu pojęcie „pochodna peptydu” odnosi się do peptydu mającego podstawione aminokwasy inne niż te w sekwencji FIR białka fuzji wirusowej. Podstawienia takie nie czynią peptydu bezużytecznym dla niniejszego wynalazku.

[0031] Według różnych aspektów niniejszego przykładu wykonania wynalazku peptydy, izolowane sekwencje kwasów nukleinowych lub przeciwciała mogą być wytwarzane dowolnymi metodami znanymi w sztuce, w tym w sposób nieograniczający metodami syntezy chemicznej, rekombinacji DNA i ich kombinacjami.

[0032] Zgodnie z niniejszą definicją, niniejszy wynalazek zapewnia kompozycje i zastosowania do leczenia lub zapobiegania zakażeniom retrowirusowym. Jednym możliwym mechanizmem, dzięki któremu niniejszy wynalazek może zapobiegać i/lub hamować zakażenie jest zakłócanie wywoływanej przez FIR fuzji wirus:komórka.

SKRÓCONY OPIS FIGUR [0033] Figura 1 przedstawia domeny białek fuzyjnych jednego członka każdej z sześciu rodzin wirusów (czyli arenawirusów, koronawirusów, filowirusów, ortomyksowirusów, paramyksovirusów i retrowirusów). Okręgi na Figurze 1 przedstawiają przybliżone położenie FIR w każdym z przedstawionych wirusów.

[0034] Figury od 2 do 7 przedstawiają sekwencje aminokwasowe tych białek fuzyjnych (odpowiednio SEK ID NO 16-21) oraz schematycznie przedstawiają ich strukturę ektopową. W szczególności przedstawione pięć wcześniej opisanych domen stanowi peptyd fuzyjny, tj. N-helisa, C-helisa, motyw aromatyczny (jeżeli występuje) i peptyd zakotwiczaj ący. Zidentyfikowana jest także nowo odkryta szósta domena, region inicjowania fuzji lub FIR. Każdy FIR jest oznaczony na Figurach od 2 do 7 wielokątami.

[0035] Oznaczony kółkiem obszar za białkami fuzyjnymi na Figurach 2-7 reprezentuje podstawowe białko wiązania wirus:białko (ang. virus:cell binding protein, VCBP) wirusa. VCBP zazwyczaj oddziałuje z częścią białka fuzyjnego, która jest najbardziej oddalona od błony wirusa i dlatego jest w ten sposób umieszczona na Figurach. W odróżnieniu od wysoce konserwatywnego białka fuzyjnego, VCBP każdej rodziny wirusów jest inne. Zazwyczaj to VCBP dyktuje zakres gospodarzy wirusa i określa, które rodzaje komórek gospodarza są celem zakażenia. VCBP działa rozpoznaj ąc i wiążąc określone białka powierzchni komórki. Wiązanie VCBP do atakowanych białek komórkowych występuje przed i zazwyczaj jest warunkiem wstępnym fuzji wirus:komórka.

[0036] Figura 8: Hamowanie zakaźności koronawirusów przez peptydy regionu inicjowania fuzji. Od 50 do 100 PFU mysiego wirusa zapalenia wątroby A59 lub koronawirusa SARS Urbani poddano wstępnej inkubacji z lub bez wskazanych peptydów (~100 μΜ) w pozbawionym surowicy DMEM przez 1 h. Następnie komórki poddano działaniu inokulum traktowanego peptydem lub kontrolą podłoża (bez peptydu). Po 1 h adsorpcji inokulum usuwano, komórki dwukrotnie przemywano 1X solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i komórki umieszczano na DMEM zawieraj ącym 10% FBS oraz 0,5% agarozy. Czterdzieści osiem godzin po zakażeniu, zakażone monowarstwy utrwalano i barwiono fioletem krystalicznym dla określenia liczby stref zahamowania wzrostu.

[0037] Figura 9: Hamowanie zakaźności wirusa Lassa przez peptydy regionu inicjowania fuzji. Od 50 do 100 PFU wirusa Lassa poddano wstępnej inkubacji z lub bez wskazanych peptydów (~100 μΜ) w pozbawionym surowicy BME przez 1 h. Następnie komórki poddano działaniu inokulum traktowanego peptydem lub kontrolą podłoża (bez peptydu). Po 1 h adsorpcji inokulum usuwano, komórki dwukrotnie przemywano 1X solą fizjologiczną buforowaną fosforanem i komórki umieszczano na BME zawierającym 5% FBS, 10 mM

HEPES oraz 0,5% agarozy. Cztery dni po zakażeniu zastosowano drugą nakładkę zawierającą 5% czerwieni obojętnej i 24 h później liczono strefy zahamowania wzrostu.

[0038] Sześć rodzin wirusów RNA znanych teraz jako błonowe białka fuzyjne klasy I (wirusy typu I) i reprezentatywni członkowie każdej rodziny to:

Reprezentatywne wirusy RNA posiadające błonowe białka fuzyjne klasy I (wirusy typu I)

Rodzina Reprezentatywny wirus Przedstawiono na

Figurach

<td>Arenawirusy</td><td>Wirus Lassa</td><td>Tak</td>

<td></td><td>Wirus limfocytowego zapalenia opon mózgowordzeniowych i splotów naczyniówkowych (LCMV)</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Wirus Junin</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Wirus Machupo</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Wirus Guanarito</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Wirus Sabia</td><td>Nie</td>

<td>Koronawirusy</td><td>Wirus ciężkiego ostrego zespołu oddechowego (SARS)</td><td>Tak</td>

<td></td><td>Mysi wirus zapalenia wÄ…troby (MHV)</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Koronawirus bydlęcy</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Koronawirus psi</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Koci wirus zakaźnego zapalenia otrzewnej</td><td>Nie</td>

<td>Filowirusy</td><td>Wirus Ebola</td><td>Tak</td>

<td></td><td>Wirus Marburg</td><td>Nie</td>

<td>Ortomyksowirusy</td><td>Wirus grypy A</td><td>Tak</td>

<td></td><td>Wirus grypy B</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Wirus grypy C</td><td>Nie</td>

<td>Paramyksowirusy</td><td>Wirus odry</td><td>Tak</td>

<td></td><td>Wirus świnki</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Psi wirus nosówki</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Wirus choroby Newcastle</td><td>Nie</td>

<td>Retrowirusy</td><td>Ludzki wirus niedoboru odporności 1 (HIV-1)</td><td>Tak</td>

<td></td><td>Ludzki wirus niedoboru odporności 2 (HIV-2)</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Ludzki wirus T-limfotropowy 1 (HTLV-1)</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Ludzki wirus T-limfotropowy 2 (HTLV-2)</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Human Intracisternal A-type Particle 1 (HIAP-1)</td><td>Nie</td>

<td></td><td>Human Intracisternal A-type Particle 2 (HIAP-2)</td><td>Nie</td>

[0039] Na Figurach przedstawiono następujące wirusy:

Zilustrowane wirusy RNA mające błonowe białka fuzyjne klasy I (wirusy typu I)

Figura Rodzina Przedstawiony Przedstawione wirus białko

<td>Figura 2</td><td>Arenawirusy</td><td>Wirus Lassa</td><td>GP2</td>

<td>Figura 3</td><td>Koronawirusy</td><td>Wirus SARS</td><td>S</td>

<td>Figura 4</td><td>Filowirusy</td><td>Wirus Ebola</td><td>GP2</td>

<td>Figura 5</td><td>Ortomyksowirusy</td><td>Wirus grypy A</td><td>HA2</td>

<td>Figura 6</td><td>Paramyksowirusy</td><td>Wirus odry</td><td>F1</td>

<td>Figura 7</td><td>Retrowirusy</td><td>HIV-1</td><td>TM</td>

Listy sekwencji przedstawionych błonowych białek fuzyjnych klasy I (wirusy typu I)

GP2 LASSA (Numer dostępowy Genbank: A43492, aminokwasy 257-490)

LLGT FTWTLSDSEG NETPGGYCLT RWMLIEAELK CFGNTAVAKC

NEKHDEEFCD MLRLFDFNKQ AIRRLKTEAQ MSIQLINKAV NALINDQLIM

KNHLRDIMGI PYCNYSRYWY LNHTSTGKTS LPRCWLISNG SYLNETKFSD

DIEQQADNMI TEMLQKEYID RQGKTPLGLV DLFVFSTSFY LISIFLHLVK

IPTHRHIVGK PCPKPHRLNH MGICSCGLYK QPGVPVRWKR &lt;SEQ ID NO: 16)

SARS S (Numer dostępowy Genbank: AAQ9406, aminokwasy 864-1256)

WTF GAGAALQIPF AMQMAYRFNG IGVTQNVLYE NQKQIANQFN KAISQIQESL TTTSTALGKL QDWNQNAQA LNTLVKQLSS NFGAISSVLN DILSRLDKVE AEVQIDRLIT GRLQSLQTYV TQQLIRAAEI RASANLAATK MSECVLGQSK RVDFCGKGYH LMSFPQAAPH GWFLHVTYV PSQERNFTTA PAICHEGKAY FPREGVFVFN GTSWFITQRN FFSPQIITTD NTFVSGNCDV VIGIINNTVY DPLQPELDSF KEELDKYFKN HTSPDVDLGD ISGINASWN IQKEIDRLNE VAKNLNESLI DLQELGKYEQ YIKWPWYWL GFIAGLIAIV MVTILLCCMT SCCSCLKGAC SCGSCCKFDE DDSEPVLKGV KLHYT (SEQ ID NO:17)

GP2 EBOLA (Numer dostępowy Genbank: AAM76034, aminokwasy 502-676)

EAIVNAQPK CNPNLHYWTT QDEGAAIGLA WIPYFGPAAE GIYTEGLMHN QDGLICGLRQ LANETTQALQ LFLRATTELR TFSILNRKAI DFLLQRWGGT CHILGPDCCI EPHDWTKNIT DKIDQIIHDF VDKTLPDQGD NDNWWTGWRQ WIPAGIGVTG VIIAVIALFC ICKFVF (SEQ ID NO: 18)

HA2 GRYPY (Numer dostępowy Genbank: P03437, aminokwasy 346-566)

GŁFGA IAGFIENGWE GMIDGWYGFR HQNSEGTGQA ADLKSTQAAI DQINGKLNRV IEKTNEKFHQ IEKEFSEVEG RIQDLEKYVE DTKIDLWSYN AELLVALENQ HTIDLTDSEM NKLFEKTRRQ LRENAEEMGN GCFKIYHKCD NACIESIRNG TYDHDVYRDE ALNNRFQIKG VELKSGYKDW RCNICI (SEQ ID NO:19)

F1 ODRY (Numer dostępowy Genbank: VGNZMV, aminokwasy 116-553)

FAGW LAGAALGVAT AAQITAGIAL HQSMLNSQAI DNLRASLETT NQAIEAIRQA GQEMILAVQG VQDYINNELI PSMNQLSCDL IGQKLGLKLL RYYTEILSLF GPSLRDPISA EISIQALSYA LGGDINKVLE KLGYSGGDLL GILESRGIKA RITHVDTESY FIVLSIAYPT LSEIKGVIVH RLEGVSYNIG SQEWYTTVPK YVATQGYLIS NFDESSCTFM PEGTVCSQNA LYPMSPLLQE CLRGSTKSCA RTLVSGSFGN RFILSQGNLI ANCASILCKC YTTGTIINQD PDKILTYIAA DHCPVVEVNG VTIQVGSRRY PDAVYLHRID LGPPISLERL DVGTNLGNAI AKLEDAKELL ESSDQILRSM KGLSSTSIVY ILIAVCLGGL IGIPALICCC RGRCNKKGEQ VGMSRPGLKP DLTGTSKSYV RSL (SEQ ID NO:20)

TM HIV (Numer dostępowy Genbank: AAB50262, aminokwasy 512-710)

AVGIGALFL GFLGAAGSTM GAASMTLTVQ ARQLLSGIVQ QQNNLLRAIE AQQHLLQLTV WGIKQLQARI LAVERYLKDQ QLLGIWGCSG KLICTTAVPW NASWSNKSLE QIWNHTTWME WDREINNYTS LIHSLIEESQ NQQEKNEQEL LELDKWASLW NWFNITNWLW YIKLFIMIVG GLVGLRIVFA VLSIVNRVRQ (SEQ ID NO:21)

Sposób identyfikacji FIR [0040] Do celów referencyjnych opisano następującą technikę identyfikacji motywu konserwatywnego w białkach fuzyjnych wirusów. Konserwatywny motyw regionów FIR z różnych wirusów będzie miał podobną strukturę i funkcję. Ponadto, regiony FIR spokrewnionych wirusów mogą, ale nie muszą, mieć wysokie podobieństwo pierwszorzędowych sekwencji aminokwasowych.

[0041] Jak opisano powyżej, niniejszy wynalazek zapewnia kompozycje służące do zapobiegania lub hamowania zakażeń retrowirusowych za pomocą peptydów, przeciwciał lub wyizolowanych kwasów nukleinowych ukierunkowanych na określone FIR retrowirusów i zakłócających działanie tego FIR.

[0042] FIR białka fuzyjnego wirusa można zidentyfikować za pomocą metody obejmującej następujące etapy:

(1) Sekwencja białka fuzyjnego najpierw dopasowuje się do szkieletu przezbłonowego białka fuzyjnego wirusa HIV, który zawiera N-helisę, C-helisę i inne opisane wcześniej domeny dla identyfikacji N-helisy i C-helisy w przedmiotowym białku fuzyjnym. Ten proces dopasowania ułatwia wyszukanie pierwszorzędowej sekwencji aminokwasowej białka pod kątem dwóch lub więcej cystein mających skłonność do tworzenia przynajmniej jednej pętli związanej kowalencyjnie, która będzie obecna w większości, ale nie we wszystkich takich sekwencjach. Następnie N-helisa może być zidentyfikowana w regionie poprzedzającym tę pętlę cysteinową przez zbadanie regionu aminokwasów obdarzonych ładunkiem i innych aminokwasów mających skłonność do tworzenia helisy alfa (np. glutamina (Q), alanina (A), tryptofan (W), lizyna (K) i leucyna (L)).

(2) Następnie na N-helisie identyfikowany jest koniec aminowy FIR. Koniec ten zazwyczaj będzie leżał w obrębie końcowych 10 do 20 aminokwasów N-helisy i będzie miał rdzeń zazwyczaj zawierający trzy lub cztery aminokwasy hydrofobowe (takie jak leucyna (L) lub alanina (A)), aminokwas z ładunkiem dodatnim (taki jak lizyna (K) lub arginina (R)), aminokwas z ładunkiem ujemnym (taki jak glutaminian (E)) oraz aminokwas aromatyczny (taki jak tyrozyna (Y)).

(3) Następnie identyfikowany jest koniec karboksylowy FIR. W przypadku wszystkich rodzin z wyjątkiem koronawirusów i paramyksowirusów ten koniec jest końcem karboksylowym pierwszej sekwencji peptydowej z dodatnią hydrofobowością międzyfazową, która występuje poza N-helisą. Koniec ten zazwyczaj znajduje się poza pętlą cysteinową (jeżeli pętla cysteinowa występuje) i niekiedy pokrywa się z Chelisą lub znajduje się na C-helisie. Sekwencje o dodatniej hydrofobowości międzyfazowej mają wysoki odsetek aminokwasów aromatycznych (takich jak tryptofan (W), fenyloalanina (F) i tyrozyna (Y)) oraz małych aminokwasów hydrofobowych (takich jak glicyna (G)). Stopień hydrofobowości międzyfazowej tych sekwencji może być określony przy użyciu skali hydrofobowości międzyfazowej WimleyWhite, korzystnie przy użyciu programu komputerowego, takiego jak MPEX, który zawiera tę skalę („Hydrofobowość międzyfazowa” to miara zdolności peptydu do przechodzenia z roztworu wodnego do dwuwarstwowej błony i opiera się na wyznaczonej doświadczalnie przez Wimley-White skali hydrofobowości całych reszt (Jaysinghe, Hristova i White, 2000). Programy komputerowe wykorzystujące tę skalę mogą identyfikować sekwencję peptydową łańcucha peptydowego mającego dodatnią ocenę hydrofobowości międzyfazowej i dlatego najprawdopodobniej przyłączają się do powierzchni błon. Patrz Przykład 1 będący przykładem zastosowanie tej metody do identyfikacji FIR w wirusie Ebola.

[0043] W przypadku koronawirusów mających dłuższe helisy alfa i ogólnie większą skalę oraz paramyksowirusów, gdzie FIR jest nieciągły z powodu wstawienia sekwencji nie-FIR, koniec karboksylowy FIR jest końcem karboksylowym drugiej sekwencji peptydowej z dodatnią hydrofobowością międzyfazową, który występuje poza N-helisą. Sekwencja między N-helisą i C-helisą białka F1 paramyksowirusów jest dłuższa niż sekwencje międzyhelisowe innych wirusów z wirusowymi białkami fuzyjnymi klasy I. Białko F2 paramyksowirusów, które pełni funkcję wiązania receptora, jest odpowiednio krótsze. Po sprawdzeniu modeli komputerowych, dla znawców jest oczywiste, że białko F1 zawiera między Nhelisą i C-helisą wstawioną sekwencję. W konsekwencji, FIR paramyksowirusów zawiera dwie pętle cysteinowe i dwie sekwencje o wysokiej hydrofobowości międzyfazowej i jest nieciągły z powodu dodatkowych aminokwasów charakterystycznych wyłącznie dla paramyksowirusów i występujących między N-helisą, a pierwszą sekwencją o wysokiej hydrofobowości międzyfazowej są wykluczone z regionu FIR.

SEKWENCJE FIR [0044] Sekwencja białka fuzyjnego i FIR każdego z sześciu reprezentatywnych wirusów przedstawionych na Figurach 2 do 7 podano na określonych Figurach i poniższych listach sekwencji (SEQ ID NO:16 do SEQ ID NO:21 zapewniają odpowiednie białka fuzyjne; a

SEQ ID NO:1 do SEQ NO:7 zapewniają odpowiednie FIR). Chociaż występuje pewna niewielka zmienność sekwencji między siostrzanymi wirusami w każdej z tych sześciu rodzin, FIR dowolnego wirusa typu I można łatwo zidentyfikować wykorzystując reprezentatywną sekwencję podaną na odpowiedniej figurze.

Metody hamowania fuzji w tych wirusach [0045] Niniejszy wynalazek zapewnia kompozycje takie jak zdefiniowane w zastrzeżeniach, które hamują fuzję wirus:komórka zakłócając działanie FIR. Różne aspekty tych przykładów wykonania obejmują ukierunkowanie FIR za pomocą peptydów, przeciwciał i izolowanych sekwencji kwasów nukleinowych zgodnie z definicją dla zakłócenia fuzji wirus:komórka. Według niniejszego wynalazku peptydy i analogi peptydów są zgodne z definicją w zastrzeżeniach pod względem długości, ponieważ jest to konieczne do zapewnienia skutecznej inhibicji zakażenia retrowirusem. Stosowane tu pojęcie „długości niezbędnej do zapewnienia skutecznego hamowania'' wirusa, korzystnie odnosi się do długości wystarczającej do zapewnienia 5-krotnej lub większej redukcji zakaźności wirusowej podczas stosowania według niniejszego wynalazku. Sposoby ilościowego oznaczenia obniżenia zakaźności wirusa są dobrze znane znawcy. Na przykład, ograniczenia aktywności wirusa można określić przez oznaczenia redukcji strefy zahamowania wzrostu, w testach hamowania wiązania, obniżenia miana lub badania prowokacji na zwierzętach.

[0046] Peptydy FIR o SEQ ID NO. 7, peptydy o analogicznych sekwencjach SEQ ID NO.

lub ich fragmenty, rozważane jako część niniejszego wynalazku zgodnie z definicją w zastrzeżeniach. Następujące sekwencje przedstawiono dla porównania z SEQ ID NO. 7:

LASSA

X-LIMKNHLRDIMGIPYCNYSRYWYLNHTSTGKTLPRCWLI-Z (SEQ ID NO:1).

SARS

X-LIRAAEIRASANLAATKMSECVLGQSKRVDFCGKGYHLMSFPQAAPH GVVFLHVTYVPSQERNFTTAPAICHEGKAYFPREGVFVFNGTSWFITQRNFFS-Z (SEQ ID

N0:2)

EBOLA

X-LRTFSILNRKAIDFLLQRWGGTCHILGPDCCI-Z (SEQ ID NO:3)

GRYPA

X-IQDLEKYVEDTKIDLWSYNAELLVALENQHTIDLTDSEMNKLF-Z (SEQ ID NO:4)

ODRA

X-LGLKLLRYYTEILSLFG-Z (SEQ ID NO:5)

X-WYTTVPKYVATQGYLISNFDESSCTFMPEGTVCSQNALYPMSPLLQE CLRGSTKSCARTLVSGSFGNRFILSQGNLIANCASILCKCYTTGTII-Z (SEQ ID NO:6) („----” wskazuje, że FIR odry jest nieciągły).

HIV

X-LQARILAVERYLKDQQLLGIWGCSGKLICTTAVPWNASWSNKSLE QIWNHTTWMEWD-Z (SEQ ID N0:7)

W każdej z powyższych sekwencji „X” oraz „Z” oznaczaj ą odpowiednio koniec aminowy lub karboksylowy peptydu lub dodatkowej reszty, zgodnie z opisem poniżej.

[0047] Peptydy o SEQ ID NO:7 zapewnione przez niniejszy wynalazek mają sekwencję regionu FIR. Region FIR pochodzi z wirusa należącego do rodziny retrowirusów, która obejmuje ludzki wirus niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), ludzki wirus niedoboru odporności typu 2 (HIV-2), ludzki wirus T-limfotropowy 1 (HTLV-1), ludzki wirus Tlimfotropowy 2 (HTLV-2), Human Intracisternal A-type Particle 1 (HIAP-1) oraz Human Intracisternal A-type Particle 2 (HIAP-2).

[0048] Inne aspekty tego przykładu wykonania wynalazku zapewniają sekwencje SEQ ID NO.7 zawieraj ące funkcjonalny fragment sekwencji FIR lub sekwencji analogicznych do niej z wirusa należącego do rodziny retrowirusów (z wyjątkiem peptydu TM CS3 HIV-1 opisanego wcześniej przez twórców niniejszego wynalazku (Garry) i przedstawionego na Figurze 7). Peptyd zdefiniowany w zastrzeżeniach może obejmować funkcjonalny fragment (z wyjątkiem fragmentu TM CS3 HIV-1) lub sekwencję analogiczną do funkcjonalnego fragmentu ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 1 (HIV-1), ludzkiego wirusa niedoboru odporności typu 2 (HIV-2), ludzkiego wirusa T-limfotropowego 1 (HTLV-1), ludzkiego wirusa T-limfotropowego 2 (HTLV-2), Human Intracisternal A-type Particle 1 (HIAP-1) oraz Human Intracisternal A-type Particle 2 (HIAP-2).

[0049] Pochodne peptydy mogą obejmować zmienione sekwencje, w których funkcjonalnie równoważne reszty aminokwasowe są podstawione resztami w sekwencji powoduj ącymi zmianę cichą. Na przykład, jedna lub więcej reszt aminokwasowych w sekwencji może być podstawiona innym aminokwasem o podobnej polarności, która działa jak równoważnik funkcjonalny powoduj ący cichą zmianę (np. podstawienie leucyny izoleucyną). Podstawienia aminokwasu w sekwencji mogą być wybrane spośród innych członków klasy, do której należy aminokwas. Na przykład, aminokwasy niepolarne (hydrofobowe) obejmuj ą alaninę, leucynę, izoleucynę, walinę, prolinę, fenyloalaninę, tryptofan i metioninę. Polarne neutralne aminokwasy obejmuj ą glicynę, serynę, treoninę, cysteinę, tyrozynę, asparaginę i glutaminę. Aminokwasy z ładunkiem dodatnim (zasadowe) obejmuj ą argininę, lizynę i histydynę. Aminokwasy z ładunkiem ujemnym (kwaśne) obejmuj ą kwas asparaginowy i kwas glutaminowy. Wyłącznie jako kolejny przykład, a nie ograniczenie, takie peptydy mogą także obejmować D-aminokwasy i/lub mogą obejmować niewydajne białko nośnikowe lub brak białka nośnikowego.

[0050] Peptydy FIR mogą zawierać peptydy, w których „X” obejmuje grupę aminową, acetylową, hydrofobową lub nośnika makrocząsteczkowgo i/lub „Z” obejmuje grupę karboksylową, amidową, hydrofobową lub nośnika makrocząsteczkowego. Reszta „X” może być także wybrana z grupy obejmującej: resztę hydrofobową, karbobenzoksylową, dansylową lub t-butyloksykarbonylową. Reszta „Z” może być wybrana z grupy obejmującej: resztę hydrofobową lub t-butyloksykarbonylową.

[0051] Reszta „X” może obejmować grupę nośnika makrocząsteczkowego. Taka grupa nośnika makrocząsteczkowego może być wybrana z grupy obejmuj ącej w sposób nieograniczaj ący: koniugat lipidowy, resztę glikolu polietylenowego lub resztę węglowodanu. Podobnie, „Z” może także obejmować grupę nośnika makrocząsteczkowego; gdzie wymieniony nośnik makrocząsteczkowy jest wybrany z grupy obejmuj ącej w sposób nieograniczaj ący: koniugat lipidowy, resztę glikolu polietylenowego lub resztę węglowodanu.

[0052] Jedno lub więcej wiązań cząsteczkowych wiążących przylegaj ące reszty aminokwasowe może być wiązaniem niepeptydowym. Takie wiązania niepeptydowe obejmuj ą w sposób nieograniczający: wiązania imidowe, estrowe, hydrazynowe, semikarbazoidowe i azowe.

[0053] Peptyd może obejmować jedną lub więcej reszt aminokwasowych będących Dizomerem aminokwasu.

[0054] Peptydy mogą obejmować jedną lub więcej substytucji aminokwasów, gdzie pierwsza reszta aminokwasowa jest podstawiona drugą, inną resztą aminokwasową, w podanej wyżej sekwencji (lub jej funkcjonalnym fragmencie). W różnych aspektach tego przykładu wykonania, substytucja aminokwasu jest substytucją konserwatywną. W innych aspektach tego przykładu wykonania substytucja aminokwasu jest substytucją niekonserwatywną. Jeszcze inne aspekty tego przykładu wykonania wynalazku zapewniają peptydy takie jak opisane wyżej z wyjątkiem tego, że jedna lub więcej reszt aminokwasowych została usunięta.

[0055] W różnych korzystnych aspektach niniejszych przykładów wykonania, peptydy FIR według wynalazku zawierają przynajmniej 8 przyległych reszt FIR. Stosowane tu pojęcie „peptyd(y) inhibicyjny(e) FIR” korzystnie dotyczy peptydu lub peptydów mających sekwencję FIR (lub jej segment funkcjonalny), gdzie takie peptydy lub segmenty funkcjonalne FIR mają jeden lub więcej aminokwasów podstawionych przez funkcjonalne równoważniki lub aminokwasy podobne chemicznie (patrz niżej). Dotyczy to także pochodnych tych peptydów, w tym w sposób nieograniczający pochodnych benzylowanych, pochodnych glikozylowanych i peptydów zawierających enancjomery naturalnie występujących aminokwasów. W korzystnym aspekcie tego przykładu wykonania peptyd ma sekwencję SEQ ID NO:7.

[0056] W jeszcze innych aspektach tego przykładu wykonania wynalazku, peptydy FIR mogą być wiązane z cząsteczką nośnika, taką jak białko, obejmującą w sposób nieograniczający albuminę surowicy ludzkiej (ang. human serum albumin, HSA).

[0057] Ponadto, niniejszy wynalazek rozważa cząsteczki zawierające dowolną kombinację reszt X i Z i/lub innych opisanych wyżej modyfikacji peptydów.

[0058] Peptydy według niniejszego wynalazku mogą być wytwarzane z naturalnie występujących lub rekombinowanych białek wirusowych. Mogą być one także wytwarzane przy użyciu standardowych technik rekombinacji DNA (np. ekspresja peptydu przez mikroorganizm, który zawiera rekombinowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego kodującą żądany peptyd ulegający ekspresji pod kontrolą odpowiedniego promotora transkrypcji i uzyskiwanie żądanego peptydu z wymienionego mikroorganizmu). W korzystnym aspekcie wynalazku, dowolne peptydy według wynalazku mogą być przygotowane za pomocą dowolnej znanej w dziedzinie nauki metodologii syntezy chemicznej, obejmując w sposób nieograniczający syntezę w fazie stałej Merrifielda (Clark-Lewis i wsp., 1986, Science

231:134-139).

[0059] Przykłady wykonania niniejszego wynalazku zapewniają także przeciwciała przydatne w leczeniu lub zapobieganiu zakażeniu komórki przez wirusa. Przeciwciała obejmują ich aktywne segmenty, oznaczające części przeciwciał zdolne do swoistego rozpoznawania regionu FIR lub jego funkcjonalnego segmentu. Przeciwciała swoiście rozpoznają

FIR lub ich fragment antygenowy, aby zapobiegać lub ograniczać zakażenie komórki przez wirusa. Przeciwciała według tych przykładów wykonania wynalazku mogą być monoklonalne lub poliklonalne.

[0060] Ogólne metody wytwarzania przeciwciał są dobrze znane znawcy. Techniki wytwarzania przeciwciał według niniejszego wynalazku obejmują etapy (i) zapewnienia antygenu zawierającego FIR lub jego fragmentu antygenowego (taki antygen może być niezmodyfikowanym peptydem, analogiem peptydu lub pochodną peptydu); (ii) narażenie układu odpornościowego zwierzęcia na antygen, aby indukować odpowiedź odpornościową; (iii) pobranie przeciwciał od zwierzęcia i identyfikacja tych przeciwciał, które swoiście rozpoznają FIR (lub jego segment funkcjonalny) i/lub są zdolne do hamowania lub redukcji za13 każenia wirus:komórka w powoduj ącej odpowiedź dawce w oznaczeniach mierzących zakaźność wirusa.

[0061] Według różnych aspektów niniejszego wynalazku, peptydy i/lub przeciwciała według niniejszego wynalazku użyteczne w leczeniu lub zapobieganiu zakażeń wirusowych komórek mogą celować w aminokwasy otaczaj ące i znajduj ące się w pętli cysteinowej FIR, dystalnej części N-helisy FIR, dowolnego z regionów hydrofobowości międzyfazowej, innych obszarów FIR lub ich dowolnej kombinacji. Te przeciwciała, peptydy lub analogi peptydów (zbiorczo związki) mogą być stosowane pojedynczo. Alternatywnie mogą być stosowane w kombinacjach dwóch lub więcej, aby zapobiegać lub hamować zakażenie komórki przez wirusa. Zapewniane przez niniejszy wynalazek sposoby zapobiegania lub hamowania zakażenia wirusowego komórki przez zakłócanie działania FIR obejmuj ą także stosowanie przeciwciał zoboj ętniaj ących (wytwarzanych egzogennie lub endogennie) skierowanych przeciwko całości lub częściom FIR. Celem takiego stosowania jest zakłócanie działania FIR, a tym samym hamowanie zakażenia wirusowego komórki i/lub fuzji błon wirusa:komórki.

[0062] Inne przykłady wykonania niniejszego wynalazku zapewniaj ą kompozycje, w tym kompozycje farmaceutyczne, obejmuj ące dowolne i wszystkie peptydy (w tym analogi lub przeciwciała). Obejmuje to w sposób nieograniczaj ący kompozycje zawieraj ące dowolną cząsteczkę obejmującą, zasadniczo zawierającą lub zawierającą FIR o SEQ ID NO:7 lub segment funkcjonalny FIR. Obejmuje to także w sposób nieograniczaj ący kompozycje obejmuj ące dowolny związek, który swoiście rozpoznaje, wiąże lub zakłóca działanie FIR wirusa. Stosowane tu pojęcie „zakłócanie działania FIR” oznacza, że związek oddziałuje z FIR lub z białkiem komórkowym służącym jako receptor rozpoznaj ący FIR, aby zapobiegać lub ograniczać zakażenie komórki przez wirusa. Dodatkowo, rozważane są kompozycje mogące obejmować którąkolwiek z opisanych cząsteczek lub mieszaniny dwóch lub więcej cząsteczek.

[0063] Kolejne przykłady wykonania niniejszego wynalazku zapewniaj ą zastosowania związków według wynalazku do leczenia lub zapobiegania zakażeniu komórki przez retrowirusa. Różne aspekty tego przykładu wykonania wynalazku zapewniaj ą skuteczną ilość dowolnej opisanej tu kompozycji farmaceutycznej do stosowania dla podawania pacjentowi z podejrzeniem narażenia na retrowirusa (lub potencjalnie narażonemu na retrowirusa). W różnych aspektach wynalazku kompozycja farmaceutyczna obejmuje przeciwciało, które swoiście rozpoznaje i wiąże się z peptydem FIR o o SEQ ID NO. 7 (lub segmentem funkcjonalnym FIR) lub fragmentem takiego przeciwciała, które swoiście rozpoznaje i wiąże się z FIR lub segmentem funkcjonalnym FIR.

[0064] Jeszcze inne aspekty tego przykładu wykonania wynalazku zgodnie z definicj ą w zastrzeżeniach zapewnia skuteczną ilość kompozycji obejmuj ącej przynajmniej jedną cząsteczkę rekombinowanego DNA, gdzie DNA koduje FIR o SEQ ID NO. 7 (lub jego segment funkcjonalny), aby zapobiegać lub ograniczać zakażenie wirusem. W korzystnym aspekcie tego przykładu wykonania rekombinowana cząsteczka DNA i/lub kompozycja farmaceutyczna obejmuje także elementy niezbędne, aby umożliwić ekspresj ę kodowanej przez DNA cząsteczki białka w komórce człowieka. Jako nieograniczaj ący przykład, w określonych aspektach tego przykładu wykonania wynalazku rekombinowana cząsteczka DNA jest częścią rekombinowanego plazmidu lub rekombinowanego wirusa.

PRZYKŁADY

Przykład 1: Identyfikacja FIR w wirusie Ebola [0065] Sposób identyfikacji FIR wirusowych białek fuzyjnych klasy I można przedstawić za pomocą dwóch przykładów. Pierwszy przykład to identyfikacja FIR w minimalnej glikoproteinie 2 (GP2) białka fuzyjnego klasy I wirusa Ebola, filowirusa. Granice N-helisy i C-helisy GP2 wirusa Ebola oznaczono technikami krystalografii rentgenowskiej (Malashkevich i wsp., 1999). Końcowe aminokwasy N-helisy zawierają sekwencję ILNRKAIDF (SEQ ID NO:8), która mieści uzgodniony rdzeń zawierający trzy lub cztery amino14 kwasy hydrofobowe, aminokwas z ładunkiem dodatnim, aminokwas z ładunkiem ujemnym lub aminokwas aromatyczny. Między tymi dwiema helisami znajdują się dwie cysteiny w sekwencji CHILGPDC (SEQ ID NO:9). Końce FIR GP2 wirusa Ebola definiuje sekwencja FLLQRWGGTCHILGPDCCI (SEQ ID NO:10) mająca punktację hydrofobowości międzyfazowej według Wimley-White wynoszącą 2,59, co określono za pomocą programu MPEX (Jaysinghe i wsp., 2002). Dlatego FIR GP2 wirusa Ebola rozciąga się od aminokwasów 579 do 610.

Przykład 2: Identyfikacja FIR w wirusie odry [0066] Drugi przykład to złożone białko fuzyjne klasy I, białko F1 wirusa odry (paramyksowirusa). N- i C-helisy F1 wirusa odry można zidentyfikować badając pierwszorzędową sekwencję aminokwasową mającą skłonność do tworzenia helis. Dopasowanie sekwencji pierwszorzędowej F1 wirusa odry z sekwencją aminokwasową pierwszorzędową białka F1 innego paramyksowirusa (F1 wirusa choroby Newscastle) może także pomóc w identyfikacji granic helisy. Budowę białka F1 wirusa choroby Newcastle oznaczono technikami krystalografii rentgenowskiej (Chen i wsp., 2001). Dlatego granice N- i C- helis można prognozować odpowiednio na aminokwasy 131-217 i 455-491. W odróżnieniu od GP2 wirusa Ebola i większości innych wirusowych białek fuzyjnych klasy I, sekwencja pierwszorzędowa między N- i C-helisami w wirusie odry jest dłuższa niż 100 aminokwasów. Region FIR F1 wirusa odry zawiera insercję, która po sprawdzeniu modeli komputerowych, jest oczywista dla znawców i dlatego struktura FIR jest tworzona przez aranżacje drugorzędowe, które zbliżają do siebie dwie części sekwencji pierwszorzędowej. Wstawiona sekwencja tworzy pętlę zewnętrzną względem FIR. Końcowe aminokwasy N-helisy zawierają sekwencję LKLLRYYTE (SEQ ID NO:11), która mieści uzgodniony rdzeń zawierający trzy lub cztery aminokwasy hydrofobowe, aminokwas z ładunkiem dodatnim, aminokwas z ładunkiem ujemnym i aminokwas aromatyczny. W F1 wirusa odry między N- i C-helisami występuje osiem reszt cysteiny. Na podstawie dopasowania z F1 wirusa choroby Newcastle można stwierdzić, że pierwsze dwie cysteiny i drugie dwie cysteiny tworzą pętle połączone mostkiem dwusiarczkowym. Pierwsza para cystein w sekwencji, CTFMPEGTVC (SEQ ID NO:12), stanowi część FIR ponieważ jest ograniczona sekwencją WYTTVPKYVATQGYLISNF (SEQ ID NO:13) mającą punktację hydrofobowości międzyfazowej według Wimley-White wynoszącą 3,36, co określono za pomocą programu MPEX. Druga para cystein w sekwencji, CLRGSTKSC (SEQ ID NO:14), stanowi także część FIR, ponieważ przylega do sekwencji TLVSGSFGNRFILSQGNLIANCASILCKCYTTGTII (SEQ ID NO:15) mającej punktację hydrofobowości międzyfazowej według Wimley-White wynoszącą 2,54, co określono za pomocą programu MPEX. Dlatego FIR F1wirusa odry rozciąga się od aminokwasów 205 do 407, gdzie aminokwasy od 221 do 314 oznaczają insercję, która nie bierze udziału w funkcji FIR.

Przykład 3: Identyfikacja fuzyjnych peptydów inhibicyjnych koronawirusa.

Tło wynalazku [0067] Zespół ostrej ciężkiej niewydolności oddechowej (SARS) to nowo rozpoznana choroba, która rozprzestrzenia się z południowych Chin pod koniec 2002 r./początku 2003 r. do kilku krajów w Azji, Europie i Ameryce Północnej (Guan i wsp., 2004). SARS zazwyczaj rozpoczyna się od gorączki powyżej 38°C. Początkowe objawy mogą także obejmować ból głowy, złe samopoczucie i łagodne objawy oddechowe. W ciągu dwóch dni do tygodnia, u pacjentów z SARS może rozwinąć się suchy kaszel i trudności z oddychaniem. U pacjentów w bardziej zaawansowanych stadiach SARS może rozwinąć się zapalenie płuc lub zespół zaburzeń oddechowych. Podczas początkowej epidemii było 8098 przypadków na całym świecie z całkowitą śmiertelnością 9,6%. Wykazano, że przyczyną nowej choroby jest wcześniej nierozpoznany koronawirus (CoV) (Poutanen i wsp., 2003; Peiris i wsp., 2003; Drosten i wsp., 2003; Rota i wsp., 2003; Mara i wsp., 2003). Interwencje publicznej opieki zdrowotnej, takie jak nadzór, ograniczenia podróżowania i kwarantanny pozwoliły ograniczyć pierwotne rozprzestrzenianie się CoV SARS w 2003 r. i później umożliwiły powstrzymanie rozprzestrzeniania się SARS po wystąpieniu nowych przypadków w 2004

r. Nie jest jednak wiadomo, czy te drakońskie środki hamujące mogą być utrzymane przy każdym wystąpieniu CoV SARS u ludzi. Ponadto, oczywista jest możliwość wykorzystania tego nowego i niekiedy śmiertelnego CoV jako zagrożenia bioterrorystycznego.

[0068] Koronawirusy to duże wirusy RNA z nicią o dodatniej polarności zazwyczaj o szerokim zakresie gospodarzy. Podobnie jak inne wirusy otoczkowe, CoV wnika do komórki docelowej dzięki fuzji membran wirusowych i komórkowych, procesowi wywoływanemu za pomocą glikoproteinowej wypustki (spike protein, S) wirusa. Scharakteryzowane do tej pory białka S CoV wydają się zawierać dwie podjednostki związane niekowalencyjnie (S1 i S2). Wykorzystując analizę obliczeniową, Garry i Gallaher (2003) jako pierwsi zaproponowali, że część białka S SARS-CoV odpowiadająca podjednostce S2 pasuje do prototypowego modelu wirusowego białka fuzyjnego klasy I opartego na obecności dwóch prognozowanych regionów alfa helisy w N- i C-końcowych regionach S2 (N-helisa, C-helisa) i bogatego w aminokwasy aromatyczne regionu tuż przed domeną kotwicy przezbłonowej.

MateriaÅ‚y i metody [0069] Komórki L2 lub Vero E6 utrzymywano jako monowarstwy w peÅ‚nej pożywce Eagle zmodyfikowanej przez Dulbecco (ang. Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM) zawierajÄ…cej 0,15% HCO3^- uzupeÅ‚nionego 10% bydlÄ™cej surowicy pÅ‚odowej (ang. fetal bovine serum, FBS), penicylinÄ… G (100 U/ml), streptomycynÄ… (100 mg/ml) i 2mM LglutaminÄ… przy 37°C w 5% inkubatorze CO2. W komórkach L2 przeprowadzono propagacjÄ™ mysiego wirusa zapalenia wÄ…troby (ang. Mouse hepatitis virus, MHV) szczep A59 lub CoV SARS szczep Urbani lub HK. Do oznaczeÅ„ stref zahamowania wzrostu komórki L2 lub Vero E6 wysiano z gÄ™stoÅ›ciÄ… 1x10⁶ komórek w każdym doÅ‚ku na pÅ‚ytce 6-doÅ‚kowej. PięćdziesiÄ…t do 100 jednostek tworzÄ…cych strefy zahamowania wzrostu (ang. plaque forming units, PFU) wirusów MHV lub CoV SARS poddano wstÄ™pnej inkubacji z lub bez okoÅ‚o 100 μg/ml peptydu w pozbawionej surowicy DMEM przez 1 h. NastÄ™pnie komórki zakażono inokulum traktowanym peptydem lub inokulum kontrolnym podÅ‚oża. Po 1 h adsorpcji inokulum usuwano, komórki dwukrotnie przemywano 1X solÄ… fizjologicznÄ… buforowanÄ… fosforanem i komórki umieszczano na 10% FBS/DMEM zawierajÄ…cym 0,5% agarozy SEAPLAQUE® (Cambrex Bio Science Rockland, Inc., Rockland, ME). Monowarstwy utrwalono za pomocÄ… 3,7% formaliny i barwiono za pomocÄ… 1X fioletu krystalicznego 2 dni po zakażeniu, a liczbÄ™ stref zahamowania wzrostu okreÅ›lono za pomocÄ… mikroskopii Å›wietlnej.

Wyniki i dyskusja [0070] Peptydy syntetyczne odpowiadajÄ…ce domenom FIR biaÅ‚ka S wirusów MHV lub CoV SARS badano pod kÄ…tem ich zdolnoÅ›ci do hamowania zakażenia przez te koronawirusy. Zdolność do hamowania tworzenia stref zahamowania wzrostu w monowarstwach komórek jest najbardziej surowym testem in vitro badajÄ…cym potencjalny lek hamujÄ…cy zakażenie. Dwa peptydy (GNHILSLVQNAPYGLYFIHFSW, SEQ ID NO:22 i GYFVQDDGEWKFTGSSYYY, SEQ ID NO:23) z FIR MHV mogÄ… hamować tworzenie stref zahamowania wzrostu przez MHV, chociaż pierwszy peptyd FIR MHV jest skuteczniejszy (patrz Fig. 8A). Dwa peptydy z FIR CoV SARS (GYHLMSFPQAAPHGWFLHVTY, SEQ ID NO:24 i GVFVFNGTSWFITQRNFFS, SEQ ID NO:25) hamowaÅ‚y tworzenia stref zahamowania wzrostu przez ten koronawirus (patrz Fig. 8B). WystÄ™powaÅ‚o także znaczne zmniejszenie (~50%) Å›redniej Å›rednicy pozostaÅ‚ych stref zahamowania wzrostu. Wyniki te sugerujÄ…, że peptyd ten powoduje hamowanie zarówno wnikajÄ…cego jak i rozprzestrzenionego MHV. Podobne wyniki z tymi peptydami hamujÄ…cymi uzyskano w niezależnych doÅ›wiadczeniach z 50% hamowaniem stref zahamowania wzrostu obserwowanym przy stężeniach &lt;5 μΜ. It is unlikely that these results will be explained by the non-specific cytotoxic effects of the peptides. With the exception of the growth inhibition zones, the cells in the monolayers were intact and viable. The small number of growth inhibition zones was similar in size to the growth inhibition control zones. Peptides from other regions also inhibited infection with these viruses, but to a lesser extent than the most active FIR peptides (Fig. 8). For example, peptides from the fusion peptide and carboxy-terminal helix (C-helix) region of MHV and CoV SARS S protein proteins provided some inhibition (S MHV fusion peptide = MFPPWSAAAGVPFSLSVQY, SEQ ID NO: 26; C-helix S protein MHV virus = QDAIKKLNESEMYL , SEQ ID NO: 27; CoV SARS protein fusion peptide SARS = MYKTPTLKYFGGFNFSQIL, SEQ ID NO: 28; CV helix of CoV SARS protein S = AACEVAKNLNESLIDLQELGKYEQYIKW, SEQ ID NO: 29. Inhibitory activities in the μΜ range have recently been reported for C-helix peptides of coronaviruses by Bosch et al. (2003) and others (Bosch et al., 2004; Lui et al., 2004; Yuan et al., 2004; Zhu and et al., 2004). However, inhibitory FIR coronavirus peptides have not been reported. Nevertheless, in the light of the present invention, the cited sources provide support for the great advantages of the disclosed and claimed inventions. These sources are in accordance with the inventors' assurance that the methods of the present invention can be advantageously used to identify synthetic peptides that inhibit the fusion / infectivity of members of the Coronaviridae family.

Example 4: Identification of arenavirus fusion peptides.

Background of the invention [0071] Lassa fever is often a fatal hemorrhagic disease named after a city in the valley of the Nigerian River Yedseram, where the first described cases occurred in 1969 (Buckley and Casals, 1970). Parts of Guinea, Sierra Leone, Nigeria and Liberia are endemic to the etiological factor - Lassa virus (LasV). The LasV virus has a huge impact on public health in endemic areas. The Centers for Disease Control and Prevention (CDC) estimated that between 100,000 and 300,000 cases of Lass virus infection and 5,000 deaths occur annually in West Africa. In some parts of Sierra Leone, 10-15% of all patients admitted to hospitals have Lassa fever. The mortality rate for Lassa fever is usually between 15 and 20%, although it can be as high as 45% in the event of an epidemic. Women's mortality in the last month of pregnancy is always high, ~ 90%, and LasV infection causes high fetal mortality in all stages of pregnancy. Lass's mortality appears to be higher in non-African people, which is of concern because Lassa virus is one of the most-exported hemorrhagic fevers. Due to the high mortality and the ability to easily spread through people-to-people contacts, the LasV virus is classified as Biosafety Level 4 and NIAID Biodefense category A.

[0072] LasV is a member of the Arenaviridae family. The arenaviral genome consists of two sections of single-stranded, ambisense RNA. Viewed by transmission electron microscopy, spherical enveloped virions (diameter: 110-130 nm) show granular particles that are ribosomes obtained from host cells (Murphy and Whitfield, 1975). Hence, the Latin family name "arena" means "sandy". In addition to the LasV virus, other arenaviruses that cause human disease include the Junin virus (Argentine hemorrhagic fever), Machupo (Bolivian hemorrhagic fever), Guanarito (Venezuelan hemorrhagic fever) and Sabiά (Brazilian hemorrhagic fever). Arenaviruses are zoonotic; each virus is associated with a specific rodent species (Bowen, Peters and Nichol, 1997). The LasV reservoir is a "multimammate rat" of the genus Mastomys (Monath et al., 1974). The widespread spread of Mastomys in Africa makes extinction of this rodent impractical and ecologically undesirable.

[0073] The signs and symptoms of Lassa fever, which occurs 1-3 weeks after exposure to the virus, vary widely, but includes fever and sternal, back or abdominal pain, sore throat, cough, vomiting, diarrhea, conjunctival injection and facial swelling.

The LasV virus causes infection of endothelial cells resulting in increased capillary permeability, reduction of effective blood volume, shock and systemic multiorgan failure. Less than a third of cases have overt bleeding, usually through the mucosa (gums, etc.), but is a poor prognosis. Neurological problems including hearing loss, tremor and encephalitis have also been described. Surviving patients begin to lose fever 2-3 weeks after onset of the disease. Hearing loss is the most common complication of Lassa fever. Transient or permanent unilateral or bilateral hearing loss occurs in ~ 30% of patients suffering from Lassa fever during convalescence and is not associated with the severity of the acute illness. The antiviral drug ribavarin is effective in the treatment of Lassa fever, but only when administered early (up to six days) during illness (Johnson et al., 1987; McCormick et al., 1986). It is not known whether ribavarin is effective against other arenaviruses such as Junin, Machupo, Guanarito or Sabiά viruses. No LasV vaccine is currently available.

Materials and methods [0074] Vero cells were maintained as monolayers in Basal Medium Eagle (BME) medium containing 10 mM HEPES and 5% FBS. Lass virus (Josiah strain) was propagated in Vero cells. For determination of the zones of inhibition of growth, Vero cells were plated at a density of 1x10⁶ cells in each well on a 6-well plate. Fifty to 100 PFU of LasV virus were preincubated with or without peptide in serum-free BME for 1 h. The cells were then infected with the peptide-treated inoculum or vehicle control inoculum. After 1 h adsorption, the inoculum was removed, the cells were washed twice with 1X phosphate buffered saline and the cells were placed with 2 ml 0.5% agarose in BME containing 10 mM HEPES and 5% FBS and incubated for 4 days. A second overlay containing 5% inert red was used and growth inhibition zones were counted 24 h later.

Results and discussion [0075] Synthetic peptides corresponding to the FIR domains of LasV glycoprotein 2 (GP2) were tested for their ability to inhibit infection by these arenaviruses. The peptide (NYSKYWYLNHTTTGR, SEQ ID NO: 30) analogous to the sequence NYSRYWYLNHTSTGK of SEQ ID NO: 1 (FIR LASSA) can inhibit the formation of LasV inhibition zones (Fig. 9). A peptide analogous to another region of GP2, a fusion peptide (GTFTWTLSDSEGKDTPGGY, SEQ ID NO: 31) also inhibited LasV infection, but to a lesser extent (Fig. 9). Inhibitory arenavirus peptides have not been reported. Collectively, these results suggest that our methods identify synthetic peptides that inhibit the fusion / infectivity of members of the Arenaviridae family. These results, combined with our results of FIR coronavirus inhibitory peptides, provide evidence that FIR region peptides can act as viral inhibitors.

LITERATURE [0076]

Bolognesi et al. US Pat. Well. 5,464, 933

Bosch et al. (2004). Natl. Acad. Sci. USA 101: 8455-8460.

Bosch et al. (2003) J Virol 77: 8801-8811.

Bowen, et al. (1997). Mol Phylogenet Evol 8 (3), 301-16.

Buckley, SM and Casals, J. (1970). Am J Trop Med Hyg 19 (4), 680-91.

Carr, CM and Kim, PS (1993). Cell 73 (4), 823-32.

Chan et al. (1997). Cell 89 (2), 263-73.

Chan et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 95, 15613-15617 Chen et al. (2001). Structure 9 (3), 255-266.

Clark-Lewis et al. (1986) Science. 231: 134-9.

Drosten, et al (2003). New England J Med 348, 1967-76.

Gallaher et al (1992). Adv. Membrane Fluidity 6,113-142.

Gallaher, WR (1987). Cell 50 (3), 327-8.

Gallaher, WR (1996). Cell 85, 1-2.

Gallaher et al. (1989). AIDS Res Human Retroviruses 5 (4), 431-40.

Gallaher et al. (2001). BMC Microbiol 1 (1), 1.

Gallaher, WR and Garry, RF (2003). &lt;www. Virology. net / Articles / sars / s2model. html&gt; May 1, 2003.

Gelder, et al (1995). J. Virol 69, 7497-7506

Gonzalez-Scarano et al. (1987). AIDS Res Hum Retroviruses. 3 (3), 245-52.

Guan et al. (2004). Lancet 363, 99-104.

Guan et al. (2003). Science 302, 276-278.

Henderson, Coy and Garry, US Pat. Well. 5,567,805.

Jaysinghe et al. (2000). Membrane Protein Explorer.<a href="http://www.blanco.biomol.cui.edu.mplex">www.blanco.biomol.cui.edu.mplex</a>.

Johnson et al. (1987). J Infect Dis 155 (3), 456-64.

Kilby et al. (1998). Nat Med 4 (11), 1302-7.

Kowalski et al. (1991). J. Virol. 65, 281-291.

Ksiazek et al. (2003). N Engl J Med 348, 1953-66.

Lambert et al. (1996). Proc Natl Acad Sci USA 93 (5), 2186-91.

Liu et al. (2004). Lancet 363: 938-947.

Malashkevich, et al. (1999). Proc Natl Acad Sci USA 96 (6), 2662-7.

Marra, et al. (2003). Science 300, 1399-1404.

McCormick, et al. (1986), N Engl J Med 314 (1), 20-6.

Monath et al. (1974). Science 185 (147), 263-5.

Murphy, FA and Whitfield, SG (1975). Bull World Health Organ 52 (4-6), 409-19. Owens et al. (1990). AIDS Res Hum Retroviruses 6 (11), 1289-96.

Peiris, et al. (2003). Lancet 361, 1319-25.

Pozniak, A. (2001). J HIV Ther 6 (4), 91-4.

Poutanen et al., (2003). New England J Med 348, 1995-2005.

Qureshi, et al. (1990). AIDS 4, 553-558.

Richardson, et al. (1980). Virology 105 (1), 205-22.

Rota, et al. (2003). Science, 300, 1394-1399.

Silburn, et al. (1998). AIDS Res Hum Retroviruses 14 (5), 385-92.

Sodroski, et al. (1999). Cell 99 (3), 243-6.

Suarez, et al. (2000). J Virol 74 (17), 8038-47.

Viveros et al., Virology, 270 (1) 135-145 Watanabe, et al. (2000). J Virol 74 (21), 10194-201.

Weissenhorn, W. (1998). Mol Cell 2 (5), 605-16.

Weissenhorn, et al. (1997). Nature 387 (6631), 426-30.

Wild et al. (1993). AIDS Research &amp; Human Retroviruses 9 (11), 1051-3.

Wild, et al. (1992). Proc Natl Acad Sci USA 89 (21), 1053741.

Wilson et al. (1981). Nature 289 (5796), 366-73.

Young et al. (1999). J Virol 73 (7), 5945-56.

Yuan et al. (2004). Biochem. Biophys. Res. Commun. 319: 746-752.

Zhu et al. (2004). Biochem. Biophys. Res. Commun. 319: 283-288.

SEQUENCE LIST [0077] &lt;110&gt; Garry, Jr., Robert F. Wilson, Russell B.

&lt;120&gt; HOW TO PREVENT THE FUSION OF VIRUS: A CELL BY INHIBITION OF THE ACTION OF THE FUSION INITIATION IN RNA VIRUSES HAVING RUBBER PROTEIN PROTEINS OF THE FUZOGENIC CLASS I &lt;130&gt; 12920.0013.00PC00 &lt;150&gt; &lt;170&gt; Version 3.3 PatentIn &lt;210&gt; 1 &lt;211&gt; 39 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; synthetic peptide &lt;400&gt; 1

<td>Leu</td><td>how much</td><td>Underworld</td><td>lys</td><td>own</td><td>His</td><td>Leu</td><td>Arg</td><td>Asp</td><td>How much</td><td>Underworld</td><td>Gly</td><td>How much Pro</td><td>Tyr</td><td>Cys</td>

<td> 1</td><td></td><td></td><td></td><td> 5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 10</td><td></td><td></td><td></td><td> 15</td><td></td>

<td>own</td><td>Tyr</td><td>Cheese</td><td>Arg</td><td>Tyr</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>own</td><td>His</td><td>Thr</td><td>Cheese</td><td>Thr gly</td><td>lys</td><td>Thr</td>

<td></td><td></td><td></td><td> 20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 25</td><td></td><td></td><td></td><td> 30</td><td></td><td></td>

Leu Pro Arg Cys Trp Leu Ile 35 &lt;210&gt; 2 &lt;211&gt; 100 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; synthetic peptide &lt;400&gt; 2

<td colspan="16">Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Cheese Ala Asn Leu Ala Ala Thr</td>

<td colspan="3"> 1</td><td colspan="3"> 5</td><td colspan="5"> 10</td><td colspan="5"> 15</td>

<td>lys</td><td>Underworld</td><td>Cheese</td><td>Glu twenty</td><td>Cys</td><td>val</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>Gin 25</td><td>Cheese</td><td>lys</td><td>Arg</td><td>val</td><td>Asp thirty</td><td>phe</td><td>Cys</td>

<td>Gly</td><td>lys</td><td>Gly 35</td><td>Tyr</td><td>His</td><td>Leu</td><td>Underworld</td><td>Cheese 40</td><td>phe</td><td>Pro</td><td>Gin</td><td>ala</td><td>ala 45</td><td>Pro</td><td>His</td><td>Gly</td>

<td>val</td><td>val 50</td><td>phe</td><td>Leu</td><td>His</td><td>val</td><td>Thr 55</td><td>Tyr</td><td>val</td><td>Pro</td><td>Cheese</td><td>Gin 60</td><td>Glu</td><td>Arg</td><td>own</td><td>phe</td>

<td>Thr 65</td><td>Thr</td><td>ala</td><td>Pro</td><td>ala</td><td>How much 70</td><td>Cys</td><td>His</td><td>Glu</td><td>Gly</td><td>lys 75</td><td>ala</td><td>Tyr</td><td>phe</td><td>Pro</td><td>Arg 80</td>

Glu Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gin Arg 85 90 95

Asn Phe Phe Ser 100 &lt;210&gt; 3 &lt;211&gt; 32 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; synthetic peptide &lt;400&gt; 3

<td>Leu Arg</td><td>Thr</td><td>Phe Cheese</td><td>How much</td><td>Leu</td><td>own</td><td>Arg</td><td>lys</td><td>ala</td><td>How much</td><td>Asp</td><td>phe</td><td>Leu</td><td>Leu</td>

<td> 1</td><td></td><td> 5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 15</td><td></td>

<td>Gin Arg</td><td>Trp</td><td>Gly gly</td><td>Thr</td><td>Cys</td><td>His</td><td>How much</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>Pro</td><td>Asp</td><td>Cys</td><td>Cys</td><td>How much</td>

<td></td><td></td><td> 20</td><td></td><td></td><td></td><td> 25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 30</td><td></td><td></td>

&lt;210&gt; 4 &lt;211&gt; 43 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 4

<td>How much</td><td>Gin</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>lys</td><td>Tyr</td><td>val</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Thr</td><td>lys</td><td>How much</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Trp</td>

<td> 1</td><td></td><td></td><td></td><td> 5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 15</td><td></td>

<td>Cheese</td><td>Tyr</td><td>own</td><td>ala</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>val</td><td>ala</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>own</td><td>Gin</td><td>His</td><td>Thr</td><td>How much</td>

<td></td><td></td><td></td><td> 20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 30</td><td></td><td></td>

<td>Asp</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Asp</td><td>Cheese</td><td>Glu</td><td>Underworld</td><td>own</td><td>lys</td><td>Leu</td><td>phe</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td></td><td></td><td> 35-</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

&lt;210&gt; 5 &lt;211&gt; 17 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; synthetic peptide &lt;400&gt; 5

Leu Gly Leu Lys Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu Ile Leu Ser Leu Phe 15 10 15

Gly &lt;210&gt; 6 &lt;211&gt; 94 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 6

<td>Trp</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>val</td><td>Pro</td><td>lys</td><td>Tyr</td><td>val</td><td>ala</td><td>Thr</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>How much</td>

<td> 1</td><td></td><td></td><td></td><td> 5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 15</td><td></td>

<td>Cheese</td><td>own</td><td>phe</td><td>Asp</td><td>Glu</td><td>Cheese</td><td>Cheese</td><td>Cys</td><td>Thr</td><td>phe</td><td>Underworld</td><td>Pro</td><td>Glu</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>val</td>

25 30

Cys Ser Gin Asn Ala Leu Tyr Pro Met Ser Pro Leu Leu Gin Glu Cys 35 40 45

<td>Leu</td><td>Arg</td><td>Gly</td><td>Cheese</td><td>Thr</td><td>lys</td><td>Cheese</td><td>Cys</td><td>ala</td><td>Arg</td><td>Thr</td><td>Leu</td><td>val</td><td>Cheese</td><td>Gly</td><td>Cheese</td>

<td></td><td> 50</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 55</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 60</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>phe</td><td>Gly</td><td>own</td><td>Arg</td><td>phe</td><td>how much</td><td>Leu</td><td>Cheese</td><td>Gin</td><td>Gly</td><td>own</td><td>Leu</td><td>How much</td><td>ala</td><td>own</td><td>Cys</td>

<td> 65</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 70</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 75</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 80</td>

<td>ala</td><td>Cheese</td><td>How much</td><td>Leu</td><td>1 cys</td><td>lys</td><td>Cys</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>How much</td><td>How much</td><td></td><td></td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td> 85</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 90</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

&lt;210&gt; 7 &lt;211&gt; 57 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 7

<td>Leu</td><td>Gin</td><td>ala</td><td>Arg</td><td>How much</td><td>Leu</td><td>ala</td><td>val</td><td>Glu</td><td>Arg</td><td>Tyr</td><td>Leu</td><td>lys</td><td>Asp</td><td>Gin</td><td>Gin</td>

<td> 1</td><td></td><td></td><td></td><td> 5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 15</td><td></td>

<td>Leu</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>How much</td><td>Trp</td><td>Gly</td><td>Cys</td><td>Cheese</td><td>Gly</td><td>lys</td><td>Leu</td><td>How much</td><td>Cys</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>ala</td>

<td></td><td></td><td></td><td> 20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 30</td><td></td><td></td>

<td>val</td><td>Pro</td><td>Trp</td><td>own</td><td>ala</td><td>Cheese</td><td>Trp</td><td>Cheese</td><td>own</td><td>lys</td><td>Cheese</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Gin</td><td>How much</td><td>Trp</td>

<td></td><td></td><td> 35</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 40</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 45</td><td></td><td></td><td></td>

Asn His Thr Thr Trp Met Glu Trp Asp 50 55 &lt;210&gt; 8 &lt;211&gt; 9 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 8

Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe 1 5 &lt;210&gt; 9 &lt;211&gt; 8 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 9

Cys His Ile Leu Gly Pro Asp Cys 1 5 &lt;210&gt; 10 &lt;211&gt; 19 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 10

Phe Leu Leu Gin Arg Trp Gly Gly Thr Cys His Ile Leu Gly Pro Asp 15 10 15

Cys Cys Ile &lt;210&gt; 11 &lt;211&gt; 9 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; synthetic peptide &lt;400&gt; 11

Leu Lys Leu Leu Arg Tyr Tyr Thr Glu

5 &lt;210&gt; 12 &lt;211&gt; 10 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; synthetic peptide &lt;400&gt; 12

Cys Thr Phe Met Pro Glu Gly Thr Val Cys

10 &lt;210&gt; 13 &lt;211&gt; 19 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; synthetic peptide &lt;400&gt; 13

Trp Tyr Thr Thr Val Pro Lys Tyr Val Ala Thr Gin. Gly Tyr Leu Ile 15 10 15

Asn Phe cheese &lt;210&gt; 14 &lt;211&gt; 9 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; synthetic peptide &lt;400&gt; 14

Cys Leu Arg Gly Ser Thr Lys Ser Cys

5 &lt;210&gt; 15 &lt;211&gt; 36 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 15

<td>Thr</td><td>Leu</td><td>val</td><td>Cheese</td><td>Gly</td><td>Cheese</td><td>phe</td><td>Gly Asn.</td><td>Arg</td><td>phe</td><td>How much</td><td>Leu</td><td>Cheese</td><td>Gin</td><td>Gly</td>

<td> 1</td><td></td><td></td><td></td><td> 5</td><td></td><td></td><td></td><td> 10</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 15</td><td></td>

<td>own</td><td>Leu</td><td>How much</td><td>ala</td><td>own</td><td>Cys</td><td>ala</td><td>Ile cheese</td><td>Leu</td><td>Cys</td><td>lys</td><td>Cys</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Thr</td>

<td></td><td></td><td></td><td> 20</td><td></td><td></td><td></td><td> 25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 30</td><td></td><td></td>

Gly Thr Ile Ile 35 &lt;210&gt; 16 &lt;211&gt; 234 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; WIRUS LASSA &lt;400&gt; 16

<td colspan="4" rowspan="2">Leu Leu Gly Thr 1</td><td rowspan="2">phe 5</td><td rowspan="2">Thr</td><td colspan="2" rowspan="2">Trp Thr</td><td colspan="8">Leu Cheese Asp Cheese Glu Gly Asn Glu</td>

<td colspan="3"> 10</td><td colspan="5"> 15</td>

<td>Thr</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Cys</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Arg</td><td>Trp</td><td>Underworld</td><td>Leu</td><td>How much</td><td>Glu</td><td>ala</td><td>Glu</td>

<td></td><td></td><td></td><td> 20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 25</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 30</td><td></td><td></td>

<td>Leu</td><td>lys</td><td>Cys</td><td>phe</td><td>Gly</td><td>own</td><td>Thr</td><td>ala</td><td>val</td><td>ala</td><td>lys</td><td>Cys</td><td>own</td><td>Glu</td><td>lys</td><td>His</td>

40 45

Asp Glu Glu Phe Cys Asp Met Leu Arg Leu Phe Asp Phe Asn Lys Gin 50 55 60

Ala Ile Arg Arg Leu Lys Thr Glu Ala Gin Met Cheese Ile Gin Leu Ile

70 75 80

Asn Lys Ala Val Asn Ala Leu Ile Asn Asp Gin Leu Ile Met Lys Asn

90 95

His Leu Arg Asp Ile Met Gly Ile Pro Tyr Cys Asn Tyr Ser Arg Tyr 100 105 110

Trp Tyr Leu Asn His Thr Ser Thr Gly Lys Thr Ser Leu Pro Arg Cys 115 120 125 '

Trp Leu Ile Ser Asn Gly Cheese Tyr Leu Asn Glu Thr Lys Phe Cheese Asp 130 135 140

Asp Ile Glu Gin Gin Ala Asp Asn Met Ile Thr Glu Met Leu Gin Lys

145 150 155 ‘ 160

Glu Tyr Ile Asp Arg Gin Gly Lys Thr Pro Leu Gly Leu Val Asp Leu

165 170 175

Phe Val Phe Ser Thr Ser Phe Tyr Leu Ile Ser Ile Phe Leu His Leu 180 185 190

<td>val</td><td>lys</td><td>How much 195</td><td>Pro</td><td>Thr</td><td>His</td><td>Arg</td><td>His 200</td><td colspan="2">Ile Val</td><td colspan="2">Gly Lys</td><td>Pro 205</td><td>Cys</td><td colspan="2">Pro Lys</td>

<td>Pro</td><td>His</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>own</td><td>His</td><td>Underworld</td><td>Gly</td><td>How much</td><td>Cys</td><td>Cheese</td><td>Cys</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Tyr</td><td>lys</td>

<td></td><td> 210</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 215</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 220</td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td>Gin</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>val</td><td>Pro</td><td>val</td><td>Arg</td><td>Trp</td><td>lys</td><td>Arg</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

225 230 &lt;210&gt; 17 &lt;211&gt; 388 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; WIRUS SARS &lt;400&gt; 17

Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala 1 5 ·

Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile 20

Glu Asn Gin Lys Gin Ile Ala Asn 35 40

Ile Gin Glu Ser Leu Thr Thr Thr 50 55

Asp Val Val Asn Gin Asn Ala Gin 65 70

Leu Cheese Cheese Asn Phe Gly Ala Ile 85

Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala 100 cheese

Thr Gly Arg Leu Gin Cheese Leu Gin 115 120

Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser 130 135

Glu Cys Val Leu Gly Gin Cheese 145 150

Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro 165

Leu Gin Ile Pro Phe Ala Met Gin 10 15

Gly Val Thr Gin Asn Val Leu Tyr 25 30

Gin Phe Asn Lys Ala Ile Ser Gin 45

Cheese Thr Ala Leu Gly Lys Leu Gin 60

Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gin 75 80 *

Cheese Cheese Val Leu Asn Asp Ile Leu 90 95

Glu Val Gin Ile Asp Arg Leu Ile 105 110

Thr Tyr Val Thr Gin Gin Leu Ile 125

Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met 140

Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys 155 160

Gin Ala Ala Pro His Gly Val Val 170 175

<td>phe</td><td>Leu</td><td>His</td><td>val 180</td><td>Thr</td><td>Tyr</td><td>val</td><td>Pro</td><td>Cheese 185</td><td>Gin</td><td>Glu</td><td>Arg</td><td>own</td><td>phe 190</td><td>Thr</td><td>Thr</td>

<td>ala</td><td>Pro</td><td>ala 195</td><td>How much</td><td>Cys</td><td>His</td><td>Glu</td><td>Gly 200</td><td>lys</td><td>ala</td><td>Tyr</td><td>phe</td><td>Pro 205</td><td>Arg</td><td>Glu</td><td>Gly</td>

<td>val</td><td>phe 210</td><td>val</td><td>phe</td><td>own</td><td>Gly</td><td>Thr 215</td><td>Cheese</td><td>Trp</td><td>phe</td><td>How much</td><td>Thr 220</td><td>Gin</td><td>Arg</td><td>own</td><td>phe</td>

<td>phe 225</td><td>Cheese</td><td>Pro</td><td>Gin</td><td>How much</td><td>How much 230</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>Asp</td><td>own</td><td>Thr 235</td><td>phe</td><td>val</td><td>Cheese</td><td>Gly</td><td>own 240</td>

<td>Cys</td><td>Asp</td><td>val</td><td>val</td><td>How much 245</td><td>Gly</td><td>How much</td><td>How much</td><td>own</td><td>own 250</td><td>Thr</td><td>val</td><td>Tyr</td><td>Asp</td><td>Pro 255</td><td>Leu</td>

<td>Gin</td><td>Pro</td><td>Glu</td><td>Leu 260</td><td>Asp</td><td>Cheese</td><td>phe</td><td>lys</td><td>Glu 265</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>Asp</td><td>lys</td><td>Tyr 270</td><td>phe</td><td>lys</td>

<td>own</td><td>His</td><td>Thr 275</td><td>Cheese</td><td>Pro</td><td>Asp</td><td>val</td><td>Asp 280</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>Asp</td><td>How much</td><td>Cheese 285</td><td>Gly</td><td>How much</td><td>own</td>

<td>ala</td><td>Cheese 290</td><td>val</td><td>val</td><td>own</td><td>How much</td><td>Gin 295</td><td>lys</td><td>Glu</td><td>How much</td><td>Asp</td><td>Arg 300</td><td>Leu</td><td>own</td><td>Glu</td><td>val</td>

<td>ala 305</td><td>lys</td><td>own</td><td>Leu</td><td>own</td><td>Glu 310</td><td>Cheese</td><td>Leu</td><td>How much</td><td>Asp</td><td>Leu 315</td><td>Gin</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>lys 320</td>

<td>Tyr</td><td>Glu</td><td>Gin</td><td>Tyr</td><td>How much 325</td><td>lys</td><td>Trp</td><td>Pro</td><td>Trp</td><td>Tyr 330</td><td>val</td><td>Trp</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>phe 335</td><td>How much</td>

<td>ala</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>How much 340</td><td>ala</td><td>How much</td><td>val</td><td>Underworld</td><td>val 345</td><td>Thr</td><td>How much 1</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Cys 350</td><td>Cys</td><td>Underworld</td>

<td>Thr</td><td>Cheese</td><td>Cys 355</td><td>Cys</td><td>Cheese</td><td>Cys</td><td>Leu</td><td>lys 360</td><td>Gly</td><td>ala</td><td>Cys</td><td>Cheese</td><td>Cys 365</td><td>Gly</td><td>Cheese</td><td>Cys</td>

<td>Cys</td><td>lys 370</td><td>phe</td><td>Asp</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>Asp 375</td><td>Cheese</td><td>Glu</td><td>Pro</td><td>val</td><td>Leu 380</td><td>lys</td><td>Gly</td><td>val</td><td>lys</td>

Leu His Tyr Thr 385 &lt;210&gt; 18 &lt;211&gt; 175 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; WIRUS EBOLA &lt;400&gt; 18

Glu Ala Ile Val Asn Ala Gin Pro Lys Cys Asn Pro Asn Leu His Tyr 15 10 15

Trp Thr Thr Gin Asp Glu Gly Ala Ala Ile Gly Leu Ala Trp Ile Pro 20 25 30

Tyr Phe Gly Pro Ala Ala Glu Gly Ile Tyr Thr Glu Gly Leu Met His 35 40 45

Asn Gin Asp Gly Leu Ile Cys Gly Leu Arg Gin Leu Ala Asn Glu Thr 50 55 60.

Thr Gin Ala Leu Gin Leu Phe Leu Arg Ala Thr Thr Glu Leu Arg Thr 65 70 75 80

Phe Cheese Ile Leu Asn Arg Lys Ala Ile Asp Phe Leu Leu Gin Arg Trp 85 90 95

Gly Gly Thr Cys His Ile Leu Gly Pro Asp Cys Cys Ile Glu Pro His 100 105 110

Asp Trp Thr Lys Asn Ile Thr Asp Lys Ile Asp Gin Ile Ile His Asp 115 120 125

<td rowspan="2">phe</td><td rowspan="2">val 130</td><td colspan="2" rowspan="2">Asp Lys</td><td rowspan="2">Thr</td><td colspan="11">Leu Pro Asp Gin Gly Asp Asn Asp Asn Trp Trp</td>

<td colspan="2"> 135</td><td colspan="9"> 140</td>

<td>Thr</td><td>Gly</td><td>Trp</td><td>Arg</td><td>Gin</td><td>Trp</td><td>How much</td><td>Pro</td><td>ala</td><td>Gly</td><td>How much</td><td>Gly</td><td>val</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>val</td>

<td> 145</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 150</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 155</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 160</td>

<td>How much</td><td>How much</td><td>ala</td><td>val</td><td>How much</td><td>ala</td><td>Leu</td><td>phe</td><td>Cys</td><td>How much</td><td>Cys</td><td>lys</td><td>phe</td><td>val</td><td>phe</td><td></td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td> 165</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 170</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 175</td><td></td>

<td colspan="2"> &lt;210&gt; 19</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

&lt;211&gt; 191 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; FLU VIRUS

<td colspan="10"> &lt;400&gt; 19</td>

<td>Gly 1 '</td><td>Leu Phe</td><td>Gly</td><td>ala 5</td><td>How much Ala Gly</td><td>phe</td><td>How much 10</td><td>Glu Asn Gly Trp</td><td>Glu 15</td><td>Gly</td>

<td>Underworld</td><td>How much asp</td><td>Gly twenty</td><td>Trp</td><td>Tyr Gly Phe</td><td>Arg 25</td><td>His</td><td>Gin Asn Cheese Glu 30</td><td>Gly</td><td>Thr</td>

<td>Gly</td><td>Gin Ala 35</td><td>ala</td><td>Asp</td><td>Leu Lys Cheese 40</td><td>Thr</td><td>Gin</td><td>Ala Ala Ile Asp 45</td><td>Gin</td><td>How much</td>

<td>own</td><td>Gly Lys 50</td><td>Leu</td><td>own</td><td>Arg Val Ile 55</td><td>Glu</td><td>lys</td><td>Thr Asn Glu Lys 60</td><td>phe</td><td>His</td>

<td>Gin 65</td><td>How much glu</td><td>lys</td><td>Glu</td><td>Phe Cheese Glu 70</td><td>val</td><td>Glu</td><td>Gly Arg Ile Gin 75</td><td>Asp</td><td>Leu 80</td>

<td>Glu</td><td>Lys Tyr</td><td>val</td><td>Glu 85</td><td>Asp Thr Lys</td><td>How much</td><td>Asp 90</td><td>Leu Trp Cheese Tyr</td><td>own 95</td><td>ala</td>

<td>Glu</td><td>Leu Leu</td><td>val 100</td><td>ala</td><td>Leu Glu Asn</td><td>Gin 105</td><td>His</td><td>Thr Ile Asp Leu 110</td><td>Thr</td><td>Asp</td>

<td>Cheese</td><td>Glu Met 115</td><td>own</td><td>lys</td><td>Leu Phe Glu 120</td><td>lys</td><td>Thr</td><td>Arg Arg Gin Leu 125</td><td>Arg</td><td>Glu</td>

<td>own</td><td>Ala Glu 130</td><td>Glu</td><td>Underworld</td><td>Gly Asn Gly 135</td><td>Cys</td><td>phe</td><td>Lys Ile Tyr His 140</td><td>lys</td><td>Cys</td>

<td>Asp 145</td><td>Own. ala</td><td>Cys</td><td>How much</td><td>Glu Cheese Ile 150</td><td>Arg</td><td>own</td><td>Gly Thr Tyr Asp 155</td><td>His</td><td>Asp 160</td>

<td>val</td><td>Tyr Arg</td><td>Asp</td><td>Glu 165</td><td>Ala Leu Asn</td><td>own</td><td>Arg 170</td><td>Phe Gin Ile Lys</td><td>Gly 175</td><td>val</td>

<td>Glu</td><td>Leu Lys</td><td>Cheese 180</td><td>Gly</td><td>Tyr Lys Asp</td><td>Trp 185</td><td>Arg</td><td>Cys Asn Ile Cys 190</td><td>How much</td><td></td>

&lt;210&gt; 20 &lt;211&gt; 438 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; ODRA VIRUS

<td colspan="12"> &lt;400&gt; 20</td>

<td>phe 1</td><td>Ala Gly</td><td>val</td><td>Val Leu 5</td><td>Ala Gly</td><td>ala</td><td>ala 10</td><td>Leu</td><td>Gly Val</td><td>ala</td><td>Thr 15</td><td>ala</td>

<td>ala</td><td>Gin Ile</td><td>Thr twenty</td><td>Ala Gly</td><td>How much ala</td><td>Leu 25</td><td>His</td><td>Gin</td><td>Cheese Met</td><td>Leu thirty</td><td>own</td><td>Cheese</td>

<td>Gin</td><td>Ala Ile 35</td><td>Asp</td><td>Asn Leu</td><td>Arg Ala 40</td><td>Cheese</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Thr Thr 45</td><td>own</td><td>Gin</td><td>ala</td>

<td>How much</td><td>Glu Ala 50</td><td>How much</td><td>Arg Gin</td><td>Ala Gly 55</td><td>Gin</td><td>Glu</td><td>Underworld</td><td>Ile Leu 60</td><td>ala</td><td>val</td><td>Gin</td>

<td>Gly ' 65</td><td>Val Gin</td><td>Asp</td><td>Tyr Ile 70</td><td>Asn Asn</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>How much 75</td><td>Pro Ser</td><td>Underworld</td><td>own</td><td>Gin 80</td>

<td>Leu</td><td>Cys cheese</td><td>Asp</td><td>Leu Ile 85</td><td>Gly Gin</td><td>lys</td><td>Leu 90</td><td>Gly</td><td>Leu Lys</td><td>Leu</td><td>Leu 95</td><td>Arg</td>

<td>Tyr</td><td>Tyr Thr</td><td>Glu 100</td><td>How much leu</td><td>Leu cheese</td><td>phe 105</td><td>Gly</td><td>Pro</td><td>Leu cheese</td><td>Arg 110</td><td>Asp</td><td>Pro</td>

<td>How much</td><td>Ala 115 cheese</td><td>Glu</td><td>How much cheese</td><td>Ile Gin 120</td><td>ala</td><td>Leu</td><td>Cheese</td><td>Tire Ala 125</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>Gly</td>

<td>Asp</td><td>How much Asn 130</td><td>lys</td><td>Val Leu</td><td>Glu Lys 135</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>Tyr</td><td>Gly 140 cheese</td><td>Gly</td><td>Asp</td><td>Leu</td>

<td>Leu 145</td><td>Gly Ile</td><td>Leu</td><td>Glu Cheese 150</td><td>Arg Gly</td><td>How much</td><td>lys</td><td>ala 155</td><td>Arg Ile</td><td>Thr</td><td>His</td><td>val 160</td>

<td>Asp</td><td>Thr glu</td><td>Cheese</td><td>Tyr Phe 165</td><td>Ile Val</td><td>Leu</td><td>Cheese 170</td><td>How much</td><td>Ala Tyr</td><td>Pro</td><td>Thr 175</td><td>Leu</td>

<td>Cheese</td><td>Glu Ile</td><td>lys 180</td><td>Gly Val</td><td>Ile Val</td><td>His 185</td><td>Arg</td><td>Leu</td><td>Glu Gly</td><td>val 190</td><td>Cheese</td><td>Tyr</td>

<td>own</td><td>Ile Gly 195</td><td>Cheese</td><td>Gin Glu</td><td>Trp Tyr 200</td><td>Thr</td><td>Thr</td><td>val</td><td>Pro Lyś 205</td><td>Tyr</td><td>val</td><td>ala</td>

<td>Thr</td><td>Gin Gly 210</td><td>Tyr</td><td>Leu Ile</td><td>Asn 215 cheese</td><td>phe</td><td>Asp</td><td>Glu</td><td>Cheese Cheese 220</td><td>Cys</td><td>Thr</td><td>phe</td>

<td>Underworld 225</td><td>Pro Glu</td><td>Gly</td><td>Thr Val 230</td><td>Cys Cheese</td><td>Gin</td><td>own</td><td>ala 235</td><td>Leu Tyr</td><td>Pro</td><td>Underworld</td><td>Cheese 240</td>

<td>Pro</td><td>Leu Leu</td><td>Gin</td><td>Glu Cys 245</td><td>Leu Arg</td><td>Gly</td><td>Cheese 250</td><td>Thr</td><td>Lys Ser</td><td>Cys</td><td>ala 255</td><td>Arg</td>

<td>Thr</td><td>Leu Val</td><td>Cheese 260</td><td>Gly Cheese</td><td>Phe Gly</td><td>own 265</td><td>Arg</td><td>phe</td><td>How much leu</td><td>Cheese 270</td><td>Gin</td><td>Gly</td>

<td>own</td><td>Leu Ile 275</td><td>ala</td><td>Asn Cys</td><td>Ala Ser 280</td><td>How much</td><td>Leu</td><td>Cys</td><td>Lys Cys 285</td><td>Tyr</td><td>Thr</td><td>Thr</td>

<td>Gly</td><td>Thr Ile 290</td><td>How much</td><td>Asn Gin</td><td>Asp Pro 295</td><td>Asp</td><td>lys</td><td>How much</td><td>Leu Thr 300</td><td>Tyr</td><td>How much</td><td>ala</td>

<td>ala 305</td><td>Asp</td><td>His</td><td>Cys</td><td>Pro</td><td>val 310</td><td>val</td><td>Glu</td><td>val</td><td>own</td><td>Gly 315</td><td>val</td><td>Thr</td><td>How much</td><td>Gin</td><td>val 320</td>

<td>Gly</td><td>Cheese</td><td>Arg</td><td>Arg</td><td>Tyr 325</td><td>Pro</td><td>Asp</td><td>ala</td><td>val</td><td>Tyr 330</td><td>Leu</td><td>His</td><td>Arg</td><td>How much</td><td>Asp 335</td><td>Leu</td>

<td>Gly</td><td>Pro</td><td>Pro</td><td>How much 340</td><td>Cheese</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Arg</td><td>Leu 345</td><td>Asp</td><td>val</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>own 350</td><td>Leu</td><td>Gly</td>

<td>own</td><td>ala</td><td>How much</td><td>ala</td><td>lys</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Asp</td><td>ala</td><td>lys</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>Leu</td><td>Glu</td><td>Cheese</td><td>Cheese</td>

355 360 365

Asp Gin Ile Leu Arg Ser Met Lys Gly Leu Ser Cheese Thr Ser Ile Val 370 375 380

<td>Tyr</td><td>How much</td><td>Leu</td><td>How much</td><td>ala</td><td>val</td><td>Cys</td><td>Leu</td><td>gly</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>How much</td><td>Gly</td><td>How much</td><td>Pro</td><td>ala</td>

<td> 385</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 390</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 395</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 400</td>

<td>Leu</td><td>How much</td><td>Cys</td><td>Cys</td><td>Cys</td><td>Arg</td><td>Gly</td><td>Arg</td><td>Cys</td><td>own</td><td>lys</td><td>lys</td><td>Gly</td><td>Glu</td><td>Gin</td><td>val</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td> 405</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 410</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 415</td><td></td>

<td>Gly</td><td>Underworld</td><td>Cheese</td><td>Arg</td><td>Pro</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>lys</td><td>Pro</td><td>Asp</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>Gly</td><td>Thr</td><td>Cheese</td><td>lys</td>

420 425 430

Ser Tyr Val Arg Ser Leu 435 &lt;210&gt; 21 &lt;211&gt; 199 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; HIV

<td colspan="5"> &lt;400&gt; 21</td><td rowspan="2">phe</td><td rowspan="2">Leu</td><td rowspan="2">Gly 10</td><td rowspan="2">phe</td><td rowspan="2">Leu</td><td rowspan="2">Gly Ala</td><td rowspan="2">ala 15</td><td rowspan="2">Gly</td>

<td>ala 1</td><td>val</td><td>Gly</td><td>How much</td><td>Gly Ala Leu 5</td>

<td>Cheese</td><td>Thr</td><td>Underworld</td><td>Gly twenty</td><td>Ala Ala Cheese</td><td>Underworld</td><td>Thr 25</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>val</td><td>Gin Ala 30</td><td>Arg</td><td>Gin</td>

<td>Leu</td><td>Leu</td><td>Cheese 35</td><td>Gly</td><td>Ile Val Gin</td><td>Gin 40</td><td>Gin</td><td>own</td><td>own</td><td>Leu</td><td>Leu Arg 45</td><td>ala</td><td>How much</td>

<td>Glu</td><td>ala 50</td><td>Gin</td><td>Gin</td><td>His Leu Leu 55</td><td>Gin</td><td>Leu</td><td>Thr</td><td>val</td><td>Trp 60</td><td>Gly Ile</td><td>lys</td><td>Gin</td>

<td>Leu 65</td><td>Gin</td><td>ala</td><td>Arg</td><td>Ile Leu Ala 70</td><td>val</td><td>Glu</td><td>Arg</td><td>Tyr 75</td><td>Leu</td><td>Lys Asp</td><td>Gin</td><td>Gin 80</td>

<td>Leu</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>How much</td><td>Trp Gly Cys 85</td><td>Cheese</td><td>Gly</td><td>lys 90</td><td>Leu</td><td>How much</td><td>Cys Thr</td><td>Thr 95</td><td>ala</td>

<td>val</td><td>Pro</td><td>Trp</td><td>own 100</td><td>Ala Ser Trp</td><td>Cheese</td><td>own 105</td><td>lys</td><td>Cheese</td><td>Leu</td><td>Glu Gin 110</td><td>How much</td><td>Trp</td>

<td>own</td><td>His</td><td>Thr 115</td><td>Thr</td><td>Trp Met Glu</td><td>Trp 120</td><td>Asp</td><td>Arg</td><td>Glu</td><td>How much</td><td>Asn Asn 125</td><td>Tyr</td><td>Thr</td>

<td>Cheese</td><td>Leu 130</td><td>How much</td><td>His</td><td>Leu Ile 135 cheese</td><td>Glu</td><td>Glu</td><td>Cheese</td><td>Gin</td><td>own 140</td><td>Gin Gin</td><td>Glu</td><td>lys</td>

<td>own 145</td><td>Glu</td><td>Gin</td><td>Glu</td><td>Leu Leu Glu 150</td><td>Leu</td><td>Asp</td><td>lys</td><td>Trp 155</td><td>ala</td><td>Leu cheese</td><td>Trp</td><td>own 160</td>

<td>Trp</td><td>phe</td><td>own</td><td>How much</td><td>Thr</td><td>own</td><td>Trp</td><td>Leu</td><td>Trp</td><td>Tyr</td><td>How much</td><td>lys</td><td>Leu</td><td>phe</td><td>How much</td><td>Underworld</td>

<td></td><td></td><td></td><td></td><td> 165</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 170</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 175</td><td></td>

<td>How much</td><td>val</td><td>Gly</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>val</td><td>Gly</td><td>Leu</td><td>Arg</td><td>How much</td><td>val</td><td>phe</td><td>ala</td><td>val</td><td>Leu</td><td>Cheese</td>

<td></td><td></td><td></td><td> 180</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 185</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 190</td><td></td><td></td>

<td>How much</td><td>val</td><td>own</td><td>Arg</td><td>val</td><td>Arg</td><td>Gin</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

<td></td><td></td><td> 195</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td>

&lt;210&gt; 22 &lt;211&gt; 22 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 22

Gly Asn His Ile Leu Cheese Leu Val Gin Asn Ala Pro Tyr Gly Leu Tyr 15 10 15

Phe Ile His Phe Ser Trp 20 &lt;210&gt; 23 &lt;211&gt; 19 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 23

Gly Tyr Phe Val Gin Asp Asp Gly Glu Trp Lys Phe Thr Gly Ser Cheese 15 10 15

Tyr Tyr Tyr &lt;210&gt; 24 &lt;211&gt; 22 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 24

Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gin Ala Ala Pro His Gly Val Val 15 10 15

Phe Leu His Val Thr Tyr 20 &lt;210&gt; 25 &lt;211&gt; 19 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 25

Gly Val Phe Val Phe Asn Gly Thr Ser Trp Phe Ile Thr Gin Arg Asn 15 10 15

Phe Phe Ser &lt;210&gt; 26 &lt;211&gt; 19 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 26

Met Phe Pro Pro Trp Cheese Ala Ala Ala Gly Val Pro Phe 15 10

Leu cheese 15

Cheese

Val Gin Tyr &lt;210&gt; 27 &lt;211&gt; 26 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 27 Gin. Asp 1

Val Gly &lt;210&gt; 28 &lt;211&gt; 19 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 28

Met Tyr Lys Thr Pro Thr Leu Lys 1 5

<td>ala</td><td>How much</td><td>lys</td><td>lys</td><td>Leu</td><td>own</td><td>Glu</td><td>Tyr cheese</td><td>Ile Asn Leu Lys Glu</td>

<td></td><td></td><td> 5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 10</td><td> 15</td>

<td>Thr</td><td>Tyr</td><td>Glu</td><td>Underworld</td><td>Tyr</td><td>val</td><td>lys</td><td>Trp</td><td></td>

<td></td><td> 20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 25</td><td></td><td> •</td>

Tyr Phe 10

Gly Gly Phe Asn

phe

Cheese

Gin Ile Leu &lt;210&gt; 29 &lt;211&gt; 28 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 29

<td>ala</td><td>ala</td><td>Cys</td><td>Glu</td><td>val</td><td>ala</td><td>lys</td><td>own</td><td>Leu</td><td>own</td><td>Glu</td><td>Cheese</td>

<td> 1</td><td></td><td></td><td></td><td> 5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 10</td><td></td><td></td>

<td>Gin</td><td>Glu</td><td>Leu</td><td>Gly</td><td>lys</td><td>Tyr</td><td>Glu</td><td>Gin</td><td>Tyr</td><td>How much</td><td>lys</td><td>Trp</td>

<td></td><td></td><td></td><td> 20</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> 25</td><td></td><td></td><td></td>

Leu

How much Asp 15

Leu &lt;210&gt; 30 &lt;211&gt; 15 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 30

Asn Tyr Ser Lys Tyr Trp Tyr Leu Asn His Thr Thr Thr Gly Arg 1 5 10 15 &lt;210&gt; 31 &lt;211&gt; 19 &lt;212&gt; PRT &lt;213&gt; Artificial sequence &lt;220&gt;

&lt;223&gt; Synthetic peptide &lt;400&gt; 31

Gly Thr Phe Thr Trp Thr Leu Ser Asp Ser Glu Gly Lys Asp Thr Pro 15 10 15

Gly Gly Tyr