Nova Patents
PL1608382T3

Process for the staining of sperm

Abstract

Sperm cells are stained according to processes that involve the combining of sperm cells with a fluorescent DNA selective dye at an elevated temperature in excess of about 40° C. The methods allow for a decreased staining time. The cells may thereafter be efficiently sorted according to common separation methods, including flow cytometry.

Term

Term ended

Projected expiry passed 29 March 2024, 2.5 years ago.

  1. Priority
  2. Filed
  3. Published
  4. Projected expiry
  5. Today

1 claim: 1 independent, 0 dependent

  1. 1
    Patent claims:Zastrzeżenia patentowe: 1. A method of staining sperm cells, the method comprising preparing a staining mixture comprising;intact, live sperm cells and DNA-specific fluorescent dye, and subjecting the staining mixture to a temperature higher than 40 ° C without significantly interfering with the viability of the stained cells. 1. Sposób barwienia komórek plemnikowych, przy czym sposób obejmuje sporządzenie mieszaniny barwiącej zawierające;j nienaruszone, żywe komórki plemników oraz barwnik fluorescencyjny swoisty wobec DNA,, oraz poddanie mieszaniny barwiącej temperaturze wyższej niż 40°C bez istotnego zakłócania żywotności barwionych komórek. 2. The method according to claim The process of claim 1, wherein the dye is excitable under UV light or visible. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że barwnik jest barwnikiem możliwym do wzbudzenia w świetle UV lub możliwym do wzbudzenia w świetle widzialnym. 3. The method according to claim The process of claim 2, wherein the dye is selected from the group consisting of bisbenzymid, SYBR-14 and a conjugate, analogue or derivative thereof. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że barwnik jest wybrany z grupy składającej się z bisbenzymidu, SYBR-14 i ich koniugatu, analogu lub pochodnej. 4. The method according to claim 3. The process of claim 3, wherein the dye is selected from the group consisting of Hoechst 33342, Hoechst 33258,SYBR-14 and 6-{[3-((2Z)-2-{[1-(diforoborylo)-3,5-dimethyl-1F- pyrrol-2-yl] methylene} -2H-pyrrol-5-yl) propanoyl] amino} -N- [3- (methyl {3-[({4-[6-(4-methylpandperazyn-1-yl)-1F,3' H 2.5'- isbenzymidazol-2'-yl] phenoxy} acetyl) amino] propyl} amino) propyl] heksanoamidu. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że barwnik jest wybrany z grupy składającej się z Hoechst 33342, Hoechst 33258, SYBR-14 i 6-{[3-((2Z)-2-{[1-(difluoroborylo)-3,5-dimetylo-1F- pirol-2-ilo]metyleno}-2H-pirol-5-ilo)propanoilo]amino}-N-[3(metylo{3-[({4-[6-(4-metylopiperazyn-1-ilo)-1F,3' H-2,5'- isbenzymidazol-2'-ilo]fenoksy}acetylo)amino]propylo}amino)propylo]heksanoamidu. 5. The method according to claim The process of claim 1, wherein the staining mixture is subjected to a temperature for a period of time sufficient to allow the dye to bind to the DNA so that the sperm cells carrying X and Y can be differentially sorted based on fluorescence. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszanina barwiąca jest poddawana temperaturze przez okres czasu wystarczający, aby umożliwić związanie barwnika z DNA tak, że komórki plemnikowe, niosące X i Y mogą być różnicująco sortowane w oparciu o fluorescencję. 16. The method according to claim The process of claim 1, wherein the step of preparing the staining mixture comprises combining the buffer with sperm cells. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap sporządzania mieszaniny barwiącej obejmuje łączenie buforu z komórkami spermy. 17. The method according to the claims 16. The method of claim 16, wherein the biofilm is combined with sperm cells to form a sperm suspension, and the sperm suspension is combined with a DNA specific dye to form a staining mixture. 17. Sposób według zastrrz. 16, znamienny tym, że bi^zfc^or jest łączony z komórkami spermy, z utworzeniem zawiesiny plemników, i zawiesina plemników jest łączona z barwnikiem swoistym wobec DNA, z utworzeniem mieszaniny barwiącej. 18. The method according to claim The process of claim 1, wherein the step of preparing the dyeing mixture comprises combining the buffer with a DNA specific dye to form a buffered dye solution, and combining the buffered dye solution with sperm cells to form a dyeing mixture. 18. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap sporządzania mieszaniny barwiącej obejmuje łączenie buforu z barwnikiem swoistym wobec DNA, z utworzeniem buforowanego roztworu barwnika, i łączenie buforowanego roztworu barwnika z komórkami spermy, z utworzeniem mieszaniny barwiącej. 19. The method according to claim The process of claim 1, further comprising the step of combining the quencher with the coloring mixture. 19. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że dodatkowo obejmuje etap łączenia wygaszacza z mieszaniną barwiącą. 20. Sposób według zastrz. 19, znamienny tym, że wygaszacz jest wybrany z grupy składającej się z FD&C #40 i jodku propydyny. twenty. The method according to claim 19. The method of claim 19, wherein the quencher is selected from the group consisting of FD&C # 40 and propidium iodide. barwiąca dodatkowo zawiera inhibitor ruchliwości. staining additionally contains a motility inhibitor. 25. The method according to claim The method of claim 1, wherein the step of preparing the staining mixture comprises combining the motility inhibitor with sperm cells to form an inhibited sperm suspension, and combining the inhibited sperm suspension with a DNA specific dye to form the staining mixture. 25. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że etap sporządzania mieszaniny barwiącej obejmuje łączenie inhibitora ruchliwości z komórkami spermy, z utworzeniem inhibitowanej zawiesiny plemników, i łączenie inhibitowanej zawiesiny plemników z barwnikiem swoistym wobec DNA, z utworzeniem mieszaniny barwiącej. 26. The method according to claim 25. The method of claim 25, wherein the motility inhibitor comprises a carbonate based motility inhibitor. 26. Sposób według zastrz. 25, znamienny tym, że inhibitor ruchliwości obejmuje inhibitor ruchliwości na bazie węglanu. 27. The method according to claim 26, characterized in that the carbonate-based motility inhibitor includes NaHCCy, KHCO3 and Ce ^ CbdUO. 27. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że inhibitor ruchliwości na bazie węglanu obejmuje NaHCCy, KHCO3 i Ce^CbdUO. 28. The method according to claim 27, characterized in that the carbonate-based mobility inhibitor includes 0.097 mol / L NaHCO3, 0.173 mol / 1khCO3, 0,090 mol/l ^ ¾0°¾0 in the water. 28. Sposób według zastrz. 27, znamienny tym, że inhibitor ruchliwości na bazie węglanu obejmuje 0,097 mola/l NaHCO3, 0,173 mola/1 khCO3, 0,090 mola/l ^¾0°¾0 w wodzie. 29. The method according to claim The process of claim 1, wherein the staining mixture further comprises a composition that regulates oxidation / reduction reactions intracellularly or extracellularly. 29. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że mieszanina barwiąca dodatkowo obejmuje kompozycję, która reguluje reakcje utleniania/redukcji wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo. 30. Sposób według zastrz. 29 znamienny tym, że kompozycja, która reguluje reakcje utleniania/redukcji wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo jest wybrana z grupy składającej się z pirogronianu, witaminy K, kwasu liponowego, glutationu, flawin, chinonów, nadtlenku dysmutazy i naśladowców nadtlenku dysmutazy. thirty. The method according to claim Characterized in that the composition that regulates the oxidation / reduction reactions intracellularly or extracellularly is selected from the group consisting of pyruvate, vitamin K, lipoic acid, glutathione, flavin, quinones, dismutase peroxide and dismutase peroxide imitators. 31. The method according to claim Characterized in that the composition that regulates the intracellular or extracellular oxidation / reduction reactions is selected from the group consisting of pyruvate, vitamin K and lipoic acid. 31. Sposób według zastrz. 30 znamienny tym, że kompozycja, która reguluje reakcje utleniania/redukcji wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo jest wybrana z grupy składającej się z pirogronianu, witaminy K i kwasu liponowego. 32. The method according to claim The process of claim 31, wherein the composition that regulates the intracellular or extracellular oxidation / reduction reactions comprises pyruvate at a concentration of 0.5 pM to50 mM. 32. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że kompozycja, która reguluje reakcje utleniania/redukcji wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo obejmuje pirogronian o stężeniu od 0,5 pM do 50 mM. 33. The method according to claim The process of claim 32, wherein the composition that regulates intracellular or extracellular oxidation / reduction reactions comprises pyruvate at a concentration of 10 mM to 15 mM. 33. Sposób według zastrz. 32, znamienny tym, że kompozycja, która reguluje reakcje utleniania/redukcji wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo obejmuje pirogronian o stężeniu od 10 mM do 15 mM. 34. The method according to claim The composition of claim 33, wherein the composition that regulates the oxidation / reduction reactions intracellularly or extracellularally comprises pyruvate at a concentration of about 10 mM. 34. Sposób według zastrz. 33, znamienny tym, że kompozycja, która reguluje reakcje utleniania/redukcji wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo obejmuje pirogronian o stężeniu około 10 mM. 35. The method according to claim The process of claim 31, wherein the composition that regulates the oxidation / reduction reactions intracellularly or extracellularally comprises vitamin K at a concentration of 1 pM to 100 pM. 35. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że kompozycja, która reguluje reakcje utleniania/redukcji wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo obejmuje witaminę K o stężeniu 1 pM do 100 pM. 36. The method according to claim The use of claim 35, wherein the composition that regulates the oxidation / reduction reactions intracellularly or extracellularally comprises vitamin K at a concentration of about 100 pM. 36. Sposób według zastrz. 35, znamienny tym, że kompozycja, która reguluje reakcje utleniania/redukcji wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo obejmuje witaminę K o stężeniu około 100 pM. 37. The method according to claim The process of claim 31, wherein the composition that regulates the oxidation / reduction reactions intracellularly or extracellularally comprises lipoic acid at a concentration of 0.1 mM to 1.0 mM. 37. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że kompozycja, która reguluje reakcje utleniania/redukcji wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo obejmuje kwas liponowy o stężeniu 0,1 mM do 1,0 mM. 38. The method according to claim The process of claim 31, wherein the composition that regulates the oxidation / reduction reactions intracellularly or extracellularally comprises lipoic acid at a concentration of about 1.0 mM. 38. Sposób według zastrz. 31, znamienny tym, że kompozycja, która reguluje reakcje utleniania/redukcji wewnątrzkomórkowo lub zewnątrzkomórkowo obejmuje kwas liponowy o stężeniu około 1,0 mM. Monsanto Technology LLC Deputy: Monsanto Technology LLC Zastępca: 133 133 FIG. ΙΑ FIG. ΙΑ Comparison of fluorescence intensity of 20 uM stained Hoechst 33342 sperm at 39 ° C & 41 ° C | - + - 39 * C ^ -4VC Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 20 uM Hoechst 33342 w 39°C & 41 °C |-+-39*C ^-4VC FIG. IB FIG. IB Comparison of fluorescence intensity of 30 uM stained Hoechst 33342 sperm at 39 ° C & 41 ° C [- :;~ 39 * C -l'r-41 * C | Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 30 uM Hoechst 33342 w 39°C & 41 °C [—:;~39*C -l'r-41*C | 2/33 2/33 FIG. 1C FIG. 1C Comparison of fluorescence intensity of 57 µM Hoechst 33342 stained sperm at 39 ° C & 41 ° C Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 57 uM Hoechst 33342 w 39°C & 41° C - »- 4rc -»-4rc FIG. ID FIG. ID Comparison of fluorescence intensity of 85 µM Hoechst 33342 stained sperm at 39 ° C & 41 ° C Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 85 uM Hoechst 33342 w 39°C & 41°C Fluorescence intensity} · fr-jMTC -fl-41 «C Intensywność fluorescencji }· fr-jMTC -fl-41«C 3/33 3/33 FIG. 2A FIG. 2A Comparison of fluorescence intensity of 20 uM stained Hoechst 33342 sperm at 39 ° C & 41 ° C | -A - fl * C -Π-4Ϊ * Ο Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 20 uM Hoechst 33342 w 39° C & 41° C |-A-fl*C -Π-4Ϊ*Ο FIG. 2B FIG. 2B Comparison of fluorescence intensity of 30 µM Hoechst 33342 stained sperm at 39 ° C & 41 ° C Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 30 uM Hoechst 33342 w 39°C & 41 °C I ~ il-9 ^ * C —ł — 41 * C I~iłr-9^*C —ł—41*C Czas barwienia (min) Staining time (min) 4/33 4/33 FIG. 2C FIG. 2C Comparison of fluorescence intensity of 40 uM stained Hoechst 33342 sperm at 39 ° C & 41 ° C Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 40 uM Hoechst 33342 w 39°C & 41 °C FIG. 2D FIG. 2D Comparison of fluorescence intensity of 60 µM Hoechst 33342 stained sperm at 39 ° C & 41 ° C Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 60 uM Hoechst 33342 w 39°C & 41 °C Fluorescence intensity | -39 * C -Β-41'C Intensywność fluorescencji |—39*C -Β-41'C 5/33 5/33 FIG. 3A FIG. 3A Comparison of fluorescence intensity of sperm stained with 20 uM Hoechst 33342 at 39 ° C & 43 ° C Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 20 uM Hoechst 33342 w 39°C & 43° C -, k-38 »C -eł-43'C -,k-38»C -eł-43’C FIG. 3B FIG. 3B Comparison of fluorescence intensity of 30 µM Hoechst 33342 stained sperm at 39 ° C & 43 ° C Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 30 uM Hoechst 33342 w 39° C & 43° C -ćr-39 * C -o-43 * C -ćr-39*C -o-43*C Coloring time (min) Czas wybarwienia (min) 6/33 6/33 FIG. 3C FIG. 3C Comparison of fluorescence intensity of 40 µM stained Hoechst 33342 sperm at 39 ° C & 43 ° C | —F — 39 * C —fr-33 * c Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 40 uM Hoechst 33342 w 39°C & 43° C | —f—39*C —fr-33*c FIG. 3D FIG. 3D Comparison of fluorescence intensity of 60 µM Hoechst 33342 stained sperm at 39 ° C & 43 ° C Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 60 uM Hoechst 33342 w 39°C & 43°C Czas barwienia (min) Staining time (min) 7/33 7/33 FIG. 4A FIG. 4A Comparison of fluorescence intensity for 80 µM Hoechst 33342 stained sperm in 39 ° C & 43 ° C —3—43 * C —-r — '99 * C Porównanie intensywności fluorescencji dla plemników wybarwionych 80 uM Hoechst 33342 w 39°C & 43°C —3—43*C —-r—’99*C FIG. 4B FIG. 4B Comparison of fluorescence intensity for 100 uM stained Hoechst 33342 sperm at 39 ° C & 43 ° C | -Q-43 ° C Porównanie intensywności fluorescencji dla plemników wybarwionych 100 uM Hoechst 33342 w 39° C & 43° C | -Q-43*C Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 8/33 8/33 45 * C -Δ-39'C 45*C -Δ-39'C Fluorescence intensity Fluorescence intensity Intensywność fluorescencji Intensywność fluorescencji FIG. 5A FIG. 5A Comparison of fluorescence intensities for 80 uM stained Hoechst 33342 sperm at 39 ° C & 45 ° C Porównanie intensywności fluorescencji dla plemników wybarwionych 80 uM Hoechst 33342 w 39°Ć & 45°C 800 800 -1-1 I I " I .......< ' "I"1 I ........I" I ’ 1 '1 " I -1-1 II "I ....... <'" I "1 And ........ And 'I' 1 '1 "I 0:00 0:02 0:09 0:08 0:11 0:14 0:17 0:20 0:23 0:25 0:28 0:31 0:34 0:00 0:02 0:09 0:08 0:11 0:14 0:17 0:20 0:23 0:25 0:28 0:31 0:34 Czas barwienia (godz: min) Staining time (hours: min) FIG. 5B FIG. 5B Comparison of fluorescence intensity for 100 uM Hoechst 33342 stained sperm at 39 ° C & 45 ° C Porównanie intensywności fluorescencji dla plemników wybarwionych 100 uM Hoechst 33342 w 39° C & 45° C -8-4853 —ifc — 38 * C -8-4853 —ifc—38*C Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 903 903 FIG. 6A FIG. 6A Comparison of fluorescence intensity of 60 µM Hoechst 33342 stained sperm at 39 ° C & 47 ° C Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 60 uM Hoechst 33342 w 39°C & 47 °C -63-47'C -4r-39'C -63-47’C -4r-39‘C FIG. 6B FIG. 6B Comparison of fluorescence intensity of 150 µM Hoechst 33342 stained sperm at 39 ° C & 43 ° C 1- * - <3 * C — 4r — 39 * C Porównanie intensywności fluorescencji plemników wybarwionych 150 uM Hoechst 33342 w 39°C & 43°C 1—*-<3*C —4r—39*C Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) AND I 10/33 10/33 FIG. 7A FIG. 7A Comparison of% IVOS mobility and% Prog Mot at 41 ° C unstained and stained sperm 60 uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Mot w 41 °C spermy niebarwionej i barwionej 60 uM Hoechst 33342 FIG. 7B FIG. 7B Comparison of% IVOS mobility and% Mot threshold in 43ABOUTC unstained and stained sperm 60 µM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Mot w 43OC spermy niebarwionej i barwionej 60 uM Hoechst 33342 Λ Sperma niebarwiona % ruchliwości O Sperma bawiona 60 uM % ruchliwości Λ Unspermed sperm% motility O Played sperm 60 uM% motility Λ Sperma niebarwiona % Prog Mot □} Sperma barwiona 60 uM % Prog Mot Λ Unspermed sperm% Prog Mot □} Stained sperm 60 uM% Prog Mot 11/33 11/33 FIG. 8A FIG. 8A Comparison of% mobility IVOS and% Threshold Mot at 39 ° C unstained and stained sperm 60uM Hoechst 33342 ▲ Unstained sperm% mobility BSpermed stained 60 uM% mobility Λ Unspermed sperm% Threshold Mot ι1 Sperm sperm 60 uM% Threshold Mot Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Mot w 39°C spermy niebarwionej i barwionej 60uM Hoechst 33342 ▲ Sperma niebarwiona % ruchliwości BSperma barwiona 60 uM % ruchliwość Λ Sperma niebarwiona % Próg Mot ι1 Sperma bawiona 60 uM % Próg Mot FIG. 8B FIG. 8B Comparison of% IVOS mobility and% Mot threshold at 45 ° C unstained and stained sperm 60uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Mot w 45°C spermy niebarwionej i barwionej 60uM Hoechst 33342 A Sperm unstained% mobility OJSperm stained 60 µM% mobility A Sperma niebarwiona % ruchliwości OJSperma barwiona 60 uM % ruchiiwości Δ Sperm undyed.% Mot threshold;j Sperm dyed 60 µM% Mot threshold% Mobility and threshold Mot Δ Sperma niebarwiona .% Próg Mot ;j Sperma barwiona 60 uM % Próg Mot % Ruchliwości i Próg Mot Czas barwienia (godz:m;n) Staining time (hours: m;n) 12/33 12/33 FIG. 9A FIG. 9A Comparison of% IVOS mobility and% Prog Motw41 ° C unstained and dyed sperm 80uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Motw41°C spermy niebarwionej i barwionej 80uM Hoechst 33342 Comparison of% IVOS mobility and% Prog Mot at 43 ° C unstained and stained 80uM sperm Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Mot w 43° C spermy niebarwionej i barwionej 80uM Hoechst 33342 A Sperm uncoloured% motility Π Sperm baiwioria 80uM% motility A Sperma niebarwiona % ruchliwości Π Sperma baiwioria 80uM % ruchliwości -s Sperma niebarwiona % Prog Mot 13. Spemria bawiona 80uM % Prog Miot -s Unspermed sperm% Prog Mot 13. Cotton spemria 80uM% Prog Litter Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 13/33 13/33 FIG. 9C FIG. 9C Comparison of% IVOS mobility and% Mot threshold at 45 ° C unstained and stained 80uM sperm Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Mot w 45° C spermy niebarwionej i barwionej 80uM Hoechst 33342 A Sperm unstained% motility 0 Stained sperm 80uM% motility A Sperma niebarwiona % ruchliwości 0 Sperma barwiona 80uM % ruchliwości Sperma niebarwiona % Próg Mot□ i Sperma barwiona 80uM % Próg Mot °/a Ruchliwości i % Próg Mot Unspermed sperm% Mot Mot □ i Sperm dyed 80uM% Mot mot threshold / a Mobility and% Mot mot threshold Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 14/33 14/33 FIG. 10A Comparison of% mobility IVOS and% Prog Mot at 41 ° C unstained and stained sperm 100uM Hoechst 33342 FIG. 10A Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Mot w 41 °C spermy niebarwionej i barwionej 100uM Hoechst 33342 A Cum sperm% motility 'Cum sperm 100uM% agitation A Sperma niebarwtona % ruchliwości 'Sperma bawiona 100uM % uuchliwości Sperma niebarwiona % Prog Mot ® 'Sperma bawiona 100uM % Prog Mot Uncolored sperm% Prog Mot ® 'Cotton sperm 100uM% Prog Mot FIG. 10B FIG. 10B Comparison of% IVOS mobility and% Prog Mot at 43 ° C unstained and stained sperm 100uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Mot w 43°C spermy niebarwionej i barwionej 100uM Hoechst 33342 A Sperm unstained% mobility BI Sperm 100uM% A Sperma niebarwiona % ruchliwości BI Sperma bawiona 100uM % Sperma niebarwiona % Prog Mot_u Sperma bawiona 100uM % Prag Miot Un dyed sperm% Prog Mot_u Cotton sperm 100uM% Prag Litter Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 15/33 15/33 FIG. 10C FIG. 10C Comparison of% IVOS mobility and% Motw45 ° C threshold uncoloured and dyed sperm 10OuM Hoechst 33342 ▲ Unspermed sperm% mobility BSpermed dye 100uM% mobility Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Motw45°C spermy niebarwionej i barwionej 10OuM Hoechst 33342 ▲ Sperma niebarwiona % ruchliwości BSperma barwiona 100uM % ruchliwość i. Sperma niebarwiona % Próg Mot_BSperma barwiona 100uM % Prag Mot i. Unspermed sperm% Threshold Mot_B Sperm dyed 100uM% Prag Mot FIG. 11 FIG. 11 Comparison of% IVOS mobility and% Mot threshold at 47 ° C unstained and stained sperm 100uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Mot w 47°C spermy niebarwionej i barwionej 100uM Hoechst 33342 0:00 0:05 0:10 0:15 030 035 0:30 0:35 0:40 0:45 0:50 0:55 1:00 1:05 1:10 0:00 0:05 0:10 0:15 030 035 0:30 0:35 0:40 0:45 0:50 0:55 1:00 1:05 1:10 Czas barwienia (godz.min) Staining time (hours min) 16/33 16/33 FIG. 12 FIG. 12 Comparison of% mobility IVOS and% Prog Motw49 ° C sperm unstained and stained 100uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Motw49°C spermy niebarwionei i barwionej 100uM Hoechst 33342 Sperma niebarwiona % ruchliwości Sperma bawiona 100uM % ruchliwości Un dyed sperm% motility Cum sperm 100uM% motility A Sperma nieba rwiona % Prog Mot_Ł3 Sperma barwiona 100uM % Prog Mot A Sperma sky rwiona% Prog Mot_Ł3 Sperm dyed 100uM% Prog Mot 17/33 17/33 FIG. 13A FIG. 13A Comparison of% IVOS mobility and% Prog Mot at 43 ° C unstained and stained sperm 125uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Mot w43°C spermy niebarwionej i barwionej 125uM Hoechst 33342 .......... WI '1 - ..........W I '1 — A Sperm unstained% mobility B Sperm stained 125uM% mobility Δ Unspermed sperm% Prog Mot © Stained sperm 125uM% Prog Mot A Sperma niebarwiona % ruchliwości B Sperma barwiona 125uM % ruchliwości Δ Sperma niebarwiona % Prog Mot ©Sperma barwiona 125uM % Prog Mot FIG. 13B FIG. 13B Comparison of% IVOS mobility and% Prog Mot at 43 ° C unstained and stained 150uM sperm Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Mot w 43° C spermy niebarwionej i barwionej 150uM Hoechst 33342 A Sperma niebarwiona % ruchliwości Q Sperma barwiona 150uM % ruchiiwości & Sperma niebarwiona % Prog Mot 13 Sperma bawiona 150uM % Prog Mot A Unspermed sperm% mobility Q Sperm dyed 150uM% mobility & Unspermed sperm% Prog Mot 13 Cum sperm 150uM% Prog Mot Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 18/33 18/33 FIG. 14A FIG. 14A Comparison of% IVOS mobility and% Mot threshold at 43 ° C dyed sperm 200uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Mot w 43°C spermy barwionej 200uM Hoechst 33342 A Sperm unstained% mobility ♦ Sperm stained 200uM% mobility Δ Unspermed sperm% Threshold Mot ·>! Sperm dyed 200uM% Threshold Mot A Sperma niebarwiona % ruchliwości ♦Sperma barwiona 200uM % ruchliwości Δ Sperma niebarwiona % Próg Mot ·>! Sperma barwiona 200uM % Próg Mot FIG. 14B FIG. 14B Comparison of% IVOS mobility and% Mot threshold at 43 ° C dyed sperm 250uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Mot w 43°C spermy barwionej 250uM Hoechst 33342 A Sperm unstained% motility OSpermed stained 250uM% motility A Sperma niebarwiona % ruchliwości OSperma barwiona 250uM % ruchliwości Λ, Sperma niebarwiona % Próg Mot_a Sperma b25wu^na 250oM % Prog Mot % Ruchliwości i % Próg Mot Λ, Unspermed sperm% Threshold Mot_a Sperm b25wu ^ at 250oM% Prog Mot% Mobility and% Threshold Mot Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 19/33 19/33 FIG. 15A FIG. 15A Comparison of% IVOS mobility and% Prog Mot at 45 ° C stained sperm 125uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Mot w 45° C spermy barwionej 125uM Hoechst 33342 A Sperm unstained% mobility OSperm stained 125uM% mobility ń Unstained sperm% Prog Mot OS Stained sperm 125uM% Prog Mot A Sperma niebarwiona % ruchliwości OSperma barwiona 125uM % ruchliwość ń Sperma niebarwiona % Prog Mot OSperma barwiona 125uM % Prog Mot FIG. 15B FIG. 15B Comparison of% IVOS mobility and% Prog Motw45 ° C dyed sperm 150uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Motw45°C spermy barwionej 150uM Hoechst 33342 A Sperma niebarwiona % ruchliwości OSperma barwiona 150uM % ruchliwość A Sperma niebarwiona % Prog Mot u Sperma barwiona 150uM % Prog Mot A Unspermed sperm% motility OS Stained sperm 150uM% mobility A Unspermed sperm% Prog Mot u Sperm dyed 150uM% Prog Mot 0:00 0:05 0:11 0:17 0:23 0:28 0:34 0:40 0:48 0:51 0:57 1:03 1:09 0:00 0:05 0:11 0:17 0:23 0:28 0:34 0:40 0:48 0:51 0:57 1:03 1:09 Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 20/33 20/33 FIG. 16A FIG. 16A Comparison of% IVOS mobility and% Mot threshold at 45 ° C dyed sperm 200uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Mot w 45°C spermy barwionej 200uM Hoechst 33342 A Sperma niebarwiona % ruchliwości ♦ Sperma barwiona200uM % njchiiwości Δ Sperma niebarwiona % Próg Mot Sperma barwiona200uM % Próg Mol A Un-dyed sperm% motility ♦ Sperm dyed 200uM% high Δ Unspermed sperm% Mot threshold Dyed sperm 200uM% Mol threshold FIG. 16B FIG. 16B Comparison of% IVOS mobility and% Mot threshold at 45 ° C dyed sperm 250uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Mot w 45° C spermy barwionej 250uM Hoechst 33342 A Sperm unstained% mobility Φ Stained sperm 250uM% mobility Δ Unstained sperm% Threshold Mot 'Sperm stained 250uM% Threshold Mot A Sperma niebarwiona % ruchliwości Φ Sperma barwiona 250uM % ruchliwoi Δ Sperma niebarwiona % Próg Mot 'Sperma barwiona 250uM % Próg Mot Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 21/33 21/33 FIG. 16C FIG. 16C Comparison of% IVOS mobility and% Prog Motw45 ° C dyed sperm 300uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Motw45°C spermy barwionej 300uM Hoechst 33342 A Sperm not dyed% mobility «SSeerraa baiwiona 300uMt% mobility A Sperma niebarwiona % ruchliwości «SSeerraa baiwiona 300uMt % ruchliwości A Sperm unstained% Prog Mot O> Spermabou 300uM% Prog M ^ ot A Sperma niebarwiona % Prog Mot O> Spermabawiona 300uM % Prog M^ot Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 22/33 22/33 FIG. 17A FIG. 17A Comparison of% IVOS mobility and% Mot threshold at 43 ° C dyed sperm 300uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Mot w 43°C spermy barwionej 300uM Hoechst 33342 A Sperma niebarwiona, % ruchliwości ♦ Sperma baw/iona 300uM, % rnchliwoCci A Un-dyed sperm,% mobility ♦ Sperm, cotton 300%,% absorbability Ą Sperm dyed,% Proą Mot_φ Sperm sperm 300uM,% Prog M ot Ą Sperma niebarwiona, % Proą Mot_φ Sperma bawiona 300uM , % Prog M ot FIG. 17B FIG. 17B Comparison of% IVOS mobility and% Mot threshold at 43 ° C dyed sperm 350uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Próg Mot w 43° C spermy barwionej 350uM Hoechst 33342 0:00 0:07 0:14 0:21 0:28 0:38 0:43 0:50 0:57 1:04 1:12 1:19 1:26 1:33 1:40 0:00 0:07 0:14 0:21 0:28 0:38 0:43 0:50 0:57 1:04 1:12 1:19 1:26 1:33 1:40 Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 23/33 23/33 FIG. 17C FIG. 17C Comparison of% IVOS mobility and% Prog Mot at 43 ° C stained sperm 400uM Hoechst 33342 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Mot w 43° C spermy barwionej 400uM Hoechst 33342 A Sperma niebarwiona, % ruchliwości A Sperma niebarwiona, % Prog Mot A Un-dyed sperm,% mobility A Un-dyed sperm,% Prog Mot O Sperm dyed 400uM,% mobility ... - Sperm dyed 400uM,% Prog Mot O Sperma barwiona 400uM, % ruchliwości .-..Sperma barwiona 400uM, % Prog Mot 100 100 90 A 80 90 A 80 7o 7o CL CL 80 50 S 40 1 30 | 20 * 10 80 50 S 40 1 30 | 20 * 10 TS TS 4JL. 4JL. 0:00 0:07 0:14 021 0:28 0:38 0:43 0:50 0:57 1Λ4 1:12 1:18 1: 2β 1:33 1:40 0:00 0:07 0:14 021 0:28 0:38 0:43 0:50 0:57 1Λ4 1:12 1:18 1:2β 1:33 1:40 Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 24/33 24/33 FIG. 18A FIG. 18A Comparison of% IVOS mobility and% Prog Mot at 43 ° C unstained and stained sperm 0.6uM SYBR 14 ♦ Unstained sperm,% mobility β Spemia coupled 0.6uM,% mobility '& Unspermed sperm,% Prog. Mot LI _ SuM,% Pręg Mot Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Mot w 43 °C spermy niebarwionej i barwionej 0,6uM SYBR 14 ♦ Sperma niebarwiona, % ruchliwości β Spemia bawiona 0,6uM , % ruchliwości ' & Sperma niebarwiona, % Prog.Mot LI _Spemia bawiona O.SuM , % Pręg Mot FIG. 18B FIG. 18B Comparison of% motility IVOS and% Prog Mot at 43 ° C sperm colored and stained 6.0rM SYBR 14 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Mot w43°C spermy niebarwionej i barwionej 6,0rM SYBR 14 A Sperm not colored,% mobility CjSpemna ​​buffy,% mobility A Sperma niebarwiona, % ruchliwości CjSpemna bawiona , % ruchiiwości Non-colored sperm,% Prog Mot □ Colored, 6.0uM sperm,% Prog Mot Sperma niebarwiona, % Prog Mot □ Sperma barwiona 6,0uM, % Prog Mot Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 25/33 % Ruchliwości i ruchliwości postępowej 25/33% Mobility and progressive mobility FIG. 18C FIG. 18C Comparison of% mobility IVOS and% Prog Mot at 43 ° C unstained and stained sperm 60uM SYBR 14 Porównanie % ruchliwości IVOS i % Prog Mot w43°C spermy niebarwionej i barwionej 60uM SYBR 14 Non-dyed sperm,% mobility B Dyed sperm 60uM, "// mobility /> Non-dyed sperm,% Prog Mot p Dyed sperm 60uM,% Prog Mot Sperma niebarwiona, % ruchliwości B Sperma barwiona 60uM, “//ruchliwości /> Sperma niebaiwiona, % Prog Mot p Sperma barwiona 60uM, % Prog Mot Czas barwienia (godz.min) Staining time (hours min) 26/33 26/33 FIG. 19A FIG. 19A Comparison of fluorescence intensity of 6uM SYBR 14 stained sperm at 39 ° C and 45 ° C Porównanie intensywności fluorescencji spermy barwionej 6uM SYBR 14 w 39°C i 45°C -HO-45C -ώ-38 · ϋ 'o * -HO-45C -ώ-38·ϋ 'o* FIG. 19B FIG. 19B Comparison of fluorescence intensity of 100uM BBC stained sperm at 39 ° C and 45 ° C Porównanie intensywności fluorescencji spermy barwionej 100uM BBC w 39°C i 45°C -68-45 * C ·. 39 * C | -68—45 *C · . 39*C | 27/33 27/33 Ο Ο ΓΜ ΓΜ AND I 28/33 28/33 19133 19133 IG. 22 IG. 22 30/33 <u 30/33 <u Ν Ν Ζ3 Ζ3 JQ < JQ < Ο Ο Η <U Η <U Ν £ Ν £ Σ3 Σ3 ΙΛ ΙΛ -C -C Ο here ο Ο tu ο X ο X ο ο "Ί- ο "Ί- Ο ο Ο ο τ— • φ * c τ— •φ* c ο ra ο ra Xi ε Xi ε here tu ο. ο. ΙΛ ΙΛ C0 ο C0 ο > > CO WHAT Γ \ Ι ό Γ\Ι ό I IX. I—ł IX. Ο) Ο) α. α. <U <U C ra c C ra c Ό Ό at. u. Ο Ο Ο. Ο. Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min) 31/33 31/33 UUUA UUUA ΓΜ ΓΜ CM CM Ο Ο AND I T-t • · m Tt · · m Ol ol LO • · oi m LO • · oi m « a «A Ol a »o • · Ol oan Ol a» o • · Ol o a n xr xr Ol • · o Ol • · o Czas barwienia (godz:min) |0A| 6oJd % Staining time (hours: min) | 0A 6oJd% 32/33 32/33 LO LO Ol ol ABOUT O LL LL CM co' CM what ' X X about. o. about o O) o O) o c ro c ro O) O) r -Ω s * o -Ω s* o CM φ CM φ c ro c ro TJ TJ o TJ TJ ę E o E o What co N N Φ Φ N N ABOUT. O. CO WHAT Y Y X X about. o. o c oc .ro σ> .ro σ> & & ϊ_ o ϊ_ o Η— < Η— < about o Η Η Φ ΰ Φ ΰ £ £ Χ3 Χ3 C ro C ro Έ ο Έ ο UΟ) ο UΟ) ο I— '5. I— '5. ΙθΙΛΙ 6oJd % ΙθΙΛΙ 6oJd% Czas barwienia (godz:min) •Ważą: 7-.... Staining time (hours: min) • They weigh: 7 -.... 33/33 33/33 FIG. 26 FIG. 26 Czas barwienia (godz:min) Staining time (hours: min)