Penicillin-g acylases

PENICIUNA-G ACILASAS

La presente solicitud reclama prioridad de la solicitud de patente provisional Núm. de serie 62/158,118, presentada el 7 de mayo de 2015, incorporada como referencia en su totalidad en la presente para todos los propósitos.

REFERENCIA A LA LISTA DE SECUENCIAS, TABLA O PROGRAMA DE COMPUTACIÓN

El listado de secuencias que se presenta simultáneamente en virtud de 37 CFR §1.821 en una forma legible por computadora (CRF) a través de EFS-Web como nombre de archivo CX2-149W01_ST25.txt se incorpora aquí como referencia. La copia electrónica del Listado de Secuencias se creó el 28 de abril de 2016, con un tamaño de archivo de 88 Kbytes.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona enzimas diseñadas de penicilina G acilasa (PGA), polinucleótidos que codifican dichas enzimas, composiciones que incluyen las enzimas y métodos para usar las enzimas de PGA diseñadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La penicilina G adlasa (PGA) (penicilina amidasa, EC 3.5.1.11) cataliza la escisión del enlace de amida de la cadena lateral de la penicilina G (bencilpenicilina). La enzima se utilizó comercialmente en la fabricación de ácido 6-amino-penicilánico (6-APA) y ácido fenilacético (PAA). 6-APA es un compuesto clave en la producción industrial de antibióticos β-lactámicos semisintéticos tales como amoxicilina, ampicilina y cefalexina. La enzima de PGA de origen natural muestra inestabilidad en los procesos comerciales, lo que requiere la inmovilización en sustratos sólidos para aplicaciones comerciales. La PGA se ha unido covalentemente a varios soportes y los sistemas inmovilizados con PGA se han reportado como herramientas útiles para la síntesis de isómeros ópticos puros. Sin embargo, la unión a las superficies sólidas conduce a propiedades enzimáticas comprometidas, como la actividad y/o selectividad reducida y las limitaciones del acceso al soluto. Además, aunque la unión a sustratos sólidos permite la captura de enzimas y la reutilización en ciclos de procesamiento adicionales, la estabilidad de la enzima es tal que tales aplicaciones pueden estar limitadas. La catálisis enzimática por PGA de penicilina G a 6-APA es regiosespecífica (no escinde el enlace amida lactama) y estereoespecífica. La producción de 6-APA constituye quizás la

<img file="MX381306B_D0001.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO

DE LA PROPIEDAD

INDUSTRIAL mayor utilización de catálisis enzimática en la producción de productos farmacéuticos. La actividad enzimática de PGA, asociada con la porción fenacetilo, permite la hidrólisis estereoespecífica de una rica variedad de derivados de fenacetilo de aminas primarias así como también alcoholes.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona enzimas diseñadas de penicilina G adlasa (PGA), polinucleótidos que codifican dichas enzimas, composiciones que incluyen las enzimas y métodos para usar las enzimas de PGA diseñadas.

La presente invención proporciona penicilina G acllasas diseñadas capaces de eliminar los grupos protectores de acetato tri-fenilo A1/B1/B29 de insulina para producir insulina libre, en donde la penicilina G acilasa es por lo menos aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99%, o más idéntica a la SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, y/o 12. En algunas modalidades, la presente invención proporciona penicilina G acilasa diseñada capaz de eliminar los grupos protectores de acetato de tri-fenilo A1/B1/B29 de la insulina para producir insulina libre, en donde dicha penicilina G acilasa es al menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idénticas a la SEQ ID NO:2, 4, 6, 8,10 y/o 12. En algunas modalidades adicionales, la presente invención proporciona penicilina G acilasas diseñadas capaces de eliminar los grupos protectores de acetato de tri-fenilo A1/B1/B29 de la insulina libre, en donde la penicilina G acilasa comprende SEQ ID NO:2, 4, 6 , 8, 10 y/o 12. En algunas modalidades adicionales, la penicilina G acilasa comprende al menos una mutación según se proporciona en el cuadro 5.1, cuadro 6.2 y/o cuadro 6.3.

La presente invención también proporciona una penicilina G acilasa codificada por una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98%, aproximadamente 99% o más identidad de secuencia con una secuencia seleccionada de las SEQ ID NOS:3, 5, 7, 9 y 11.

En algunas modalidades, la penicilin G acilasa codificada por una secuencia de polinucleótidos tiene por lo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%. 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de la identidad de secuencia seleccionada de las SEQ ID NOS:3, 5, 7,

<img file="MX381306B_D0002.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO

DE LA PROPIEDAD

INDUSTRIAL

9,10 y/ó 11. En algunas modalidades, la penicilina G acilasa diseñada codificada por una secuencia de polinucleótidos seleccionada de SEQ ID NO:3, 5, 7, 9 y 11. La presente Invención también proporciona vectores que comprenden las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en la presente memoria (por ejemplo, SEQ ID NOS:3, 5, 7, 9 y/u 11). La presente invención también proporciona células huésped que comprenden los vectores proporcionados en la presente memoria (por ejemplo, vectores que comprenden las secuencias de polinucleótidos de las SEQ ID NOS:3, 5, 7, 9 y/u 11).

La presente invención proporciona métodos para producir insulina libre, que comprende: i) proporcionar por lo menos una penicilina G acilasa diseñada provista en la presente e insulina que comprende grupos protectores de tri-fenil acetato A1/B1/B29; y ii) exponer la penicilina G acilasa diseñada a dicha insulina que comprende grupos protectores de acetato de tri-fenilo A1/B1/B29, en condiciones tales que dicha penicilina G acilasa modificada elimina los grupos protectores de acetato de tri-fenilo A1/B1/B29 y se produce la insulina libre. En algunas modalidades de los métodos, la penicilina G acilasa es al menos aproximadamente 85%, aproximadamente 86%, aproximadamente 87%, aproximadamente 88%, aproximadamente 89%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98%, aproximadamente el 99% o más idéntico a la SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 y/o 12. En algunas modalidades de los métodos, la penicilina G acilasa es por lo menos 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%. 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más idéntica a las SEQ ID NOS:2, 4, 6, 8, 10 y/ó 12. En algunas modalidades adicionales de los métodos, la penicilina G acilasa comprende la SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10 y/o 12. En algunas modalidades, la penicilina G acilasa diseñada produce más de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más de insulina libre. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden insulina libre producida según el (los) método (s) proporcionado (s) aquí.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

La figura 1 proporciona un gráfico que muestra la actividad de inhibición del sustrato observada con la Variante 1.

La figura 2 proporciona un gráfico que muestra la cantidad de insulina libre producida utilizando siete variantes de PGA.

La figura 3 proporciona un gráfico que muestra el % de rendimiento de insulina libre producida usando tres variantes de PGA.

La figura 4 proporciona un gráfico que muestra el % de rendimiento de insulina libre ^ΙΜΡΙ

INSTITUTO MEXICANO ^F DE LA PROPIEDAD

INDUSTRIAL producida usando tres variantes de PGA en presencia de DMSO en las reacciones.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona penicilina G acilasas diseñada (PGA) que son capaces de escindir penicilina a ácido fenilacético y ácido 6-aminopenicilánico (6-APA), que es un intermediario clave en la síntesis de una gran variedad de antibióticos β-lactámicos. En particular, la presente invención proporciona PGA diseñados que son capaces de eliminar los grupos protectores de acetato de tri-fenilo A1/B1/B29 para liberar insulina libre.

En general, los PGA naturales son enzimas heterodiméricas compuestas por una subunidad alfa y una subunidad beta. El PGA de tipo natural se sintetiza naturalmente como un polipéptido pre-pro-PGA, que contiene un péptido de señal N-terminal que media la translocación al periplasma y una región de enlace que conecta el extremo C de la subunidad alfa con el extremo N de la subunidad beta. El procesamiento proteolítico conduce a la enzima heterodimérica madura. La región del enlazador intermolecular también puede funcionar para promover el plegamiento correcto de la enzima. Los PGA descritos en este documento se basan en el PGA de Kluyvera citrophila en el que se han introducido diversas modificaciones para generar propiedades enzimáticas mejoradas como se describe en detalle a continuación.

Para las descripciones proporcionadas en este documento, el uso del singular incluye el plural (y viceversa) a menos que se indique específicamente lo contrario. Por ejemplo, las formas singulares un, una y el/la incluyen los referentes del plural a menos de que el contexto indique claramente lo contrario. De manera similar, comprenden, comprende, que comprende incluyen, incluye y que incluye son intercambiables y no pretenden ser limitantes. Se debe comprender además que en donde las descripciones de varias modalidades usan el término que comprende, los expertos en la técnica entenderán que en algunos ejemplos específicos, una modalidad se puede describir de manera alternativa al usar la frase que esencialmente consiste en o que consiste en.

Tanto la descripción general anterior, que incluye los dibujos, así como la siguiente descripción detallada son únicamente ejemplares y no son restrictivos de la descripción. Asimismo, 30 los títulos de sección utilizados en la presente son sólo para fines de organización y no deben interpretarse de manera limitante de la materia en cuestión descrita.

Definiciones

Como se usa en la presente, los siguientes términos tienen los siguientes significados:

<img file="MX381306B_D0003.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

En referencia a la presente divulgación, los términos técnicos y científicos utilizados en las descripciones de este documento tendrán los significados comúnmente entendidos por experto en la técnica a menos de que se defina específicamente de otra manera. En consecuencia, se pretende que los siguientes términos tengan los siguientes significados. Todas las patentes y publicaciones, que incluyen todas las secuencias divulgadas dentro de tales patentes y publicaciones, a las que se hace referencia aquí, se incorporan expresamente como referencia. A menos que se indique lo contrario, la práctica de la presente invención implica técnicas convencionales comúnmente usadas en biología molecular, fermentación, microbiología y campos relacionados, que son conocidos por los expertos en la técnica. A menos de que defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos utilizados en este documento tienen el mismo significado como comúnmente es entendido por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque en la práctica o en el ensayo de la presente invención se puede usar cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en la presente, se describen los métodos y materiales preferidos. De hecho, se pretende que la presente invención no se limite a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos aquí, ya que estos pueden variar, dependiendo del contexto en el que se usan. Los encabezados proporcionados en este documento no son limitaciones de los diversos aspectos o modalidades de la presente invención.

No obstante, a fin de facilitar la comprensión de la invención, una serie de términos se definen a continuación. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. Así, cada intervalo numérico descrito en la presente pretende incluir cada intervalo numérico más estrecho que cae dentro de tal intervalo numérico más amplio, como si tal intervalo numérico más estrecho estuviera expresamente escrito en la presente. También se pretende que cada limitación numérica máxima (o mínima) descrita en la presente incluya cada limitación numérica inferior (o superior), como si tales limitaciones numéricas inferiores (o superiores) estuvieran expresamente escritas en la presente.

Como se usa en la presente, el término que comprende y sus cognados son utilizados en su sentido más amplio (es decir, el equivalente a la expresión que incluye y sus correspondientes cognados).

Como se usa en toda la especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares un, una, el y la incluyen la referencia plural, a menos que el contexto lo indique claramente de otra manera. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a una célula huésped incluye una pluralidad de tales células huésped.

A menos que se indique lo contrario, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de 5' a 3'; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino a carboxilo, respectivamente.

<img file="MX381306B_D0004.tif" />

IMPI»

DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL σ&gt;

Los encabezados proporcionados en la presente no son limitaciones de los distintos aspectos o modalidades de la invención, que pueden tenerse para referencia a la solicitud como un conjunto. En consecuencia, los términos definidos a continuación se definen más completamente en su totalidad a manera de referencia a la especificación como un todo.

Como se usa en la presente, los términos proteína, polipéptido y péptido aquí se utilizan indistintamente para indicar que se trata de un polímero de por lo menos dos aminoácidos unidos covalentemente por un enlace amida, independientemente de la longitud o la modificación postraduccional (por ejemplo glucosilaclón, fosforilación, lipidación, miristilación, ubiquitinación, etc.). Se incluyen dentro de esta definición los aminoácidos D y L, y las mezclas de aminoácidos D y L.

Como se usa en este documento, polinucleótido y ácido nucleico se refieren a dos o más nucleósidos que están unidos covalentemente entre sí. El polinucleótido pueden estar completamente comprendido por ribonucleósidos (es decir., un ARN), completamente comprendido por 2' desoxirribonucleótidos (es decir, un ADN) o mezclas de ribo- y 2' desoxirribonucleósidos. Aunque los nucleósidos normalmente se unirán entre sí mediante enlaces fosfodiéster estándar, los polinudeótidos pueden incluir uno o más enlaces no estándar. El polinucleótido puede ser de una cadena o de dos cadenas, o puede incluir tanto regiones de una cadena como regiones de dos cadenas. Además, mientras que un polinucleótido se compondrá típicamente de las nucleobases codificadoras de origen natural (es decir, adenina, guanina, uracilo, timina y citosina), puede incluir una o más nucleobases modificadas y/o sintéticas (por ejemplo, inosina, xantina, hipoxantina , etc.) Preferiblemente, dichas nucleobases modificadas o sintéticas estarán codificando las nucleobases.

Como se usa en la presente, rigor de hibridación se refiere a las condiciones de hibridación, tales como condiciones de lavado, en la hibridación de los ácidos nucleicos. En general, las reacciones de hibridación son realizadas bajo condiciones de baja rigurosidad, seguidas por lavados de rigurosidad variable pero mayor. El término hibridación moderadamente rigurosa se refiere a condiciones que permiten al ADN objetivo unirse a un ácido nucleico complementario que tiene aproximadamente 60% de identidad, de preferencia aproximadamente 75% de identidad, aproximadamente 85% de identidad al ADN objetivo, con más del 90% de identidad con el polinucleótido diana. Las condiciones moderadamente rigurosas ejemplares son condiciones equivalentes a la hibridación en 50% de formamida, 5x solución de Denhart, 5xSSPE, 0.2 % de SDS a 42 °C, seguido por lavado en 0.2xSSPE, 0.2 de SDS a 42 °C. Hibridación muy rigurosa se refiere en general a las condiciones que son de aproximadamente 10 °C o menos, de la temperatura de fusión térmica Tm según lo determinado bajo la condición de solución para una secuencia definida de polinudeótidos. En algunas modalidades, una condición muy rigurosa se refiere a las condiciones que permiten la hibridación de sólo esas secuencias de ácidos nucleicos que forman híbridos estables

<img file="MX381306B_D0005.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL en 0.018M de NaCI a 65 °C (es decir, si un híbrido no es estable en 0.018M de NaCI a 65 °C, no será estable en condiciones muy rigurosas, según se contempla en la presente). Las condiciones muy rigurosas pueden ser proporcionadas, por ejemplo, por hibridación en condiciones equivalentes a 50% de formamida, 5x de solución de Denhart, 5xSSPE, 0.2% de SDS a 42°C, seguido por lavado en O.lxSSPE, y 0.1% de SDS a 65°C. Otra condición muy rigurosa es la hibridación en condiciones equivalente a hibridar en 5X SSC que contiene 0.1% (p:v) de SDS a 65°C y lavado en O.lx SSC que contiene 0.1% SDS a 65°C. Otras condiciones de hibridación muy rigurosas, así como condiciones moderadamente rigurosas, se describen en las referencias citadas arriba.

Como se usa en la presente, secuencia codificadora se refiere a esa porción de un ácido nucleico (por ejemplo un gen) que codifica una secuencia de aminoácidos de una proteína.

Como se usa en la presente, codón optimizado se refiere a cambios en los codones del polinucleótido que codifica una proteína a los utilizados preferiblemente en un organismo particular de tal manera que la proteína codificada se expresa eficientemente en el organismo de interés. En algunas modalidades, los polinudeótidos que codifican las enzimas de PAG son optimizadas en codón para la producción óptima del organismo huésped seleccionado para la expresión. Aunque el código genético se degenera, en esa mayoría de aminoácidos se representan por varios codones, llamados codones sinónimos, es bien sabido que el uso del codón por organismos particulares no es aleatorio y se desvía hacia tripletes particulares de codón. Esta desviación de uso del codón puede ser mayor con referencia a un gen dado, genes de función común o de origen ancestral, proteínas altamente expresadas contra proteínas de bajo número de copias, y la proteína agregada que codifica las regiones de un genoma de organismo. En algunas modalidades, los polinudeótidos que codifican las enzimas de PAG pueden ser optimizadas en codón para la producción óptima del organismo huésped seleccionado para la expresión.

Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, los codones de desviación de alto uso de codones preferido y óptimo se refieren indistintamente a los codones que se usan con mayor frecuencia en las regiones de codificación de la proteína que otros codones que codifican el mismo aminoácido. Los codones preferidos pueden determinarse en relación con el uso de codones en un solo gen, un conjunto de genes de función u origen común, genes altamente expresados, la frecuencia de codones en las regiones codificadoras de proteínas agregadas de todo el organismo, la frecuencia de codones en la proteína agregada regiones codificadoras de organismos relacionados, o combinaciones de los mismos. Los codones cuya frecuencia aumenta con el nivel de expresión génica típicamente son codones óptimos para la expresión. Se conoce una variedad de métodos para determinar la frecuencia del codón (por ejemplo , el uso del codón, el uso relativo del codón sinónimo) y la preferencia del codón en organismos específicos, incluido el análisis multivariado, por ejemplo, usando análisis de conglomerados o análisis de correspondencia y el número efectivo de

<img file="MX381306B_D0006.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL codones utilizados en un gen (véase, por ejemplo, GCG CodonPreference, Genetics Computer Group Wisconsin Package; CodonW, John Peden, University of Nottingham; Mclnerney, Bioinform., 14: 372-73 [1998]; Stenico et al., Nucleic Acids Res., 222 : 437-46 [1994] y Wright, Gene 87: 23-29 [1990]). Los cuadros de uso de codones están disponibles para una lista creciente de organismos (ver, por ejemplo, Wada et al., Nucleic Acids Res., 20: 2111-2118 [1992]; Nakamura et al., Nucí. Acids Res., 28:292 [2000]; Duret, et al., supra; Henaut and Danchin, Escherichia coli and Salmonella, Neidhardt, et al. (eds.), ASM Press, Washington D.C., [1996], p. 2047-2066. La fuente de datos para obtener el uso de codones puede depender de cualquier secuencia de nucleótidos disponible capaz de codificar una proteína. Estos conjuntos de datos incluyen secuencias de ácidos nucleicos realmente conocidas para codificar proteínas expresadas (por ejemplo , secuencias de codificación de proteínas completas-CDS), etiquetas de secuencias expresadas (ESTS) o regiones de codificación predichas de secuencias genómicas (Véase por ejemplo, Uberbacher, Meth. Enzymol., 266:259-281 [1996]; Tiwari et al., Comput. Appl. Biosci., 13:263-270 [1997]).

Como se usa en la presente, secuencia de control se define para incluir todos los componentes, que son necesarios o ventajosos para la expresión de un polinucleótido y/o polipéptido de la presente revelación. Cada secuencia de control puede ser nativa o extraña al polinucleótido de interés. Tales secuencias de control incluyen, pero no se limitan a un líder, secuencia de poliadenilación, secuencia propéptida, promotor, secuencia de péptidos de señal y terminador de transcripción.

Como se usa en la presente, operativamente enlazado se define en la presente como una configuración en la que la secuencia de control es colocada adecuadamente (es decir, en una relación funcional) en una posición con respecto a un polinucleótido de interés de manera que la secuencia de control dirige o regula la expresión del polinucleótido y/o polipéptido de interés.

Como se usa en la presente, secuencia promotora se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos que es reconocida por una célula huésped para la expresión de un polinucleótido de interés, tal como una secuencia codificadora. La secuencia de control puede comprender una secuencia promotora apropiada. La secuencia promotora contiene secuencias de control transcripcional que median la expresión de un polinucleótido de interés. El promotor puede ser cualquier secuencia de ácidos nucleicos que muestra actividad transcripcional de la célula huésped de elección incluyendo promotores mutantes, truncados, e híbridos, y puede obtenerse de los genes que codifican los polipéptidos extracelulares o intracelulares ya sea homólogos o heterólogos a la célula huésped.

Como se usa en la presente, natural o tipo silvestre se refiere a la forma encontrada en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptidos o polinucleótidos de tipo silvestre o natural es una secuencia presente en un organismo que puede ser aislado de una fuente

<img file="MX381306B_D0007.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL en la naturaleza y que no ha sido intencionalmente modificado por manipulación humana.

Tal como se usa en este documento, que se produce de forma no natural, diseñado y recombinante cuando se usan en la presente descripción con referencia a (por ejemplo, una célula, ácido nucleico o polipéptido) se refiere a un material o un material correspondiente a la forma natural o nativa del material, que se ha modificado de una manera que de otro modo no existiría en la naturaleza. En algunas modalidades, el material es idéntico al material natural, pero se produce o se deriva de materiales sintéticos y/o mediante manipulación usando técnicas recombinantes. Los ejemplos no limitantes incluyen, entre otros, células recombinantes que expresan genes que no se encuentran dentro de la forma nativa (no recombinante) de la célula o expresan genes nativos que de otro modo se expresan a un nivel diferente.

Como se usa en la presente, por ciento de identidad de secuencia, identidad porcentual y por ciento idéntico se refiere a las comparaciones entre secuencias de polinucleótidos o polipéptidos, y se determinan al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, vacíos) en comparación con la secuencia de referencia para una alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje puede ser calculado determinando el número de posiciones en las que existe la misma base de ácido nucleico o residuo de aminoácidos en ambas secuencias o una base de ácido nucleico o residuo de aminoácido es alineado con un espacio para producir el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la ventana de comparación y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de la identidad de secuencia. La determinación del alineación óptima y el porcentaje de identidad de secuencia se realiza utilizando los algoritmos BLAST y BLAST 2.0 (Véase, por ejemplo., Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 [1990]; and Altschul et al., Nucí. Acids Res. 3389-3402 [1977]). El software para realizar el análisis BLAST está a disposición del público a través de la página web del Centro Nacional de Información de Biotecnología.

En resumen, el análisis BLAST implica primero identificar los pares de secuencia de alta puntuación (HSP) al identificar palabras de corta longitud Win en la secuencia de consulta, que ya sea coincide o satisface alguna puntuación de umbral de valor positivo T cuando se alinea con una palabra de la misma longitud en una secuencia de base de datos. T es denominado como el umbral de puntuación de la palabra vecina (Véase, Altschul et al, supra). Estos aciertos de la palabra vecina inicial actúan como semillas para inicial las búsquedas para encontrar HSPs más largos que las contengan. Los aciertos de la palabra entonces se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia por tanto que la puntuación acumulativa de la alineación pueda incrementarse. Las

<img file="MX381306B_D0008.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL puntuaciones acumulativas son calculadas usando, para las secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de premio para un par de residuos coincidentes; siempre &gt;0) y N (puntuación de penalización para los residuos mal apareados; siempre &lt;0). Para las secuencias de aminoácidos, sé usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de los aciertos de la palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de la alineación acumulada cae por la cantidad X de su máximo valor alcanzado; la puntuación acumulativa se va a cero o debajo, debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T, y X determinan la sensibilidad y la velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para las secuencias de nucleótidos) usa como predeterminada una longitud de palabra de (W) de 11, una expectativa (E) de 10, M=5, N=-4, y una comparación de ambas cadenas. Para las secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como predeterminada una longitud de palabra (W) de 3, una expectativa (E) de 10, y la matriz de puntuación BLOSUM62 (Véase por ejemplo, Henikoff y Henlkoff, Proc Nati Acad Sci USA 89:10915 [1989]).

Numerosos otros algoritmos están disponibles y son conocidos en la técnica que funcionan de forma similar a BLAST para proporcionar identidad porcentual para dos secuencias. La alineación óptima de las secuencias para la comparación puede llevarse a cabo utilizando cualquier método adecuado conocido en la técnica (por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 [1981]; por el algoritmo de alineación de homología de Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 [1970]; mediante la investigación del método de similitud de Pearson and Lipman, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444 [1988]), y/o por implemenacipnes computarizadas de esos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA, y TFASTA en el paquete de software de GCG Wisconsin), o por inspección visual, como se sabe en la técnica. Adicionalmente, la determinación ejemplar de la alineación de secuencia y porcentaje de identidad de secuencia puede emplear los programas BESTFIT o GAP en el paquete de software GCG Wisconsin (Accelrys, Madison WI), usando los parámetros predeterminados proporcionados.

Tal como se usa en el presente documento, la Identidad sustancial se refiere a una secuencia de polinucleótidos o polipéptidos que tiene una identidad de secuencia de al menos 80 por ciento, identidad de secuencia de al menos 85 por ciento y identidad de secuencia de 89 a 95 por ciento, más comúnmente una identidad de secuencia de 99 por ciento en comparación con una secuencia de referencia sobre una ventana de comparación de al menos 20 posiciones de residuos, con frecuencia sobre una ventana de al menos 30-50 residuos, en donde el porcentaje de identidad de secuencia se calcula comparando la secuencia de referencia con una secuencia que incluye deleciones o adiciones que totalizan 20 por ciento o menos de la secuencia de referencia en la ventana de comparación. En modalidades específicas aplicadas a los polipéptidos, el término

<img file="MX381306B_D0009.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL identidad sustancial significa que dos secuencias de polipéptidos, cuando están alineadas de manera óptima, tal como por los programas GAP o BESTFIT usando pesos de separación predeterminada, comparten al menos 80 por ciento de identidad de secuencia, preferiblemente al menos 89 por ciento de secuencia identidad, al menos 95 por ciento de identidad de secuencia o más (por ejemplo, identidad de secuencia del 99 por ciento). En algunas modalidades preferidas, las posiciones de residuos que no son idénticas se diferencian por sustituciones de aminoácido conservadores.

Como se usa en este documento, secuencia de referencia se refiere a una secuencia definida con la que se compara otra secuencia. Una secuencia de referencia puede ser un subconjunto de una secuencia más larga, por ejemplo, un segmento de un gen de longitud completa o secuencia de polipéptidos. En general, una secuencia de referencia es por lo menos 20 residuos de nucleótidos o aminoácidos de longitud, por lo menos 25 residuos de longitud, por lo menos 50 residuos de longitud, o la longitud completa del ácido nucleico o polipéptido. Ya que dos polinucleótidos o polipéptidos pueden cada uno (1) comprender una secuencia (es decir, una porción de la secuencia completa) que es similar entre las dos secuencias, y (2) puede comprender además una secuencia que es divergente entre las dos secuencias, las comparaciones de secuencias entre dos (o más) polinucleótidos o polipéptidos se realizan normalmente al comparar secuencias de los dos polinucleótidos o polipéptidos en una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. El término secuencia de referencia no pretende estar limitado a secuencias de tipo silvestre, y puede incluir secuencias modificadas o alteradas. Por ejemplo, en algunas modalidades, una secuencia de referencia puede ser una secuencia de aminoácidos alterada o modificada previamente.

Como se usa en la presente, ventana de comparación se refiere a un segmento conceptual de por lo menos aproximadamente 20 posiciones contiguas de nucleótidos o residuos de aminoácidos en donde una secuencia puede ser comparada con una secuencia de referencia de por lo menos 20 nucleótidos o aminoácidos contiguos y en donde la porción de la secuencia en la ventana de comparación puede comprender adiciones o deleciones (es decir, espacios) de 20 por ciento o menor en comparación con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o deleciones) para una alineación óptima de las dos secuencias. La ventana de comparación puede ser más larga que 20 residuos contiguos, e incluye, opcionalmente 30, 40, 50, 100, o una ventana más larga.

Como se usa en la presente, corresponde a, referencia a, y con respecto a cuando se usa en el contexto de la numeración de una secuencia dada de aminoácidos o polinucleótidos se refiere a la numeración de los residuos de una secuencia de referencia especificada cuando la secuencia dada de aminoácidos o polinucleótidos es comparada con la

<img file="MX381306B_D0010.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL secuencia de referencia. En otras palabras, el número del residuo o la posición del residuo de un polímero es designado con respecto a la secuencia de referencia más que a la posición numérica actual del residuo dentro de la secuencia dada de aminoácidos o polinucleótidos. Por ejemplo, una secuencia dada de aminoácidos, tal como esa de una PGA diseñada, puede ser alineada a una secuencia de referencia mediante la introducción de espacios para optimizar la coincidencia de residuos entre las dos secuencias. En estos casos, aunque los espacios están presentes, la numeración del residuo en la secuencia dada de aminoácidos o polinucleótidos es formada con respecto a la secuencia de referencia a la cual se ha alienado. Tal como se usa en la presente memoria, una referencia a una posición de residuo, tal como Xn como se describe más abajo, debe interpretarse como que se refiere a un residuo que corresponde a, a menos que se indique específicamente lo contrario. Así, por ejemplo, X94 se refiere a cualquier aminoácido en la posición 94 en una secuencia de polipéptidos.

Como se usa en este documento, propiedad de enzima mejorada se refiere a un PGA que muestra una mejora en cualquier propiedad enzimática en comparación con un PGA de referencia. Para los polipéptidos de PGA modificados por ingeniería genética descritos en la presente memoria, la comparación se realiza generalmente con la enzima de PGA de tipo silvestre, aunque en algunas modalidades, el PGA de referencia puede ser otro PGA de ingeniería mejorado. Las propiedades enzimáticas para las que es deseable la mejora incluyen, pero no se limitan a, actividad enzimática (que se puede expresar en términos de porcentaje de conversión del sustrato a un tiempo de reacción especificado usando una cantidad específica de PGA), estabilidad térmica, estabilidad de disolvente, perfil de actividad de pH, requisitos de cofactor, refractariedad a los inhibidores (por ejemplo, inhibición del producto), estereoespecificidad y estereoselectividad (incluida enantioselectividad).

Como se usa en la presente, actividad enzimática aumentada se refieren a la propiedad mejorada de los polipéptidos de PGA diseñados, que pueden estar representados por un aumento en la actividad específica (por ejemplo, producto producido/tiempo/peso de la proteína) o un incremento en el por ciento de conversión del sustrato al producto (por ejemplo, el por ciento de conversión de la cantidad de partida del sustrato al producto en un periodo especificado con una cantidad especificada de PGA) en comparación con la enzima de PGA de referencia. Métodos ejemplares para determinar la actividad enzimática son proporcionados en los Ejemplos. Cualquier propiedad relacionada con la actividad enzimática puede verse afectada, incluyendo las propiedades enzimáticas clásicas de cambios Km, Vmax o kcat, los cuales pueden llevar a una actividad enzimática aumentada. Las mejoras en la actividad enzimática pueden ser de aproximadamente 1.5 veces la actividad enzimática de la correspondiente enzima PGA de tipo silvestre, hasta 2 veces. 5 veces, 10 veces, 20 veces, 25 veces, 50 veces, 75 veces, 100 veces, o más de actividad enzimática

<img file="MX381306B_D0011.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL que el PGA natural u otro PGA modificado por ingeniería genética a partir del cual se derivaron los polipéptidos de PGA. En modalidades específicas, la enzima de PGA diseñada exhibe mayor actividad enzimática en el intervalo de 1.5 a 50 veces, 1.5 a 100 veces más que esa de la enzima de PGA original. El experto en la materia entiende que la actividad de cualquier enzima está limitada por la difusión de manera que la velocidad de recambio catalítico no puede exceder la velocidad de difusión del sustrato, incluidos los cofactores requeridos. El máximo teórico del límite de difusión o kcat/Km, es generalmente alrededor de 108 a 109 (M-l s-1). Por lo tanto, cualquier mejora en la actividad enzimática del PGA tendrá un límite superior relacionado con la velocidad de difusión de los sustratos en los que actúa la enzima de PGA. La actividad de PGA se puede medir mediante cualquiera de los ensayos estándar usados para medir la liberación de ácido fenilacético tras la escisión de penicilina G, tal como mediante titulación (véase por ejemplo, Simons y Gibson, Biotechnol. Tech., 13:365-367 [1999]). En algunas modalidades, la actividad de PGA se puede medir usando ácido 6-nitrofenilacetamido benzoico (NIPAB), cuyo producto de escisión ácido 5amino-2-nitro-benzoico es espectrofotométricamente detectable (Amáx = 405 nm). Las comparaciones de las actividades enzimáticas se hacen usando una preparación definida de enzima, un ensayo definido bajo un conjunto de condiciones, y uno o más sustratos definidos, como se describe después a detalle en la presente. En general, cuando los lisados se comparan, los números de células y la cantidad de la proteína ensayada son determinados así como el uso de los sistemas de expresión idénticos y células huésped idénticas, para minimizar las variaciones en la cantidad de la enzima producida por las células huésped y presente en los lisados.

Como se usa en la presente, actividad enzimática aumentada y actividad aumentada se refieren a la propiedad mejorada de una enzima diseñada, que puede representarse por medio de un aumento en la actividad específica (por ejemplo, producto producido/tiempo/peso de la proteína) o un incremento en el la por ciento de conversión del substrato al producto (por ejemplo, por ciento de conversión de la cantidad de partida del sustrato al producto en un tiempo especificado con una cantidad especificada de PGA) en comparación con la enzima de referencia como se describe en la presente. Cualquier propiedad relacionada con la actividad de la enzima puede verse afectada, incluyendo las propiedades clásicas de la enzima de Km, Vmáx o kcat, cuyos cambios pueden conducir a una actividad enzimática aumentada. En algunas modalidades, las enzimas de PGA proporcionadas en este documento liberan insulina eliminando grupos protectores de acetato de tri-fenilo de residuos específicos de insulina. Las comparaciones de las actividades enzimáticas se hacen usando una preparación definida de enzima, un ensayo definido bajo un conjunto de condiciones, y uno o más sustratos definidos, como se describe después a detalle en la presente. En general, cuando las enzimas se comparan, los números de células y la cantidad de la proteína ensayada son determinados así como el uso de los sistemas de expresión idénticos y células

<img file="MX381306B_D0012.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL huésped idénticas, para minimizar las variaciones en la cantidad de la enzima producida por las células huésped y presente en los lisados.

Como se usa en este documento, conversión se refiere a la transformación enzimática de un sustrato en el producto correspondiente.

Como se usa en la presente, por ciento de conversión se refiere al porcentaje del sustrato que se convierte al producto dentro de un tiempo en las condiciones establecidas. Así, por ejemplo, la actividad enzimática o actividad de un polipéptido de PGA puede ser expresada como por ciento de conversión del sustrato al producto.

Como se usa en este documento, quimioselectividad se refiere a la formación preferencia! en una reacción química o enzimática de un producto sobre otro.

Tal como se usa en este documento, termoestable y estable térmicamente se usan indistintamente para referirse a un polipéptido que es resistente a la inactivación cuando se expone a un conjunto de condiciones de temperatura (por ejemplo, 40-80 °C) durante un tiempo (por ejemplo, 0.5-24 horas) en comparación con la enzima no tratada, reteniendo así un cierto nivel de actividad residual (por ejemplo, más del 60% al 80%) después de la exposición a temperaturas elevadas.

Tal como se usa en este documento, disolvente estable se refiere a la capacidad de un polipéptido para mantener una actividad similar (por ejemplo, más de, por ejemplo, 60% a 80%) después de la exposición a concentraciones variables (por ejemplo, 5-99%) de disolvente (por ejemplo, alcohol isopropílico, tetrahidrofurano, 2-metiltetrahidrofurano, acetona, tolueno, acetato de butilo, metil ter-butiléter, etc.) durante un tiempo (por ejemplo, 0.5-24 horas) en comparación con la enzima no tratada.

Como se usa en la presente, pH estable se refiere a un polipéptido de PGA que mantiene actividad similar (por ejemplo, más de 60% a 80%) después de la exposición a pH alto o bajo (por ejemplo, 4.5-6 o 8 a 12) por un tiempo (por ejemplo, 0.5-24 hr) en comparación con la enzima no tratada.

Tal como se usa en este documento, termo y solvente estable se refiere a un polipéptido de PGA que es termoestable y estable a los solventes.

Como se usa en la presente, aminoácido o residuo hidrófilo se refiere a un aminoácido o residuo que tiene una cadena lateral que exhibe una hidrofobicidad de menor de cero de acuerdo con la escala de hidrofobicidad de consenso normalizada de Eisenberg et al., (Eisenberg et al., 1 Mol. Biol., 179:125-142 [1984]). Los aminoácidos hidrófilos codificados genéticamente incluyen L-Thr (T), LSer (S), LHis (H), LGlu (E), LAsn (N), LGIn (Q), LAsp (D), LLys (K) y LArg (R).

Tal como se usa en este documento, aminoácido ácido o residuo ácido se refiere a un aminoácido o residuo hidrófilo que tiene una cadena lateral que presenta un valor de pK de

<img file="MX381306B_D0013.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL menos de aproximadamente 6 cuando el aminoácido se incluye en un péptido o polipéptido. Los aminoácidos ácidos típicamente tienen cadenas laterales cargadas negativamente a pH fisiológico debido a la pérdida de un ion hidrógeno. Los aminoácidos ácidos codificados genéticamente incluyen LGlu (E) y LAsp (D).

Tal como se usa en este documento, aminoácido ácido o residuo básico se refiere a un aminoácido o residuo hidrófilo que tiene una cadena lateral que presenta un valor de pK de menos de aproximadamente 6 cuando el aminoácido se incluye en un péptido o polipéptido. Los aminoácidos básicos típicamente tienen cadenas laterales cargadas positivamente a pH fisiológico debido a la asociación con ión hidronio. Los aminoácidos básicos codificados genéticamente incluyen LArg (R) y LLys (K).

Como se usa en el presente documento, aminoácido o residuo polar se refiere a un aminoácido o residuo hidrófilo que tiene una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico, pero que tiene al menos un enlace en el que el par de electrones compartido en común por dos átomos es sostenido más de cerca por uno de los átomos. Los aminoácidos polares genéticamente codificados incluyen LAsn (N), LGIn (Q), LSer (S) y LThr (T).

Tal como se usa en este documento, aminoácido o residuo hidrófobo se refiere a un aminoácido o residuo que tiene una cadena lateral que exhibe una hidrofobicidad mayor que cero de acuerdo con la escala de hidrofobicidad consenso normalizada de Eisenberg et al. (Eisenberg et al., J. Mol. Biol., 179:125-142 [1984]). Los aminoácidos hidrófobos genéticamente codificados incluyen LPro (P), Ule (I), LPhe (F), LVal (V), LLeu (L), LTrp (W), LMet (M), LAIa (A) y LTyr (Y).

Tal como se usa en este documento, aminoácido o residuo aromático se refiere a un aminoácido o residuo hidrófilo o hidrófobo que tiene una cadena lateral que incluye al menos un anillo aromático o heteroaromático. Los aminoácidos aromáticos genéticamente codificados incluyen LPhe (F), LTyr (Y) y LTrp (W). Aunque debido al pKa de su átomo de nitrógeno heteroaromático LHis (H) a veces se clasifica como un residuo básico, o como un residuo aromático ya que su cadena lateral incluye un anillo heteroaromático, en este documento la histidina se clasifica como un residuo hidrófilo o como un residuo restringido(ver más abajo).

Como se usa en este documento, aminoácido o residuo restringido se refiere a un aminoácido o residuo que tiene una geometría restringida. Aquí, los residuos restringidos incluyen LPro (P) y LHis (H). La histidina tiene una geometría restringida porque tiene un anillo de imidazol relativamente pequeño. Prolina tiene una geometría restringida porque también tiene un anillo de cinco miembros.

Como se usa en el presente documento, aminoácido o residuo no polar se refiere a un aminoácido o residuo hidrófobo que tiene una cadena lateral que no está cargada a pH fisiológico y que tiene enlaces en los que generalmente se mantiene el par de electrones compartidos en

<img file="MX381306B_D0014.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL común por dos átomos igualmente por cada uno de los dos átomos (es decir, la cadena lateral no es polar). Los aminoácidos no polares codificados genéticamente incluyen LGIy (G), LLeu (L), LVal (V), Ule (I), LMet (M) y LAIa (A).

Como se usa en este documento, aminoácido o residuo alifático se refiere a un aminoácido o residuo hidrófobo que tiene una cadena lateral de hidrocarburo alifático. Los aminoácidos alifáticos codificados genéticamente incluyen LAIa (A), LVal (V), LLeu (L) y Ule (I).

Se observa que la cisteína (o LCys o [C]) es inusual en el sentido de que puede formar puentes de disulfuro con otros aminoácidos de LCys (C) u otros aminoácidos sulfanilos o sulfhidrilos. Los residuos de tipo cisteína incluyen cisteína y otros aminoácidos que contienen restos de sulfhidrilo que están disponibles para la formación de puentes de disulfuro. La capacidad de LCys (C) (y otros aminoácidos con SH que contienen cadenas laterales) para existir en un péptido, ya sea en la forma de SH libre reducida o en forma de puente disulfuro oxidado, afecta si LCys (C) contribuye al carácter hidrófobo o hidrófilo neto de un péptido. Aunque LCys (C) exhibe una hidrofobicidad de 0.29 de acuerdo con la escala de consenso normalizada de Eisenberg (Eisenberg et al., 1984, supra), debe entenderse que a los fines de la presente descripción, LCys (C) se clasifica en su propio grupo único.

Tal como se usa en este documento, aminoácido o residuo pequeño se refiere a un aminoácido o residuo que tiene una cadena lateral que está compuesta de un total de tres o menos carbonos y/o heteroátomos (excluyendo el acarbono e hidrógenos). Los aminoácidos o residuos pequeños pueden clasificarse adicionalmente como aminoácidos o residuos alifáticos, no polares, polares o ácidos, de acuerdo con las definiciones anteriores. Los aminoácidos pequeños codificados genéticamente incluyen LAIa (A), LVal (V), LCys (C), LAsn (N), LSer (S), LThr (T) y LAsp (D).

Como se usa en este documento, aminoácido o residuo que contiene hidroxilo se refiere a un aminoácido que tiene una porción hidroxilo (-OH). Los aminoácidos que contienen hidroxilo codificados genéticamente incluyen LSer (S) LThr (T) y L-Tyr (Y).

Como se usa en la presente, diferencia de aminoácidos y diferencia de residuos se refiere a una diferencia en los residuos de aminoácidos en una posición de una secuencia de polipéptidos con respecto al residuo de aminoácido en una posición correspondiente en una secuencia de referencia. Las posiciones de las diferencias de aminoácidos en general se denominan en la presente como Xn, donde n se refiere a la correspondiente posición en la secuencia de referencia en la que se basa la diferencia del residuo. Por ejemplo, una diferencia de residuo en la posición X40 en comparación con SEQ ID NO:2 se refiere a una diferencia del residuo de aminoácido en la posición del polipéptido que corresponde a la posición 40 de SEQ ID NO:2. Así, si el polipéptido de referencia de SEQ ID NO: 2 tiene una histidina en la posición 40, entonces una diferencia de residuo en la posición X40 en comparación con SEQ ID NO:2 se refiere a una

<img file="MX381306B_D0015.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL sustitución de aminoácido de cualquier residuo diferente de histidina en la posición del polipéptido que corresponde a la posición 40 de SEQ ID NO:2. En la mayoría de los casos en la presente, la diferencia específica del residuo de aminoácido en una posición es indicada como XnY donde Xn especifica la posición correspondiente como se describe anteriormente y Y es el identificador de única letra del aminoácido encontrado en el polipéptido diseñado (es decir, el residuo diferente del polipéptido de referencia). En algunos casos, la presente revelación también proporciona diferencias específicas de aminoácidos denotadas por la notación convencional AnB, donde A es el identificador de única letra del residuo en la secuencia de referencia, n es el número de la posición del residuo en la secuencia de referencia, y B es el identificador de única letra de la sustitución del residuo en la secuencia del polipéptido diseñado. En algunos casos, un polipéptido de la presente revelación puede incluir una o más diferencias de residuos de aminoácidos con respecto a una secuencia de referencia, lo que se indica por una lista de las posiciones especificadas donde las diferencias de los residuos están presentes con respecto a la secuencia de referencia. En algunas modalidades, donde pueden usarse más de un aminoácido en una posición de residuo específica de un polipéptido, los diversos residuos de aminoácidos que pueden ser usados se separan por una / (por ejemplo, X192A/G). La presente revelación incluye secuencias de polipéptido diseñado que comprenden una o más diferencias de aminoácidos que incluyen cualquiera/o ambas de sustituciones de aminoácidos conservadoras y no conservadoras. Las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de anhidrasa carbónica recombinante específicos incluidos en el Listado de Secuencias de la presente descripción incluyen un residuo de metionina (M) iniciador (es decir, M representa la posición de residuo 1). Sin embargo, el experto en la materia entiende que este residuo de metionina iniciador puede eliminarse mediante maquinaria de procesamiento biológico, tal como en una célula huésped o sistema de traducción in vitro, para generar una proteína madura que carezca del residuo iniciador de metionina, pero retenga las propiedades de la enzima. En consecuencia, el término diferencia de residuo de aminoácido con relación a SEQ ID NO: 2 en la posición Xn tal como se usa aquí puede referirse a la posición Xn oa la posición correspondiente (por ejemplo, posición (X-l)n) en una secuencia de referencia que se ha procesado para que carezca de la metionina de partida.

Como se utiliza en la presente, sustituciones de aminoácido conservadores se refiere a una intercambiabilidad de residuos que tiene una cadena lateral similar, y entonces normalmente implica la sustitución del aminoácido en el polipéptido con aminoácidos dentro de la misma clase o similar definida de aminoácidos. A manera de ejemplo y no de limitación, en algunas modalidades, un aminoácido con una cadena lateral alifática puede ser sustituido con otro aminoácido alifático (por ejemplo, alanina, valina, leucina, e isoleucina); un aminoácido con cadena secundaria de hidroxilo es sustituida con otro aminoácido con una cadena secundaria de hidroxilo

<img file="MX381306B_D0016.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL (por ejemplo, serina y treonina); un aminoácido que tiene cadenas secundarias aromáticas es sustituido con otro aminoácido que tiene una cadena secundaria aromática (por ejemplo, fenilalanina, tirosina, triptófano, e histidina); un aminoácido con una cadena secundaria básica es sustituido con otro aminoácido con una cadena secundaria básica (por ejemplo, Usina y arginina); un aminoácido con una cadena secundaria ácida es sustituido con otro aminoácido con una cadena secundaria ácida (por ejemplo, ácido aspártico o ácido glutámico); y/o un aminoácido hidrófobo o hidrófilo es reemplazado con otro aminoácido hidrófobo o hidrófilo, respectivamente. Las sustituciones conservadoras ejemplares se establecen en el Cuadro 1.

CUADRO 1

Sustituciones de aminoácidos conservadoras ejemplares

<td> Residuo</td><td> Posibles sustituciones conservadoras</td>

<td> A, L, V, I</td><td> Otros alifáticos (A, L, V, I) Otros no polares (A, L, V, I, G, M)</td>

<td> G, M</td><td> Otros no polares (A, L, V, I, G, M)</td>

<td> D, E</td><td> Otros ácidos (D, E)</td>

<td> K, R</td><td> Otros básicos (K, R)</td>

<td> N, Q, S, T</td><td> Otros polares</td>

<td> H, Y, W, F</td><td> Otros aromáticos (H, Y, W, F)</td>

<td> C, P</td><td> No polares</td>

Como se usa en la presente, la frase sustitución no conservadora se refiere a la sustitución de un aminoácido en el polipéptido con un aminoácido con propiedades de cadena secundaria apreciablemente diferentes. Las sustituciones no conservadoras pueden usar aminoácidos entre los grupos definidos, y no dentro de ellos, y afectan (a) la estructura de la estructura principal del péptido en el área de la sustitución (por ejemplo., prollna para glicina) (b) la carga o hidrofobicidad o (c) el lote de la cadena secundaria. A manera de ejemplo y no de limitación, una sustitución no conservadora puede ser un aminoácido ácido sustituido con un aminoácido básico o alifático; un sustituyente de aminoácidos aromáticos con un aminoácido pequeño; y un aminoácidos aromático sustituido con un aminoácido pequeño; y un aminoácidos hidrófilo sustituido con un aminoácido hidrófobo.

Como se usa en la presente, deleción se refiere a la modificación del polipéptido por remoción de uno o más aminoácidos del polipéptido de referencia. Las deleciones pueden comprender la remoción de 1 o más aminoácidos, 2 o más aminoácidos, 5 o más aminoácidos, 10 o más aminoácidos, 15 o más aminoácidos, o 20 o más aminoácidos, hasta 10% del número total de aminoácidos, o hasta 20% del número total de aminoácidos formando el polipéptido mientras retiene la actividad enzimática y/o retiene las propiedades mejoradas de una enzima diseñada. Las

IMPI

INSTITUTO MEXICANO W * DE LA PROPIEDAD

INDUSTRIAL deleciones pueden ser dirigidas a las partes internas y/o partes terminales del polipéptido. En varias modalidades, la deleción puede comprender un segmento continuo o puede ser discontinuo.

Como se usa en la presente, inserción se refiere a la modificación del polipéptido por adicional de uno o más aminoácidos del polipéptido de referencia. En algunas modalidades, las enzimas de PGA modificadas mejoradas comprenden inserciones de uno o más aminoácidos para el polipéptido de PGA que se produce de manera natural, así como inserciones de uno o más aminoácidos para los polipéptidos de PGA diseñados. Las inserciones pueden estar en las partes internas del polipéptido, o al extremo carboxi o amino. Las inserciones como se usan en la presente incluyen proteínas de fusión como es sabido en la técnica. La inserción puede ser un segmento contiguo de aminoácidos o separado por uno o más de los aminoácidos en el polipéptido natural.

El término conjunto de sustitución de aminoácidos y conjunto de sustitución se refiere a un grupo de sustituciones de aminoácidos dentro de una secuencia de polipéptidos, en comparación con una secuencia de referencia. Un conjunto de sustitución puede tener 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12,13, 14, 15, o más sustituciones de aminoácidos. En algunas modalidades, un conjunto de sustitución se refiere al conjunto de sustituciones de aminoácidos que está presente en cualquiera de los PGA variantes mencionados en los cuadros provistos en los ejemplos.

Como se usa en este documento, fragmento se refiere a un polipéptido que tiene una deleción amino-terminal y/o carboxiterminal, pero donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia. Los fragmentos pueden tener típicamente aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 98% o aproximadamente el 99% del polipéptido de PGA de longitud completa, por ejemplo, el polipéptido de la SEQ ID NO:2. En algunas modalidades, el fragmento es biológicamente activo (es decir, exhibe la misma actividad enzimática que la secuencia de longitud completa).

Como se usa en la presente, el polipéptido aislado se refiere a un polipéptido que es sustancialmente separado de otros contaminantes que lo acompañan naturalmente, por ejemplo, proteínas, lípidos, y polinucleótidos. El término abarca polipéptidos que han sido removidos o purificados de su ambiente o sistema de expresión natural (por ejemplo, célula huésped o síntesis in vitro). Las enzimas de PGA mejoradas pueden estar presentes en una célula, presentes en el medio celular, o preparadas de varias formas, tales como lisados o preparaciones aislados. Como tal, en algunas modalidades, los polipéptidos de PGA modificados genéticamente de la presente descripción pueden ser un polipéptido aislado.

Como se utiliza en la presente, polipéptido sustancialmente puro se refiere a una composición en la que la especie de polipéptido es la especie predominante presente (es decir, en una base molar o en peso es más abundante que cualquier otra especie individual macromolecular

<img file="MX381306B_D0017.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL en la composición), y es en general una composición sustancialmente purificada cuando la especie objeto comprende por lo menos aproximadamente 50 por ciento de las especies macromoleculares presentes por mol o % en peso. Generalmente, una composición de polipéptido de PGA modificada sustancialmente pura comprende aproximadamente el 60% o más, aproximadamente el 70% o más, aproximadamente el 80% o más, aproximadamente el 90% o más, aproximadamente 91% o más, aproximadamente 92% o más, aproximadamente 93% o más, aproximadamente 94% o más, aproximadamente 95% o más, aproximadamente 96% o más, aproximadamente 97% o más, aproximadamente 98% o más, o aproximadamente 99% de todas las especies macromoleculares por moles o % en peso presente en la composición. Las especies de solvente, moléculas pequeñas (&lt;500 Daltons), y especies iónicas elementales no son consideradas especies macromoleculares. En algunas modalidades, el polipéptido de PGA mejorado aislado es una composición de polipéptidos sustancialmente puros.

Como se usa en el presente documento, cuando se usa en referencia a un ácido nucleico o polipéptido, el término heterólogo se refiere a una secuencia que normalmente no es expresada y secretada por un organismo (por ejemplo, un organismo de tipo silvestre). En algunas modalidades, el término engloba una secuencia que comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en la misma relación entre sí que normalmente se encuentran en la naturaleza, o se modifica de manera recombinante de modo que su nivel de expresión o relación física con otros ácidos nucleicos u otras moléculas en una célula, o estructura, normalmente no se encuentra en la naturaleza. Por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo se produce típicamente de manera recombinante, que tiene dos o más secuencias de genes no relacionados dispuestos de una manera no encontrada en la naturaleza (por ejemplo, un marco de lectura abierto de ácido nucleico (ORF) de la invención unido operativamente a una secuencia promotora insertada en un casete de expresión, como un vector). En algunas modalidades, el polinucleótido heterólogo se refiere a cualquier polinucleótido que se introduce en una célula huésped mediante técnicas de laboratorio, e incluye polinudeótidos que se eliminan de una célula huésped, se someten a manipulación de laboratorio y luego se reintroducen en una célula huésped.

Como se usa en el presente documento, las condiciones de reacción adecuadas se refieren a aquellas condiciones en la solución de reacción biocatalítica (por ejemplo, intervalos de carga enzimática, carga de sustrato, carga de cofactor, temperatura, pH, reguladores, codisolventes, etc.) bajo los cuales un polipéptido de PGA de la presente descripción es capaz de liberar insulina libre eliminando los grupos protectores de acetato de tri-fenilo. Las condiciones de reacción adecuadas ejemplares se proporcionan en la presente descripción e ilustradas por los ejemplos.

Como se ¡lustra en la presente, carga, como en carga de compuesto o carga de enzima o carga de cofactor se refiere a la concentración o cantidad de un componente en una

<img file="MX381306B_D0018.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL mezcla de reacción al inicio de la reacción.

Como se utiliza en la presente, sustrato en el contexto de un procedimiento mediado por biocatalizador se refiere al compuesto o a la molécula en la que actuó mediante el bloca talizador.

Como se utiliza en la presente, producto en el contexto de un procedimiento mediado por biocatalizador se refiere al compuesto o a la molécula resultante de la acción del biocatalizador.

Tal como se usa en este documento, el equilibrio como se usa en la presente memoria se refiere al proceso que da como resultado una concentración en estado estable de especies químicas en una reacción química o enzimática (por ejemplo, interconversión de dos especies A y B), incluida la interconversión de estereoisómeros, como se determina mediante la constante de velocidad de avance y la constante de velocidad inversa de la reacción química o enzimática.

Como se usa aquí, adlasa y aciltransferasas se usan indistintamente para referirse a enzimas que son capaces de transferir un grupo acilo de un donante a un aceptar para formar ésteres o amidas. La reacción inversa mediada por acilasa da como resultado la hidrólisis del éster o la amida.

Como se utiliza en la presente, la penicilina G y bencilpenicilina se refieren al antibiótico también conocido como ácido (2S,5R,6R)-3,3-dimetil-7-oxo-6-(2-fenilacetamido)-4-tia-lazabiciclo[3.2.0]heptano-2-carboxílico (C16H18N2O4S). Es principalmente eficaz contra los organismos Gram-positivos, aunque algunos organismos Gram-negativos también son susceptibles a ella.

Como se usa en el presente documento, penicilina G acilasa y PGA se usan indistintamente para referirse a una enzima que tiene la capacidad de mediar la escisión de penicilina G (bencilpenicilina) a ácido fenilacético (PHA) y ácido 6-aminopenicilánico (6-APA). En algunas modalidades, la actividad de PGA puede basarse en la escisión de sustratos modelo, por ejemplo la escisión del ácido 6-nitro-3-(fenilacetamida) benzoico a ácido fenilacético y ácido 5amino-2-nitro-benzoico. Los PGA también son capaces de llevar a cabo la reacción inversa de transferir un grupo acilo de un donador de acilo a un aceptar de acilo. Los PGA como se usan en la presente memoria incluyen los PGA de origen natural (tipo silvestre) así como las enzimas de PGA de origen no natural que comprenden uno o más polipéptidos modificados genéticamente generados por manipulación humana. El gen PGA de tipo natural es un heterodímero que consiste en la subunidad alfa (23.8 KDa) y la subunidad beta (62.2KDa) unidas por la región espadadora de 54 aminoácidos. Debido a la presencia de región espaciadora, se requiere un paso de autoprocesamiento para formar la proteína activa.

<img file="MX381306B_D0019.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

Como se usa en este documento, donador de acilo se refiere a la porción del sustrato de adlasa que dona el grupo acilo a un aceptar de acilo para formar ésteres o amidas.

Como se usa en este documento, aceptar de acilo se refiere a la porción del sustrato de adlasa que acepta el grupo acilo del donadror de acilo para formar ésteres o amidas.

Como se usa en este documento, secuencia de cadena a se refiere a una secuencia de aminoácidos que corresponde (por ejemplo, tiene al menos el 85% de identidad) a los residuos en las posiciones 27 a 235 de la SEQ ID NO: 2. Como se usa en este documento, un polipéptido de cadena simple puede comprender una secuencia de cadena a y secuencia(s) adicional(es).

Tal como se usa en este documento, la secuencia de cadena β se refiere a una secuencia de aminoácidos que corresponde a (por ejemplo, tiene al menos un 85% de identidad con) residuos en las posiciones 290 a 846 de la SEQ ID NO:2. Como se usa en este documento, un polipéptido de cadena simple puede comprender una secuencia de cadena β y secuencia(s) adicional(es).

Tal como se utiliza en la presente memoria, derivado de cuando se usa en el contexto de enzimas de PGA diseñadas, identifica la enzima de PGA de origen y/o el gen que codifica dicha enzima de PGA, sobre la cual se basó la ingeniería. Por ejemplo, la enzima de PGA modificada por ingeniería genética de la SEQ ID NO: 60 se obtuvo mediante la evolución artificial, a lo largo de múltiples generaciones del gen que codifica la cadena alfa de PGA de K. citrophila y las secuencias de la cadena beta de la SEQ ID NO:2. Por lo tanto, esta enzima de PGA modificada genéticamente se deriva de el PGA natural o de tipo silvestre de SEQ ID NO: 2.

Como se usa en este documento, insulina se refiere a la hormona polipeptídica producida por las células beta del páncreas en individuos normales. La insulina es necesaria para regular el metabolismo de los carbohidratos al reducir los niveles de glucosa en la sangre. La deficiencia sistemática de insulina provoca diabetes. La insulina consiste en 51 aminoácidos y tiene un peso molecular de aproximadamente 5800 daltons. La insulina está compuesta por dos cadenas peptídicas (designadas como A y B), que contienen una intrasubunidad y dos enlaces disulfuro de intersubunidad. La cadena A está compuesta por 21 aminoácidos y la cadena B está compuesta por 30 aminoácidos. Las dos cadenas forman una estructura altamente ordenada, con varias regiones alfa-helicoidales tanto en las cadenas A como B. Las cadenas aisladas están inactivas. En solución, la insulina es un monómero, dímero o hexámero. Es hexamérico en las preparaciones altamente concentradas utilizadas para inyección subcutánea, pero se vuelve monomérico ya que se diluye en fluidos corporales. La definición pretende abarcar la proinsulina y cualquier polipéptido aislado purificado que tenga parte o la totalidad de la conformación estructural primaria y al menos una de las propiedades biológicas de la insulina natural. Se pretende además abarcar insulina natural y

<img file="MX381306B_D0020.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL derivada sintéticamente, incluidas glicoformas, así como análogos (por ejemplo, polipéptidos que tienen deleciones, inserciones y/o sustituciones).

La insulina contiene tres aminas nudeófilas que pueden reaccionar potencialmente con un donador de fenilacetato y pueden desprotegerse con PGA. Estos residuos incluyen un Lys en la cadena B en la posición 29 (B29) y dos aminas libres N-terminales, Gly en la cadena A en la posición 1 (Al) y Phe en la cadena B en la posición 1 (Bl). La presente invención proporciona insulina tri-protegida (acetato de fenilo unido químicamente a residuos Al, Bl, B29 en insulina humana). Se ha informado anteriormente que la PGA cataliza la hidrólisis de péptidos e insulina protegidos con N-fenilacetato con selectividad exclusiva para el enlace de amida de fenilacetato , dejando intacto el resto de los enlaces peptídicos de la proteína (Brtnik et al., Coll. Czech. Chem. Commun., 46 (8), 1983-1989 [1981]; and Wang et al. Biopolym. 25 (Suppl.), S109-SU4 [1986]).

Como se usa en el presente documento, el grupo protector de acetato de tri-fenilo se refiere a una molécula de insulina que tiene las tres aminas primarias en las posiciones Bl, B29 y Al que están protegidas con un grupo fenilacilo, como se describe aquí.

Penicilina G acilasas

La penicilina adlasa se describió primero de Penicillium chrysogenum Wisc. Q176 by Sakaguchi and Murao (Sakaguchi and Murao, J. Agr.Chem. Soc. Jpn., 23:411 [1950]). La penicilina G acilasa es una enzima hidrolítica que actúa sobre las cadenas laterales de la penicilina G, la cefalosporina G y los antibióticos relacionados para producir los antibióticos β-lactámicos intermedios, el ácido 6-amino-penicilánico y el ácido 7-amino des-acetoxi cefalosporánico, con ácido fenilacético como subproducto común. Estos antibióticos intermedios se encuentran entre los posibles componentes básicos de los antibióticos semisintéticos, como la ampicilina, amoxicilina, cloxacilina, cefalexina y cefatoxima.

Como se indicó anteriormente, la penicilina G acilasa (PGA) se caracteriza por la capacidad de catalizar la escisión hidrolítica de la penicilina G, con una base conjugada de fórmula estructural (I), con ácido 6-amino penicilánico, con una base conjugada de fórmula estructural (II) y ácido fenilacético de fórmula estructural (III), como se muestra en la Reacción Química 1:

REACCIÓN QUÍMICA 1

<img file="MX381306B_D0021.tif" />

0) (II) (III)

<img file="MX381306B_D0022.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

Aunque no está vinculado por la teoría, la especificidad del sustrato aparece asociada con el reconocimiento del grupo fenilo hidrófobo, mientras que un nudeófilo, que en algunos PGA es un residuo de serina en el extremo N de la cadena beta, actúa como aceptar de beta-lactámicos y una variedad de otros grupos, como beta-aminoácidos. Los PGA también se pueden caracterizar por la capacidad de escindir un sustrato modelo análogo a la penicilina G, por ejemplo la escisión del ácido 6-nitro-3-(fenilacetamido)benzoico (NIPAB) de la fórmula estructural (IV), como se muestra en la Reacción Química 2:

REACCIÓN QUÍMICA 2

<img file="MX381306B_D0023.tif" />

Esta ácido fenilacético de fórmula estructural (III) y ácido 5-amino-2-nitro-benzoico de fórmula estructural (V) (Véase por ejemplo, Alkema et al., Anal. Biochem., 275:47-53 [1999]). Debido a que el ácido 5-amino-2-nitro-benzoico es cromogénico, el sustrato de fórmula (IV) proporciona una forma conveniente de medir la actividad de PGA. Además de las reacciones anteriores, los PGA también se pueden usar en la resolución cinética de DL-ter-leucina para la preparación de terleucina ópticamente pura (ver, por ejemplo, Liu et al., Prep. Biochem. Biotechnol., 36:235-41 [2006]).

Los PGA de la presente descripción se basan en la enzima obtenida del organismo Kluyvera citrophila (K. citrophila). Al igual que con los PGA de otros organismos, el PGA de K citrophila es una enzima heterodimérica compuesta por una subunidad alfa y una subunidad beta que se genera mediante el procesamiento proteolítico de un polipéptido pre-pro-PGA. La eliminación de un péptido de señal y un péptido espaciador produce el heterodímero maduro (ver por ejemplo, Barbero et al., Gene 49: 69-80 [1986]). La secuencia de aminoácidos del polipéptido de pre-proPGA que sucede naturalmente de K. citrophila está públicamente disponible (Ver por ejemplo, Genbank Núm. e acceso. P07941, [gi: 129551]) y se proporciona en la presente como SEQ ID NO:2. La secuencia de cadena alfa de PGA de K citrophila que sucede naturalmente corresponde a los residuos 27 a 235 de SEQ ID NO:2. La secuencia de cadena beta de PGA de K citrophila que sucede naturalmente corresponde a los residuos 290 a 846 de SEQ ID NO:2. Los residuos 1 a 26 de la SEQ ID NO:2 corresponden al péptido de señal y los residuos 236-289 de la SEQ ID NO:2 corresponden al propéptido de unión, los cuales se eliminan para generar la enzima de PGA madura natural que es un heterodímero que comprende una subunidad de cadena a y una subunidad de cadena β.

<img file="MX381306B_D0024.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

En algunas modalidades, la presente invención proporciona polipéptidos de PGA diseñados con secuencias de aminoácidos que tienen al menos aproximadamente el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%. 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de la identidad de secuencia con las SEQ ID NOS: 2,4,6, 8,10 y/ó 12.

La presente invención proporciona biocatalizadores de desacilación específicos de insulina adecuados para uso preparativo a escala de laboratorio. Se usó la evolución dirigida para desarrollar variantes de acilasas eficientes capaces de eliminar completamente los grupos protectores de acetato de Al/Bl/B29-tri-fenilo en la insulina y generar&gt; 99% de insulina libre. Siguiendo sólo dos rondas de evolución, se produjeron las variantes que generan más del 99% de insulina libre en menos de 6 horas a una carga enzimática de 0.8 g/l. La mejor variante final PGA_005 fue ~ 8 veces mejorada sobre la estructura inicial. Las variantes de PGA proporcionadas en este documento son capaces de aceptar una amplia gama de grupos acilo, exhiben una mayor estabilidad de los disolventes y una termoestabilidad mejorada, en comparación con el PGA de tipo silvestre. Los PGA variantes proporcionados en este documento carecen de la región espaciadora. Por lo tanto, el paso de auto-procesamiento no es necesario para producir enzimas activas.

La presente invención proporciona polinucleótidos que codifican los polipéptidos de PGA diseñados. En algunas modalidades, los polinucleótidos están operativamente enlazados a una o más secuencias heterólogas reguladoras que controlan la expresión génica para crear polinucleótidos recombinantes capaces de expresar el polipéptido. Los constructos de expresión que contienen un polinucleótido heterólogo que codifica los polipéptidos de PGA diseñados pueden introducirse en células huésped apropiadas para expresar el correspondiente polipéptido de PGA.

Debido al conocimiento de los codones correspondientes a los diversos aminoácidos, la disponibilidad de una secuencia de proteínas proporciona una descripción de todos los polinucleótidos capaces de codificar el sujeto. La degeneración del código genético, donde los mismos aminoácidos son codificados por codones alternativos o sinónimos, permite formar un número extremadamente grande de ácidos nucleicos, todos los cuales codifican las enzimas de PGA mejoradas descritas en la presente. Por lo tanto, habiendo identificado una secuencia de aminoácidos particular, los expertos en la técnica podrían hacer cualquier cantidad de ácidos nucleicos diferentes simplemente modificando la secuencia de uno o más codones de una manera que no cambie la secuencia de aminoácidos de la proteína. Con respecto a esto, la presente descripción contempla específicamente cada variación de polinucleótidos que podrían realizarse al seleccionar las combinaciones con base en las elecciones de codones posibles, y todas las variaciones se van a considerar específicamente descritas para cualquier polipéptido descrito en la presente, incluyendo las secuencias de aminoácidos presentadas en los cuadros en los ejemplos 5 y 6.

<img file="MX381306B_D0025.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

En varias modalidades, los codones se seleccionan preferiblemente para adaptarse a la célula huésped en la que se produce la proteína. Por ejemplo, los codones preferidos utilizados en bacterias se usan para expresar el gen en bacterias; los codones preferidos utilizados en la levadura se usan para la expresión en levaduras; y los codones preferidos utilizados en mamíferos se usan para la expresión en células de mamíferos.

En ciertas modalidades, no es necesario reemplazar todos los codones para optimizar el uso de codones de los polipéptidos de PGA ya que la secuencia natural comprenderá codones preferidos y porque no se puede requerir el uso de codones preferidos para todos los residuos de aminoácidos. En consecuencia, los polinucleótidos optimizados en codón que codifican los polipéptidos de PGA diseñados pueden contener codones preferidos a aproximadamente 40%, 50%, 60%, 70%, 80% o mayor que 90% de las posiciones de codón en la región de codificación de longitud completa.

En algunas modalidades, el polinucleótido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de PGA con una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de identidad de secuencia con la cadena alfa y/o con la cadena beta de cualquiera de los polipéptidos de PGA modificados por ingeniería de referencia descritos aquí. En consecuencia, en algunas modalidades, el polinucleótido codifica una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más Idéntica a una secuencia de cadena alfa y cadena beta con base en la SEQ ID NO:2. En algunas modalidades, el polinucleótido codifica una secuencia de aminoácidos de cadena alfa y/o beta de SEQ ID NO:2.

En algunas modalidades, el polinucleótido comprende una secuencias de nucleótidos que codifican un polipéptido de PGA que tienen una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente el 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%. 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más de la identidad de secuencia con las SEQ ID NOS:4, 6, 8, 10, 10 y/ó 12. En consecuencia, en algunas modalidades, el polinucleótido codifica una secuencia de aminoácidos que es por lo menos aproximadamente 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%. 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más idéntica a las SEQ ID NOS:1, 3, 5, 7, 9 y/ó 11.

En algunas modalidades, se manipuló un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido de PGA mejorado en una variedad de formas para proporcionar una actividad y/o expresión mejoradas del polipéptido. La manipulación del polinucleótido aislado antes de su inserción en un vector puede ser deseable o necesario dependiendo del vector de expresión utilizado. Las técnicas para modificar secuencias de polinucleótidos y ácidos nucleicos que utilizan métodos de ADN recombinante son bien conocidos en la técnica.

<img file="MX381306B_D0026.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

Por ejemplo, la mutagénesis y evolución dirigida pueden ser aplicados fácilmente a los polinucleótidos para generar bibliotecas de variantes que pueden ser expresadas, seleccionadas, y ensayadas. La mutagénesis y los métodos de evolución dirigida son conocidos en la técnica (Ver por ejemplo., Patente de EE.UU. Números. 5,605,793, 5,830,721, 6,132,970, 6,420,175, 6,277,638, 6,365,408, 6,602,986, 7,288,375, 6,287,861, 6,297,053, 6,576,467, 6,444,468, 5,811238, 6,117,679, 6,165,793, 6,180,406, 6,291,242, 6,995,017, 6,395,547, 6,506,602, 6,519,065,

6,506,603, 6,413,774, 6,573,098, 6,323,030, 6,344,356, 6,372,497, 7,868,138, 5,834,252,

5,928,905, 6,489,146, 6,096,548, 6,387,702, 6,391,552, 6,358,742, 6,482,647, 6,335,160,

6,653,072, 6,355,484, 6,03,344, 6,319,713, 6,613,514, 6,455,253, 6,579,678, 6,586,182, 6,406,855,

<td> 6,946,296,</td><td> 7,534,564,</td><td> 7,776,598, 5,837,458,</td><td> 6,391,640,</td><td> 6,309,883, 7,105,297,</td><td> 7,795,030,</td>

<td> 6,326,204,</td><td> 6,251,674,</td><td> 6,716,631, 6,528,311,</td><td> 6,287,862,</td><td> 6,335,198, 6,352,859,</td><td> 6,379,964,</td>

<td> 7,148,054,</td><td> 7,629,170,</td><td> 7,620,500, 6,365,377,</td><td> 6,358,740,</td><td> 6,406,910, 6,413,745,</td><td> 6,436,675,</td>

<td> 6,961,664,</td><td> 7,430,477,</td><td> 7,873,499, 7,702,464,</td><td> 7,783,428,</td><td> 7,747,391, 7,747,393,</td><td> 7,751,986,</td>

<td> 6,376,246,</td><td> 6,426,224,</td><td> 6,423,542, 6,479,652,</td><td> 6,319,714,</td><td> 6,521,453, 6,368,861,</td><td> 7,421,347,</td>

<td> 7,058,515,</td><td> 7,024,312,</td><td colspan="4"> 7,620,502, 7,853,410, 7,957,912, 7,904,249, y todos los ejemplares no</td>

estadounidenses relacionados; Ling et al., Anal. Biochem., 254(2):157-78 [1997]; Dale et al., Meth.

Mol. Biol., 57:369-74 [1996]; Smith, Ann. Rev. Genet., 19:423-462 [1985]; Botstein et al., Science,

229:1193-1201 [1985]; Cárter, Biochem. 1, 237:1-7 [1986]; Kramer et al., Cell, 38:879-887 [1984]; Wells et al., Gene, 34:315-323 [1985]; Minshull et al., Curr. Op. Chem. Biol., 3:284-290 [1999]; Christians et al., Nat. Biotechnol., 17:259-264 [1999]; Crameri et al., Nature, 391:288-291 [1998]; Crameri, et al., Nat. Biotechnol., 15:436-438 [1997]; Zhang et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 94:4504-4509 [1997]; Crameri et al., Nat. Biotechnol., 14:315-319 [1996]; Stemmer, Nature, 370:389-391 [1994]; Stemmer, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 91:10747-10751 [1994]; WO 95/22625;

WO 97/0078; WO 97/35966; WO 98/27230; WO 00/42651; WO 01/75767; y WO 2009/152336, las cuales están incorporadas a la presente a manera de referencia).

En algunas modalidades, las acilasas de PGA variantes de la presente invención comprenden además secuencias adicionales que no alteran la actividad codificada de la enzima. Por ejemplo, en algunas modalidades, las acilasas de PGA variantes están enlazadas a una etiqueta de epítopo o a otra secuencia útil en la purificación.

En algunas modalidades, los polipéptidos de PGA acilasa variantes de la presente invención se secretan de la célula huésped en la que se expresan (por ejemplo, una célula huésped fúngica filamentosa o de levadura) y se expresan como una preproteína que incluye un péptido de señal (es decir,, una secuencia de aminoácidos unida al extremo amino de un polipéptido y que dirige el polipéptido codificado a la ruta secretora de la célula).

En algunas modalidades, el péptido señal es un péptido de señal de PGA acilasa de

<img file="MX381306B_D0027.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO

DE LA PROPIEDAD

INDUSTRIAL

K. citrophila endógeno. En algunas otras modalidades, se utilizan los péptidos señal de otras proteínas secretadas por K. citrophila. En algunas modalidades, otros péptidos de señal encuentran uso, dependiendo de la célula huésped y otros factores. Las regiones de codificación de péptidos de señal efectiva para células huésped fúngicas filamentosas incluyen, por ejemplo, las regiones de codificación de péptidos de señal obtenidos de Aspergillus oryzae TAKA amylase, Aspergillus niger neutral amylase, Aspergillus niger glucoamylase, Rhizomucor miehei aspartic proteinase, Humicola insolens cellulase, Humicola lanuginosa lipasa, y T. reesei celobiohidrolasa II. Las regiones de codificación de péptidos de señal para las células huésped bacterianas incluyen por ejemplo, las regiones de codificación de péptidos de señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica Bacillus NCIB 11837, Bacillus stearothermophilus alfa-amilasa, Bacillus licheniformis subtilisina, Bacillus licheniformis β-lactamasa, Bacillus stearothermophilus proteasas neutras (nprT, nprS, nprM), y Bacillus subtilis prsA. En algunas modalidades adicionales, otros péptidos de señal se usan en la presente invención (Ver por ejemplo., Simonen and Palva, Microbiol. Rev., 57: 109-137 [1993], incorporada a la presente a manera de referencia). Los péptidos de señal útil adicionales para las células huésped de levadura incluyen los de los genes para Saccharomyces cerevisiae factor alfa, Saccharomyces cerevisiae SUC2 invertasa (Ver por ejemplo,, Taussig and Carlson, Nucí. Acids Res., 11:1943-54 [1983]; SwissProt Accession No. P00724; and Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992]). En algunas modalidades, las variantes de estos péptidos señal y otros péptidos señal se encuentran en uso. De hecho, no se pretende que la presente invención esté limitada a ningún péptido de señal específico, ya que cualquier péptido de señal adecuado conocido en la técnica encuentra uso en la presente invención.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona polinudeótidos que codifican polipéptidos de PGA acilasa variante, y/o fragmentos biológicamente activos de los mismos, como se describe en este documento. En algunas modalidades, los polinudeótidos están operativamente enlazados a una o más secuencias heterólogas reguladoras o de control que controlan la expresión génica para crear polinudeótidos recombinantes capaces de expresar el polipéptido. En algunas modalidades, los constructos de expresión que contienen un polinucleótido heterólogo que codifica un PGA acilasa variante se introduce en células huésped adecuadas para expresar la PGA acilasa variante.

Los expertos en la técnica entienden que debido a la degeneración del código genético, existe una multitud de secuencias de nucleótidos que codifican polipéptidos de PGA acilasa variante de la presente invención. Por ejemplo, los codones AGA, AGG, CGA, CGC, CGG y CGU todos codifican el aminoácido arginina. Así, en cada posición en los ácidos nucleicos de la invención donde una arginina se especifica por un codón, el codón puede alterarse para cualquiera de los codones correspondientes descritos anteriores sin alterar el polipéptido codificada. Se entiende que U en

<img file="MX381306B_D0028.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL una secuencia de ARN corresponde a 'Τ' en una secuencia de ADN. La invención contempla y proporciona todas y cada una de las variaciones posibles de la secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de la invención que se podría hacer seleccionando combinaciones basadas en posibles elecciones de codones.

Como se indicó anteriormente, la secuencia de ADN que codifica un PGA también puede diseñarse para codones de desviación de uso de codones altos (codones que se usan a mayor frecuencia en las regiones de codificación de proteínas que otros codones que codifican el mismo aminoácido). Los codones preferidos pueden determinarse en relación con el uso de codones en un solo gen, un conjunto de genes de función u origen común, genes altamente expresados, la frecuencia de codones en las regiones codificadoras de proteínas agregadas de todo el organismo, la frecuencia de codones en la proteína agregada regiones codificadoras de organismos relacionados, o combinaciones de los mismos. Los codones cuya frecuencia aumenta con el nivel de expresión génica típicamente son codones óptimos para la expresión. En particular, una secuencia de ADN se puede optimizar para la expresión en un organismo huésped particular. Una variedad de métodos se conocen la técnica para determinar la frecuencia del codón (por ejemplo, el uso del codón, el uso de codón sinónimo relativo) y la preferencia del codón en organismos específicos, incluido el análisis multivariado (por ejemplo, usando análisis de conglomerados o análisis de correspondencia) y el número efectivo de codones usados en un gen. La fuente de datos para obtener el uso de codones puede depender de cualquier secuencia de nucleótidos disponible capaz de codificar una proteína. Estos conjuntos de datos incluyen secuencias de ácidos nucleicos realmente conocidas para codificar proteínas expresadas (por ejemplo, secuencias de codificación de proteínas completas-CDS), etiquetas de secuencias expresadas (ESTS) o regiones de codificación predichas de secuencias genómicas, como se conoce en la técnica. Los polinudeótidos que codifican variantes de PGA se pueden preparar usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Típicamente, los oligonudeótidos se sintetizan individualmente, luego se unen (por ejemplo, mediante métodos de ligación enzimática o química, o métodos mediados por polimerasa) para formar esencialmente cualquier secuencia continua deseada. En algunas modalidades, los polinudeótidos de la presente invención se preparan mediante síntesis química usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye, pero no se limita a, métodos de síntesis automatizados. Por ejemplo, en el método fosforamidita, los oligonudeótidos se sintetizan (por ejemplo, en un sintetizador de ADN), purificado, recocido, ligado y clonado en vectores adecuados. En algunas modalidades, se obtienen entonces fragmentos de ADN bicatenarios sintetizando la cadena complementaria y recociendo las cadenas juntas en condiciones apropiadas, o mediante la adición de la cadena complementaria utilizando ADN polimerasa con una secuencia de cebador adecuada. Existen numerosos textos generales y estándar que proporcionan métodos útiles en la presente invención para los expertos en

<img file="MX381306B_D0029.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL la técnica.

Los PGA modificados genéticamente se pueden obtener sometiendo el polinucleótido que codifica el PGA natural a métodos de mutagénesis y/o de evolución dirigida, como se discutió anteriormente. La mutagénesis se puede realizar de acuerdo con cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica, incluida la mutagénesis aleatoria y específica del sitio. La evolución dirigida se puede realizar con cualquiera de las técnicas conocidas en la técnica para detectar variantes mejoradas, incluida la transposición. Otros procedimientos de evolución dirigida que encuentran uso incluyen, pero no están limitados, al proceso de extensión escalonado (StEP), la recombinación in vitro, la PCR mutagénica, la mutagénesis de casetes, el empalme por extensión de solapamiento (SOEing), los métodos de evolución dirigida por ProSAR™, etc. como cualquier otro método adecuado.

Los clones obtenidos después del tratamiento de mutagénesis se seleccionan para los PGA diseñados que tienen una propiedad de enzima mejorada deseada. La actividad enzimática de medición de las bibliotecas de expresión se puede realizar usando la técnica de bioquímica estándar de monitoreo de la velocidad de formación del producto. Cuando una propiedad enzimática mejorada deseada es la estabilidad térmica, la actividad enzimática se puede medir después de someter las preparaciones enzimáticas a una temperatura definida y medir la cantidad de actividad enzimática que queda después de los tratamientos térmicos. Los clones que contienen un polinucleótido que codifica un PGA entonces son aislados del gen, secuenciados para identificar los cambios de la secuencia de nucleótidos (si los hay), y usados para expresar la enzima en una célula huésped.

Cuando se conoce la secuencia del polipéptido diseñado, los polinucleótidos que codifican la enzima pueden ser preparados por métodos estándar de fase sólida, según los métodos de síntesis conocidos. En algunas modalidades, los fragmentos de hasta aproximadamente 100 bases pueden ser individualmente sintetizados, luego unidos (por ejemplo, por métodos de unión enzimática o química, o métodos mediados por polimerasa) para formar cualquier secuencia deseada continua. Por ejemplo, los polinucleótidos y oligonucleotides de la invención pueden ser preparados por síntesis química (por ejemplo, usando el método fosforamidita clásico descrito por Beaucage et al., Tet. Lett., 22:1859-69 [1981], o el método descrito por Matthes et al., EMBO J., 3:801-05 [1984], dado que se practica comúnmente en métodos sintéticos automáticos). Según el método de fosforamidita, los oligonucleótidos son sintetizados (por ejemplo, en un sintetizador de ADN automático), purificados, recocidos, ligados y clonados en vectores adecuados. Además, esencialmente cualquier ácido nucleico puede obtenerse de cualquiera de una variedad de fuentes comerciales (por ejemplo, The Midland Certified Reagent Company, Midland, TX, The Great American Gene Company, Ramona, CA, ExpressGen Inc. Chicago, IL, Operon Technologies Inc., Alameda, CA,

<img file="MX381306B_D0030.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL y muchos otros).

La presente invención también proporciona construcciones recombinantes que comprenden una secuencia que codifica al menos un PGA variante, tal como se proporciona aquí. En algunas modalidades, la presente invención proporciona un vector de expresión que comprende un polinucleótido de PGA variante operativamente unido a un promotor heterólogo. En algunas modalidades, los vectores de expresión de la presente invención se usan para transformar células huésped apropiadas para permitir que las células huésped expresen la proteína de PGA variante. Los métodos para la expresión recombinante de proteínas en hongos y otros organismos son bien conocidos en la técnica, y una serie de vectores de expresión están disponibles o pueden construirse usando métodos de rutina. En algunas modalidades, las construcciones de ácido nucleico de la presente invención comprenden un vector, tal como, un plásmido, un cósmido, un fago, un virus, un cromosoma artificial bacteriano (BAC), un cromosoma artificial de levadura (YAC), y similares, en el que se ha insertado una secuencia de ácido nucleico de la invención. En algunas modalidades, los polinucleótidos de la presente invención se incorporan a cualquiera de una variedad de vectores de expresión adecuados para expresar polipéptido(s) de PGA variante. Los vectores adecuados incluyen, pero no están limitados a, secuencias de ADN cromosómicas, no cromosómicas y sintéticas (por ejemplo, derivados de SV40), así como plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, ADN viral tales como vaccinia, adenovirus, virus de la viruela aviar, pseudorrabia, adenovirus, virus adenoasociado, retrovirus y muchos otros. Cualquier vector adecuado que transduzca el material genético en una célula y, si se desea la replicación, que sea replicable y viable en el huésped relevante, se usa en la presente invención. En algunas modalidades, el constructo comprende además secuencias reguladoras, que incluyen, pero no se limitan a, un promotor, operativamente unido a la secuencia de codificación de la proteína. Los grandes números de vectores y promotores adecuados los conocen los expertos en la técnica. De hecho, en algunas modalidades, para obtener altos niveles de expresión en un huésped particular, a menudo es útil expresar los PGA variantes de la presente invención bajo el control de un promotor heterólogo. En algunas modalidades, una secuencia promotora está unida operativamente a la región 5 'de la secuencia de codificación de PGA variante usando cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los ejemplos de promotores útiles para la expresión de PGA variante incluyen, pero no se limitan a, promotores de hongos. En algunas modalidades, se encuentra el uso de una secuencia promotora que impulsa la expresión de un gen que no sea un gen PGA en una cepa fúngica. Como un ejemplo no limitante, se puede usar un promotor fúngico de un gen que codifica una endoglucanasa. En algunas modalidades, se encuentra el uso de una secuencia promotora que impulsa la expresión de un gen PGA en una cepa fúngica distinta a la cepa fúngica de la que se derivaron los PGA. Los ejemplos de otros promotores

<img file="MX381306B_D0031.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL adecuados útiles para dirigir la transcripción de los constructos de nudeótidos de la presente invención en una célula huésped fúngica filamentosa incluyen, por ejemplo a promotores obtenidos de los genes para Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Rhizomucor miehei proteinasa aspártica, Aspergillus niger amilasa alfa neutra, Aspergillus niger amilasa alfa acida estable Aspergillus niger o Aspergillus awamori glucoamilasa (glaA), Rhizomucor miehei lipasa, Aspergillus oryzae proteasa alcalina, Aspergillus oryzae isomerasa de triosa fosfato, Aspergillus nidulans acetamidasa, y Fusarium oxysporum proteasa similar a tripsina(Ver por ejemplo, WO 96/00787, incorporada a la presente a manera de referencia), así como el promotor NA2-tpi (un híbrido de los promotores de los genes para amilasa alfa neutra Aspergillus niger e isomerasa triosa fosfato Aspergillus oryzae), promotores tales como cbhl, cbh2, egll, egl2, pepA, hfbl, hfb2, xynl, amy, y glaA (Ver, por ejemplo, Nunberg et al., Mol. Cell Biol., 4:2306 -2315 [1984]; Boel et al., EMBO J., 3:1581-85 [1984]; y solicitud de patente europea 137280, todas incorporadas a manera de referencia) y promotores mutantes, truncados e híbridos de los mismos.

En las células huésped de levadura, los promotores útiles incluyen por ejemplo los de los genes para Saccharomyces cerevisiae enolasa (eno-1), Saccharomyces cerevisiae galactoquinasa (gall), Saccharomyces cerevisiae alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP), y S. cerevisiae 3-fosfoglicerato quinasa. Los promotores adicionales útiles para las células huésped de levadura son conocidos en la técnica (Ver por ejemplo., Romanos et al., Yeast 8:423-488 [1992], incorporados a manera de referencia en la presente). Además, los promotores asociados con la producción de quitinasa en hongos se utilizan en la presente invención (Ver por ejemplo., Blaiseau and Lafay, Gene 120243-248 [1992]; y Limón et al., Curr. Genet, 28:478-83 [1995], ambas incorporadas a la presente a manera de referencia).

Para las células huésped bacterianas, los promotores adecuados para dirigir la transcripción de los constructos de ácido nucleico de la presente descripción, incluyen por ejemplo los promotores obtenidos de E. coli lac operon, E. coli trp operan, bacteriófago λ, gen de agarasa Streptomyces coelicolor (dagA), gen de levansucrasa Bacillus subtilis (sacB), gen alfa-amilasa Bacillus licheniformis (amyL), gen amilasa maltogénica Bacillus stearothermophilus (amyM), gen alfaamilasa Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gen penicilinasa Bacillus licheniformis (penP), genes xylA y xylB Bacillus subtilis y gen beta lactamasa procariota (Ver por ejemplo, Villa-Kamaroff et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731 [1978]), así como el promotor tac Ver por ejemplo, DeBoer et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21-25 [1983]).

En algunas modalidades, los PGA variantes clonados de la presente invención también tienen una secuencia terminadora de transcripción adecuada, una secuencia reconocida por una célula huésped para termina la transcripción. La secuencia terminadora está operativamente enlazada al extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico que codifica al polipéptido. Cualquier

<img file="MX381306B_D0032.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL terminador adecuado que es funcional en la célula huésped de elección es útil en la presente invención. Los terminadores de transcripción ejemplares para la célula huésped fúngica filamentosa incluyen por ejemplo los obtenidos de los genes de Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Aspergillus niger glucoamilasa, Aspergillus nidulans antranilato sintasa, Aspergillus niger alfa-glucosidasa, y Fusarium oxysporum proteasa similar a tripsina (Ver también, la patente de EE.UU. No. 7,399,627, incorporado a la presente a manera de referencia). En algunas modalidades, los terminadores ejemplares para las células huésped de levadura incluyen los obtenidos de los genes para Saccharomyces cerevisiae enolasa, Saccharomyces cerevisiae citocomo C (CYCI), y Saccharomyces cerevisiae gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa. Otros terminadores útiles para células huésped de levadura son conocidos en la técnica (Ver por ejemplo., Romanos et al., Yeast 8:423-88 [1992]).

En algunas modalidades, una secuencia líder adecuada es parte de una secuencia de PGA variante clonada, que es una región no traducida de un ARNm que es importante para la traducción por la célula huésped. La secuencia líder está operativamente enlazada al extremo 5' de la secuencia de ácido nucleico que codifica al polipéptido. Cualquier secuencia líder adecuada que es funcional en la célula huésped de elección es útil en la presente invención. Líderes ejemplares para las células huésped fúngicas filamentosas son obtenidos de los genes para Aspergillus oryzae TAKA amilasa y Aspergillus nidulans triosa fosfato isomerasa. Los líderes adecuados para las células huésped de levadura son por ejemplo los obtenidos de los genes para Saccharomyces cerevisiae enolasa (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato quinasa, Saccharomyces cerevisiae alfafactor, y Saccharomyces cerevisiae alcohol deshidrogenasa/gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (ADH2/GAP).

En algunas modalidades, las secuencias de la presente invención también comprende una secuencia de poliadenilación que es una secuencia operativamente unida al extremo 3' de la secuencia de ácido nucleico y que, cuando se transcribe, es reconocido por la célula huésped como una señal para agregar residuos de poliadenosina al ARNm transcrito. Cualquier secuencia de poliadenilación que es funcional en la célula huésped de elección es útil en la presente invención. Las secuencias de poliadenilación ejemplares para células huésped fúngicas filamentosas incluyen por ejemplo, los obtenidos a los genes para Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Aspergillus niger glucoamilasa, Aspergillus nidulans antranilato sintaso, Fusarium oxysporum proteasa similar a tripsina y Aspergillus niger alfa-glucosidasa. Las secuencias útiles de poliadenilación para las células huésped de levadura son conocidas en la técnica (Ver por ejemplo., Guo and Sherman, Mol. Cell. Biol., 15:5983-5990 [1995]).

En algunas modalidades, la secuencia de control comprende un péptido de señal que codifica la región codificando una secuencia de aminoácidos enlazados al extremo amino de un polipéptido y dirige el polipéptido codificado en la trayectoria secretora de la célula. El extremo 5' de

<img file="MX381306B_D0033.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL la secuencia codificadora de la secuencia de ácido nucleico inherentemente contiene una región codificadora de péptidos de señal naturalmente enlazado en el marco de lectura de traducción con el segmento de la región codificadora que codifica el polipéptido secretado. Alternativamente, el extremo 5' de la secuencia codificadora puede contener una reglón codificadora de péptido de señal que es extraña a la secuencia codificadora. La región codificadora del péptido de señal extraño puede ser requerida cuando la secuencia codificadora no contiene naturalmente una región codificadora del péptido de señal.

Alternativamente, la región codificadora del péptido de señal extraño puede simplemente reemplazar la reglón codificadora del péptido de señal natural para mejorar la secreción del polipéptido. Sin embargo, cualquier región adecuada codificadora de péptidos de señal que dirige el polipéptido expresado en la trayectoria de secreción de una célula huésped de elección es útil para la expresión del polipéptido diseñado.

Las reglones de codificación de péptidos de señal efectivas para las células huésped bacterianas Incluyen por ejemplo, las regiones de codificación de péptidos de señal obtenidas de los genes para amilasa maltogénica Bacillus NCIB 11837, Bacillus stearothermophilus alfa-amllasa, Bacillus licheniformis subtilisina, Bacillus licheniformis β-lactamasa, Bacillus stearothermophilus proteasas neutras (nprT, nprS, nprM), y Bacillus subtilis prsA. Péptidos de señal adecuados son conocidos en la técnica (Véase por ejemplo, Simonen y Palva, Microbiol. Rev., 57:109-137 [1993]).

Las regiones codificadoras de péptidos de señal efectivas para células huésped fúngicas filamentosas incluyen por ejemplo las regiones codificadoras de péptidos de señal obtenidas de los genes para Aspergillus oryzae TAKA amilasa, Aspergillus niger amilasa neutra, Aspergillus niger glucoamilasa, Rhizomucor mlehei proteinasa aspártica, Humicola insolens celulasa, y Humicola lanuginosa lipasa.

Los péptidos de señal útiles para las células huésped de levadura incluyen por ejemplo los genes para Saccharomyces cerevisiae factor alfa y Saccharomyces cerevisiae invertasa. Otras regiones codificadoras de péptidos de señal útiles se conocen en la técnica (Ver por ejemplo, Romanos et al., [1992], supra).

En algunas modalidades, la secuencia de control comprende una región codificadora de propéptidos que codifica una secuencia de aminoácidos posicionada en el extremo amino de un polipéptido. El polipéptido resultante se conoce como proenzima o propolipéptido (o un zimógeno en algunos casos). Un propolipéptido puede ser generalmente inactivo y puede convertirse en un polipéptido de PGA activo maduro mediante escisión catalítica o autocatalítica del propéptido del propolipéptido. La región codificadora de propéptidos puede obtenerse de genes para Bacillus subtilis proteasa alcalina (aprE), Bacillus subtilis proteasa neutra (nprT), Saccharomyces cerevisiae factor alfa, Rhizomucor miehei proteinasa aspártica y Myceliophthora thermophila lactasa (ver por

<img file="MX381306B_D0034.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL ejemplo, WO 95/33836).

Donde están presentes ambas regiones de señal de péptido y de propéptido en el extremo amino de un polipéptido, la región del propéptido es colocada en seguida del extremo amino de un polipéptido y la región del péptido de señal es colocada junto al extremo amino de la región del propéptido.

En algunas modalidades, las secuencias reguladoras también se utilizan para permitir la regulación de la expresión del polipéptido relacionado con el crecimiento de la célula huésped. Ejemplos de sistemas reguladores son esos que causan la expresión del gen a ser apagado o encendido en respuesta a un estímulo químico o físico, incluyendo la presencia de un compuesto regulador. En las células huésped procarióticas, las secuencias reguladoras adecuadas incluyen, pero no se limitan a los sistemas de operador lac, tac, y trp. En células huésped de levadura, los sistemas reguladores adecuados incluyen, pero no se limitan al sistema ADH2 o sistema GAL1. En las secuencias reguladoras adecuadas, fúngicas filamentosas incluyen el promotor alfa amilasa TAKA, Aspergillus niger promotor glucoamilasa y el promotor glucoamilasa Aspergillus oryzae.

Otros ejemplos de secuencias reguladoras son aquellos que permiten la amplificación génica. En sistemas eucariotas, éstos incluyen el gen dihidrofolato reductasa, que se amplifica en presencia de metotrexato, y los genes metalotioneínicos, que se amplifican con metales pesados. En estos casos, la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido PGA de la presente invención estaría unida operativamente a la secuencia reguladora.

Así, en las modalidades adicionales, la presente invención se dirige a vectores de expresión recombinante que comprenden un polinucleótido que codifica un polipéptido de PGA diseñado o una variante del mismo y una o más regiones reguladoras de expresión tales como un promotor y un terminator, una región de replicación, etc., dependiendo del tipo de anfitrión en los que serán introducidos. En algunas modalidades, las varias secuencias de control y de ácidos nucleicos descritas en la presente se juntan para producir vectores de expresión recombinantes que incluyen uno o más sitios de restricción convenientes para permitir la inserción o sustitución de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el polipéptido PAL a tales sitios. Alternativamente, en algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico de la presente invención es expresada por inserción de la secuencia de ácido nucleico o un constructo de ácido nucleico que comprende la secuencia en un vector adecuado para la expresión. En la creación del vector de expresión, la secuencia codificadora es ubicada en el vector de manera que la secuencia codificadora está operativamente enlazada con las secuencias apropiadas de control para la expresión.

El vector de expresión recombinante comprende cualquier vector adecuado (por ejemplo, un plásmido o virus), que puede ser sometido convenientemente a procedimientos de ADN recombinante y realiza la expresión de la secuencia de polinudeótidos. La elección del vector

<img file="MX381306B_D0035.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL normalmente depende de la compatibilidad del vector con la célula huésped en la que se introducirá el vector. En algunas modalidades, los vectores son plásmidos circulares lineales o cerrados.

En algunas modalidades, el vector de expresión es un vector que se replica autonónomamente (es decir, un vector que existe como una entidad extra-cromosomal, cuya replicación es independiente de la replicación cromosoma!, tal como un plásmido, un elemento extracromosomal, a minicromosoma, o un cromosoma artificial). En algunas modalidades, el vector contiene cualquier medio para asegurar la autorreplicación. Por otra parte, en algunas modalidades, tras introducirlo en la célula huésped, el vector se integra en el genoma y se replica junto con el o los cromosomas en donde se ha integrado. Además, en algunas modalidades, se utiliza un vector único o plásmido, o dos o más vectores o plásmidos que juntos contienen el ADN total a ser introducido en el genoma de la célula huésped y/o un transposón.

En algunas modalidades, el vector de expresión de la presente invención contiene uno o más marcadores seleccionables, que permiten la fácil selección de las células transformadas. Un marcador seleccionable es un gen, cuyo producto proporciona una resistencia biocida o viral, resistencia a los agentes antimicrobianos o metales pesados, prototrofia a auxótrofos, y similares. Cualquier marcador seleccionable adecuado para su uso en una célula huésped fúngica filamentosa encuentra uso en la presente invención, que incluye, pero no se limita a, amdS (acetamidasa), argB (omitiría carbamoiltransferasa), barra (fosfinotricina acetiltransferasa), hph (higromicina fosfotransferasa) niaD (nitrato reductasa), pirG (orotidina-S'-fosfato descarboxilasa), sC (sulfato adeniltransferasa) y trpC (antranilato sintasa), así como sus equivalentes. Los marcadores adicionales útiles en las células huésped tales como Aspergillus, incluyen por ejemplo genes amdS y pyrG de Aspergillus nidulans o Aspergillus oryzae, y el gen de barras de Streptomyces hygroscoplcus. Los marcadores adecuados para las células huésped de levadura incluyen, pero no se limitan a ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, y URA3. Ejemplos de marcadores seleccionables bacterianos incluyen, pero no se limitan a los de los genes de Bacillus subtilis o Bacillus licheniformis, o marcadores, que confieren resistencia a antibióticos tal como resistencia a ampicilina, kanamicina, doramfenicol o tetraciclina.

En algunas modalidades, los vectores de expresión de la presente invención contienen un elemento que permite la integración del vector en el genoma de la célula huésped o la replicación autónoma del vector en la célula independientemente del genoma. En algunas modalidades que implican la integración en el genoma de la célula huésped, los vectores se basan en la secuencia de ácido nucleico que codifica el polipéptido o cualquier otro elemento del vector para la integración del vector en el genoma mediante recombinación homologa o no homologa.

En algunas modalidades alternativas, los vectores de expresión contienen secuencias de ácido nucleico adicionales para dirigir la integración por recombinación homologa en el genoma

<img file="MX381306B_D0036.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO

DE LA PROPIEDAD

INDUSTRIAL de la célula huésped. Las secuencias de ácido nucleico adicionales permiten que el vector se integre en el genoma de la célula huésped en una ubicación precisa en el(los) cromosoma(s). Para aumentar la probabilidad de integración en una ubicación precisa, los elementos ¡ntegraclonales preferiblemente contienen un número suficiente de nucleótidos, tales como de 100 a 10,000 pares de bases, preferiblemente de 400 a 10,000 pares de bases, y lo más preferiblemente de 800 a 10,000 pares de bases, que son altamente homólogos con la secuencia objetivo correspondiente para mejorar la probabilidad de recombinación homologa. Los elementos integracionales pueden ser cualquier secuencia que sea homologa con la secuencia objetivo en el genoma de la célula huésped. Además, los elementos integracionales pueden no codificar o codificar secuencias de ácidos nucleicos. Por otro lado, el vector puede integrarse en el genoma de la célula huésped mediante recombinación no homologa.

Para la replicación autónoma, el vector puede comprender además un origen de replicación que permite que el vector se replique de forma autónoma en la célula huésped en cuestión. Los ejemplos de los orígenes de replicación bacteriana son P15A orí o orígenes de replicación de plásmidos pBR322, pUC19, pACYCI77 (cuyo plásmido tiene P15A ori), o pACYC184 que permite la replicación en E. coli, y pUBUO, pE194, pTA1060, o ρΑΜβΙ que permite la replicación en Bacillus. Los ejemplos de orígenes de replicación para uso en una célula huésped de levadura son el origen de replicación de 2 mieras, ARS1, ARS4, la combinación de ARS1 y CEN3, y la combinación de ARS4 y CEN6. El origen de replicación puede ser uno que tenga una mutación que hace su funcionamiento sensible a la temperatura en la célula huésped (véase, por ejemplo., Ehrlich, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 75:1433 [1978]).

En algunas modalidades, se inserta más de una copia de una secuencia de ácido nucleico de la presente invención en la célula huésped para aumentar la producción del producto génico. Puede obtenerse un aumento en el número de coplas de la secuencia de ácido nucleico mediante la integración de al menos una copia adicional de la secuencia en el genoma de la célula huésped o mediante la inclusión de un gen marcador seleccionable amplificable con la secuencia de ácido nucleico donde las células que contienen copias amplificadas del gen marcador seleccionable, y con lo cual las copias adicionales de la secuencia de ácido nucleico pueden seleccionarse cultivando las células en presencia del agente seleccionable apropiado.

Muchos de los vectores de expresión para usar en la presente invención están disponibles comercialmente. Los vectores de expresión comercial adecuados incluyen por ejemplo, los vectores de expresión p3xFLAGTMTM (Sigma-Aldrich Chemicals), que incluyen un promotor CMV y un sitio de poliadenilación hGH para la expresión en células huésped de mamífero y un origen de replicación pBR322 y marcadores de resistencia a la ampicilina para la amplificación en E. coli. Otros vectores de expresión adecuados incluyen por ejemplo pBluescriptII SK(-) and pBK-CMV

<img file="MX381306B_D0037.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL (Stratagene), y plásmidos derivados de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pREP4, pCEP4 (Invitrogen) o pPoly (Ver por ejemplo, Lathe et al., Gene 57:193-201 [1987]).

Por lo tanto, en algunas modalidades, un vector que comprende una secuencia que codifica al menos una variante PGA se transforma en una célula huésped para permitir la propagación del vector y la expresión de los PGA variantes. En algunas modalidades, el PGA variante se modifica postraduccionalmente para eliminar el péptido de señal y, en algunos casos, pueden escindirse después de la secreción. En algunas modalidades, la célula huésped transformada descrita anteriormente se cultiva en un medio nutriente adecuado en condiciones que permiten la expresión del PGA variante. Cualquier medio adecuado útil para cultivar las células huésped encuentra uso en la presente invención, que incluye, pero no se limita a, medios mínimos o complejos que contienen suplementos apropiados. En algunas modalidades, las células huésped se cultivan en medios HTP. Los medios adecuados están disponibles de varios proveedores comerciales o pueden prepararse de acuerdo con recetas publicadas (por ejemplo, en catálogos de la American Type Culture Collection).

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula huésped que comprende por lo menos un polinucleótido que codifica por lo menos un polipéptido de PGA diseñado provisto en la presente, el polinucleótido está operativamente enlazado a una o más secuencias de control para la expresión de las enzimas de PGA diseñado en la célula huésped. Las células huésped para usarse en la expresión de los polipéptidos de PGA codificados por los vectores de expresión de la presente invención son conocidos por los expertos en la técnica e incluyen por ejemplo células bacterianas tales como células de E. coli, Bacillus megaterium, Lactobacillus kéfir, Streptomyces y Salmonella typhimurium ; células fúngicas, tales como células de levadura (por ejemplo, Saccharomyces cerevisiae o Pichia pastoris (ATCC No. de acceso 201178)); células de insecto como células de Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como CHO, COS, BHK, 293, y células de melanoma Bowes; y células vegetales. Las condiciones adecuadas del medio de cultivo y de crecimiento para las células huésped son bien conocidas en la técnica.

Los polinucleótidos para la expresión del PGA pueden introducirse en las células mediante diversos métodos conocidos en la técnica. Las técnicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a electroporación, bombardeo de partículas biolísticas, transfección mediada por liposomas, transfección de cloruro de calcio, y fusión de protoplastos. Varios medios para introducción de polinucleótidos en las células son conocidos por los expertos en la técnica.

En algunas modalidades, la célula huésped es una célula eucariota. Las células huésped eucariotas adecuadas incluyen, por ejemplo, células fúngicas, células de algas, células de insectos y células vegetales. Las células huésped fúngicas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, Ascomycota, Basidiomycota, Deuteromycota, Zygomycota, Fungí imperfecti. En algunas

<img file="MX381306B_D0038.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL modalidades, las células huésped fúngicas son células de levadura y células fúngicas filamentosas. Las células huésped fúngicas filamentosas de la presente invención incluyen todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina y Oomycota. Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta de quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Las células huésped fúngicas filamentosas de la presente invención son morfológicamente distintas a la levadura.

En algunas modalidades de la presente invención, las células huésped fúngicas filamentosas son de cualquier género y especie adecuada que incluye por ejemplo Achlya, Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Cephalosporium, Chrysosporium, Cochliobolus, Corynascus, Cryphonectría, Cryptococcus, Coprinus, Coriolus, Diplodia, Endothis, Fusarium, Gibberella, Gliocladium, Humicola, Hypocrea, Myceliophthora, Mucor, Neurospora, Penicillium, Podospora, Phlebia, Piromyces, Pyricularia, Rhizomucor, Rhizopus, Schizophyllum, Scytalidium, Sporotrichum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Trametes, Tolypocladium, Trichoderma, Verticillium, y/o Volvariella, y/o teleomorfos, o anamorfos, y sinónimos, basónimos o equivalentes taxonómicos de los mismos.

En algunas modalidades de la presente invención, la célula huésped es una célula de levadura que incluye por ejemplo las especies Candida, Hansenula, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Pichia, Kluyveromyces, or Yarrowia. En algunas modalidades de la presente invención, la célula de levadura es Hansenula polymorpha, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces norbensis, Saccharomyces kluyveri, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia finlandica, Pichia trehalophila, Pichia kodamae, Pichia membranaefaciens, Pichia opuntiae, Pichia thermotolerans, Pichia salictaria, Pichia quercuum, Pichia pijperi, Pichia stipitis, Pichia methanolica, Pichia angusta, Kluyveromyces lactis, Candida albicans, o Yarrowia lipolytica.

En algunas modalidades de la invención, la célula huésped es una célula de algas tales como Chlamydomonas (e.g., C. reinhardtii) y Phormidium (P. sp. ATCC29409).

En algunas otras modalidades, la célula huésped es una célula procariota. Las células procariotas adecuadas incluyen, pero no se limitan a, células bacterianas Gram-positivas, Gram-negativas y Gram-variables. Cualquier organismo bacteriano adecuado se usa en la presente invención, por ejemplo Agrobacterium, Alicyclobacillus, Anabaena, Anacystis, Acinetobacter, Acidothermus, Arthrobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Brevibacterium, Butyrivibrio, Buchnera, Campestris, Camplyobacter, Clostridium, Corynebacterium, Chromatium, Coprococcus, Escherichia, Enterococcus, Enterobacter, Erwinia, Fusobacterium, Faecalibacterium, Francisella, Flavobacterium, Geobacillus, Haemophilus, Helicobacter, Klebsiella, Lactobacillus, Lactococcus, Ilyobacter, Micrococcus, Microbacterium, Mesorhizobium, Methylobacterium, Methylobacterium,

<img file="MX381306B_D0039.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

Mycobacterium, Neisseria, Pantoea, Pseudomonas, Prochlorococcus, Rhodobacter, Rhodopseudomonas, Rhodopseudomonas, Roseburia, Rhodospirillum, Rhodococcus, Scenedesmus, Streptomyces, Streptococcus, Synecoccus, Saccharomonospora, Staphylococcus, Serratia, Salmonella, Shigella, Thermoanaerobacterium, Tropheryma, Tularensis, Temecula, Thermosynechococcus, Thermococcus, Ureaplasma, Xanthomonas, Xylella, Yersinia y Zymomonas. En algunas modalidades, la célula huésped es una especie de Agrobacterium, Acinetobacter, Azobacter, Bacillus, Bifidobacterium, Buchnera, Geobacillus, Campylobacter, Clostridium, Corynebacterium, Escherichia, Enterococcus, Erwinia, Flavobacterium, Lactobacillus, Lactococcus, Pantoea, Pseudomonas, Staphylococcus, Salmonella, Streptococcus, Streptomyces, o Zymomonas. En algunas modalidades, la cepa huésped bacteriana es no patogénica a los humanos. En algunas modalidades, la cepa huésped bacteriana es una cepa industrial. Numerosas cepas industriales bacterianas son conocidas y adecuadas en la presente invención. En algunas modalidades de la presente invención, la célula huésped bacteriana es una especie Agrobacterium (por ejemplo, A. radiobacter, A. rhizogenes, y A. rubí). En algunas modalidades de la presente invención, la célula huésped bacteriana es una especie Arthrobacter (por ejemplo., A. aurescens, A. citreus, A. globiformis, A. hydrocarboglutamicus, A. mysorens, A. nicotianae, A. paraffineus, A. protophonniae, A. roseoparqffinus, A. sulfureus, y A. ureafaciens). En algunas modalidades de la presente invención, la célula huésped bacteriana es una especie Bacillus (por ejemplo., B. thuringensis, B. anthracis, B. megaterium, B. subtilis, B. lentus, B. circulans, B. pumilus, B. lautus, B.coagulans, B. brevis, B. firmus, B. alkaophius, B. licheniformis, B. clausii, B. stearothermophilus, B. halodurans, y B. amyloliquefaciens). En algunas modalidades, la célula huésped es una cepa industrial de Bacillus que incluye por ejemplo B. subtilis, B. pumilus, B. licheniformis, B. megaterium, B. clausii, B. stearothermophilus, o B. amyloliquefaciens. En algunas modalidades, las células huésped Bacillus son B. subtilis, B. licheniformis, B. megaterium, B. stearothermophilus, y/o B. amyloliquefaciens. En algunas modalidades, la célula huésped bacteriana es una especie Clostridium (por ejemplo, C. acetobutylicum, C. tetani E88, C. lituseburense, C. saccharobutylicum, C. perfringens, y C. beijerinckii). En algunas modalidades, la célula huésped bacteriana es una especie Corynebacterium (por ejemplo., C. glutamicum y C. acetoacidophilum). En algunas modalidades, la célula huésped bacteriana es una especie Escherichia (por ejemplo., E. coli). En algunas modalidades, la célula huésped bacteriana es una especie Erwinia (por ejemplo., E. uredovora, E. carotovora, E. ananas, E. herblcola, E. punctata, y E. terreus). En algunas modalidades, la célula huésped bacteriana es una especie Pantoea (por ejemplo., P. citrea, y P. agglomerans). En algunas modalidades, la célula huésped bacteriana es una especie Pseudomonas (por ejemplo., P. putida, P. aeruginosa, P. mevalonii, y P. sp. D-01 10). En algunas modalidades, la célula huésped bacteriana es una especie Streptococcus (por ejemplo., S. equisimiles, S. pyogenes, y S. uberis). En algunas modalidades, la

<img file="MX381306B_D0040.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL célula huésped bacteriana es una especie Streptomyces (por ejemplo., S. ambofaciens, S. achromogenes, S. avermitilis, S. coelicolor, S. aureofaciens, S. aureus, S. fungicidicus, S. griseus, y S. lividans). En algunas modalidades, la célula huésped bacteriana es una especie Zymomonas (por ejemplo., Z. mobilis, y Z. lipolytica).

Una célula huésped ejemplar es Escherichia coli W3110. El vector de expresión se creó uniendo operativamente un polinucleótido que codifica un PGA mejorado en el plásmido pCK110900 unido operativamente al promotor lac bajo el control del represor lacl. El vector de expresión también contiene el origen de replicación de P15a y el gen de resistencia a doranfenicol. Las células que contienen el polinucleótido sujeto en Escherichia coli W3110 se aislaron sometiendo las células a la selección de doranfenicol.

Muchas cepas procariotas y eucariotas que se usan en la presente invención están disponibles para el público de varias colecciones de cultivo tales como Recolección de Cultivos Tipo Americano (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), y la Colección de Cultivos de Patentes del Servicio de Investigación Agrícola, Centro de Investigación Regional del Norte (NRRL).

En algunas modalidades, las células huésped se modifican genéticamente para que tengan características que mejoran la secreción de proteínas, la estabilidad de proteínas y/u otras propiedades deseables para la expresión y/o la secreción de una proteína. La modificación genética se puede lograr mediante técnicas de ingeniería genética y/o técnicas microbiológicas clásicas (por ejemplo., mutagénesis química o UV y la selección subsecuente). De hecho, en algunas modalidades, se usan combinaciones de modificación recombinante y técnicas de selección clásicas para producir las células huésped. Usando tecnología recombinante, las moléculas de ácido nucleico pueden introducirse, eliminarse, inhibirse o modificarse, de manera que se obtengan rendimientos aumentados de variante(s) de PGA dentro de la célula huésped y/o en el medio de cultivo. Por ejemplo, la exclusión genética de la función Alpl da como resultado una célula que es deficiente en proteasa, y la exclusión genética de la función pyr5 da como resultado una célula con un fenotipo deficiente en pirimidina. En un enfoque de ingeniería genética, la recombinación homologa se usa para inducir modificaciones genéticas específicas dirigiéndose específicamente a un gen in vivo para suprimir la expresión de la proteína codificada. En enfoques alternativos, la tecnología ARNip, antisentido y/o ribozima se usa para inhibir la expresión génica. Se conocen en la técnica una variedad de métodos para reducir la expresión de proteínas en las células, que incluyen, pero no se limitan a la deleción de todo o parte del gen que codifica la proteína y la mutagénesis específica del sitio para interrumpir la expresión o actividad del producto génico. (Ver por ejemplo., Chaveroche et al., Nucí. Acids Res., 28:22 e97 [2000]; Cho et al., Molec. Plant Microbe Interact., 19:7-15 [2006]; Maruyama and Kitamoto, Biotechnol Lett., 30:1811-1817 [2008]; Takahashi et al., Mol. Gen.

<img file="MX381306B_D0041.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

Genom., 272: 344-352 [2004]; and You et al. , Arch. Micriobiol.,191:615-622 [2009], las cuales están incorporadas a manera de referencia en la presente). La mutagénesis aleatoria, seguida del cribado para mutaciones deseadas también tiene uso (Ver por ejemplo, Combier et al., FEMS Microbiol. Lett., 220:141-8 [2003]; y Firon et al., Eukary. Cell 2:247-55 [2003], ambas incorporadas a manera de referencia).

La introducción de un vector o constructo de ADN en una célula huésped puede llevarse a cabo usando cualquier método adecuado conocido en la técnica, que incluye pero no se limita a transfección de fosfato de calcio, transfección mediada por DEAE-Dextrano, transformación mediada por PEG, electroporación u otras técnicas comunes conocidas en la técnica.

En algunas modalidades, las células huésped modificadas (es decir, células huésped recombinantes) de la presente invención se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados según sea apropiado para activar promotores, seleccionar transformantes o amplificar el polinucleótido de PGA. Las condiciones de cultivo, tales como la temperatura, el pH y similares, son las utilizadas previamente con la célula huésped seleccionada para la expresión, y son bien conocidas por los expertos en la técnica. Como se ha señalado, muchas referencias y textos estándar están disponibles para el cultivo y la producción de muchas células, incluidas las células de origen bacteriano, vegetal, animal (especialmente mamífero) y arqueobacteriano.

En algunas modalidades, las células que expresan los polipéptidos de PGA variantes de la invención se cultivan bajo condiciones de fermentación discontinua o continua. La fermentación por lotes clásica es un sistema cerrado, en el que las composiciones del medio se establecen al comienzo de la fermentación y no están sujetas a alteraciones artificiales durante la fermentación. Una variación del sistema por lotes es una fermentación de lote alimentado que también se usa en la presente invención. En esta variación, el sustrato se agrega en incrementos a medida que avanza la fermentación. Los sistemas de lotes alimentados son útiles cuando es probable que la represión de catabolitos inhiba el metabolismo de las células y donde sea deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. Las fermentaciones por lotes y de lotes alimentados son comunes y conocidos en la técnica. La fermentación continua es un sistema abierto donde se agrega continuamente un medio de fermentación definido a un biorreactor y se elimina simultáneamente una cantidad igual de medio acondicionado para su procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene los cultivos a una alta densidad constante donde las células están principalmente en crecimiento de fase logarítmica. Los sistemas de fermentación continua se esfuerzan por mantener las condiciones de crecimiento en estado estable. Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua, así como técnicas para maximizar la velocidad de formación del producto, son bien conocidos en la técnica de la microbiología industrial.

<img file="MX381306B_D0042.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

En algunas modalidades de la presente invención, los sistemas de transcripción/traducción sin células encuentran uso en la producción de PGA(s) variante(s). Varios sistemas están disponibles comercialmente y los métodos son bien conocidos por los expertos en la técnica.

La presente invención proporciona métodos para fabricar polipéptidos de PGA variantes o fragmentos biológicamente activos de los mismos. En algunas modalidades, el método comprende: proporcionar una célula huésped transformada con un polinucleótido que codifica una secuencia de aminoácidos que comprende al menos aproximadamente el 70% (o al menos aproximadamente el 75%, al menos aproximadamente el 80%, al menos aproximadamente el 85%, al menos aproximadamente el 90%, al menos aproximadamente el 95%, al menos aproximadamente el 96%, al menos aproximadamente el 97%, al menos aproximadamente el 98%, o al menos aproximadamente el 99%) identidad de secuencia con la SEQ ID NO:2 y que comprende al menos una mutación como se proporciona en la presente; cultivar la célula huésped transformada en un medio de cultivo en condiciones en las que la célula huésped expresa el polipéptido de PGA variante codificado; y opcionalmente recuperar o aislar el polipéptido de PGA de variante expresado, y/o recuperar o aislar el medio de cultivo que contiene el polipéptido de PGA de variante expresada. En algunas modalidades, los métodos además proporcionan opcionalmente lisis a las células huésped transformadas después de expresar el polipéptido de PGA codificado y, opcionalmente, recuperar y/o aislar el polipéptido de PGA variante expresado del lisado celular. La presente invención proporciona además métodos para hacer un polipéptido de PGA variante que comprende cultivar una célula huésped transformada con un polipéptido de PGA variante en condiciones adecuadas para la producción del polipéptido de PGA variante y recuperar el polipéptido de PGA variante. Típicamente, la recuperación o aislamiento del polipéptido de PGA es del medio de cultivo de células huésped, la célula huésped o ambas, usando técnicas de recuperación de proteínas que son bien conocidas en la técnica, incluidas las descritas en este documento. En algunas modalidades, las células huésped se recogen por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos, y el extracto crudo resultante se retiene para una posterior purificación. Las células microbianas empleadas en la expresión de proteínas se pueden alterar por cualquier método conveniente, que incluye, pero no se limita a ciclos de congelación-descongelación, sonicación, interrupción mecánica y/o uso de agentes de lisis celular, así como muchos otros métodos adecuados conocidos por los expertos en la técnica.

Las enzimas de PGA diseñadas expresadas en una célula huésped son recuperadas de las células y/o el medio de cultivo usando cualquiera una o más de las técnicas bien conocidas para la purificación de proteínas, incluyendo, entre otras, tratamiento de lisozima, sonicación, filtración, remoción de sales, ultra-centrifugación, y cromatografía. Las soluciones adecuadas para lisado y la extracción de alta eficiencia de proteínas de bacterias, tales como E. coli, están

<img file="MX381306B_D0043.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL comercialmente disponibles bajo el nombre comercial CelLytic BTM (Sigma-Aldrich). Por lo tanto, en algunas modalidades, el polipéptido resultante se recupera/aísla y opcionalmente se purifica mediante cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en algunas modalidades, el polipéptido se aísla del medio nutriente mediante procedimientos convencionales que incluyen, pero no se limitan a, centrifugación, filtración, extracción, secado por aspersión, evaporación, cromatografía (por ejemplo, intercambio iónico, afinidad, interacción hidrófoba, cromatofocalización y exclusión de tamaño) o precipitación. En algunas modalidades, las etapas de replegamiento de proteínas se usan, según se desee, para completar la configuración de la proteína madura. Además, en algunas modalidades, la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se emplea en las etapas de purificación final. Por ejemplo, en algunas modalidades, los métodos conocidos en la técnica, encuentran uso en la presente invención (Véase, por ejemplo, Parry et al., Biochem. 1, 353:117 [2001]; and Hong et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 73:1331 [2007], ambas incorporadas a la presente a manera de referencia.) De hecho, cualquier método de purificación adecuado conocido en la técnica encuentra uso en la presente invención.

Las técnicas cromatográficas para el aislamiento del polipéptido de PGA incluyen, pero no están limitadas a cromatografía en fase inversa, cromatografía líquida de alta resolución, cromatografía de intercambio iónico, electroforesis en gel y cromatografía de afinidad. Las condiciones para purificar una enzima particular dependerán, en parte, en factores tal como la carga neta, hidrofobicidad, hidrofilicidad, peso molecular, forma molecular, etc., y serán evidentes para los expertos en la técnica.

En algunas modalidades, las técnicas de afinidad pueden usarse para aislar las enzimas mejoradas de PGA. Para la purificación por cromatografía de afinidad, se puede utilizar cualquier anticuerpo que específicamente se une a un polipéptido PGA. Para la producción de anticuerpos, varios animales huésped, incluyendo sin limitación conejos, ratones, ratas, etc., son inmunizados por inyección con el PGA. El polipéptido PGA puede estar unido a un portador adecuado, tal como BSA, por medio de un grupo funcional de una cadena lateral o enlazadores unidos a un grupo funcional de cadena lateral. Se pueden usar diversos adyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de la especie huésped, que incluye, pero no se limita a, geles minerales de Freund (completos e incompletos) tales como hidróxido de aluminio, sustancias activas de superficie tales como lisolecitina, polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones de aceite, lapa californiana, dinitrofenol y adyuvantes humanos potencialmente útiles, como BCG (Bacillus Calmette Guerin) y Corynebacterium parvum.

En algunas modalidades, las variantes de PGA se preparan y usan en forma de células que expresan las enzimas, como extractos crudos, o como preparaciones aisladas o purificadas. En algunas modalidades, las variantes de PGA se preparan como liofilizados, en forma

<img file="MX381306B_D0044.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL de polvo (por ejemplo, polvos de acetona), o se preparan como soluciones de enzimas. En algunas modalidades, las variantes de PGA están en forma de preparaciones sustancialmente puras.

En algunas modalidades, los polipéptidos de PGA están unidos a cualquier sustrato sólido adecuado. Los sustratos sólidos incluyen, pero no están limitados a, una fase sólida, superficie y/o membrana. Los soportes sólidos incluyen, pero no se limitan a, polímeros orgánicos tales como poliestireno, polietileno, polipropileno, polifluoroetileno, polietilenoxi y políacrilamida, así como copolímeros e injertos de los mismos. Un soporte sólido también puede ser inorgánico, como vidrio, sílice, vidrio de poro controlado (CPG), sílice de fase inversa o metal, como el oro o el platino. La configuración del sustrato puede estar en forma de perlas, esferas, partículas, gránulos, un gel, una membrana o una superficie. Las superficies pueden ser planas, sustancialmente planas o no planas. Los soportes sólidos pueden ser porosos o no porosos, y pueden tener características de hinchamiento o no hinchamiento. Un soporte sólido se puede configurar en forma de pozo, depresión u otro contenedor, recipiente, característica o ubicación. Se puede configurar una pluralidad de soportes en una disposición en varias ubicaciones, direccionables para la entrega robótica de reactivos, o mediante métodos y/o instrumentos de detección.

En algunas modalidades, los métodos inmunológicos se usan para purificar las variantes de PGA. En un enfoque, se inmoviliza el anticuerpo generado contra un polipéptido de PGA variante (por ejemplo, contra un polipéptido que comprende cualquiera de las SEQ ID NOS:2, 4, 6, 8,10 ó 12 y/o un fragmento inmunogénico del mismo) usando métodos convencionales en perlas, mezclado con medios de cultivo celular en condiciones en las que el PGA variante está unido y precipitado. En un enfoque relacionado, la inmunocromatografía encuentra uso.

En algunas modalidades, los PGA variantes se expresan como una proteína de fusión que incluye una porción no enzimática. En algunas modalidades, la secuencia de PGA variante se fusiona a un dominio que facilita la purificación. Como se usa en este documento, el término dominio que facilita la purificación se refiere a un dominio que media la purificación del polipéptido al que está fusionado. Los dominios de purificación adecuados incluyen, pero no se limitan a péptidos quelantes de metal, módulos de histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados, una secuencia que se une a glutatión (por ejemplo, GST), una etiqueta de hemaglutinina (HA) (correspondiente a un epítopo derivado de proteína de hemaglutinina de la gripe; véase, por ejemplo, Wilson et al., Cell 37:767 [1984]), secuencias de proteína de unión a maltosa, el epítopo FLAG utilizado en el sistema de purificación de afinidad/extensión FLAGS (por ejemplo, el sistema disponible de Immunex Corp) y similares. Un vector de expresión contemplado para usarse en las composiciones y métodos descritos en este documento proporciona la expresión de una proteína de fusión que comprende un polipéptido de la invención fusionado a una región de polihistidina separada por un sitio de escisión de enteroquinasa. Los residuos de hlstidina facilitan la

<img file="MX381306B_D0045.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL purificación en IMIAC (cromatografía de afinidad de iones metálicos inmovilizados; véanse, por ejemplo, Porath et al., Prot. Exp. Purif., 3: 263-281 [1992]) mientras que el sitio de escisión de la enteroquinasa proporciona un medio para separar el polipéptido de la variante de PGA de la proteína de fusión. Los vectores pGEX (Promega) también se pueden usar para expresar polipéptidos extraños como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de células lisadas por adsorción a perlas de agarosa de ligando (p. ej., glutatión-agarosa en el caso de fusiones de GST) seguido de elución en presencia de ligando libre.

Experimental

Varias características y modalidades de la divulgación se ilustran en los siguientes ejemplos representativos, que están destinados a ser ilustrativos, y no limitativos.

En los procedimientos experimentales que se describen a continuación, pueden utilizarse las siguientes abreviaturas: ppm (partes por millón); M (molar); mM (milimolar), uM y μΜ (micromolar); nM (nanomolar); mol (moles); gm y g (gram); mg (miligramos); ug y pg (microgramos); L y I (litro); mi y mL (mililitro); cm (centímetros); mm (milímetros); um y pm (micrometros); seg. (segundos); min(s) (minuto(s)); h(s) y hr(s) (hora(s)); U (unidades); MW (peso molecular); rpm (rotaciones por minuto); °C (grados centígrados); RT (temperatura ambiente); CDS (secuencia codificadora); DNA (ácido desoxirribonucleico); RNA (ácido ribonucleico); TB (Caldo Terrific; 12 g/L bacto-triptona, 24 g/L extracto de levadura, 4 mL/L glicerol, 65 mM fosfato de potasio, pH 7.0, 1 mM MgSO4); CAM (cloranfenicol); PMBS (sulfato polimixin B); IPTG (isopropil tiogalactosida); TFA (ácido trifluoroacético); HPLC (cromatografía de líquidos de alto rendimiento); FIOPC (mejora de plegado sobre control positivo); HTP (alto rendimiento); LB (caldo Luria); Codexis (Codexis, Inc., Redwood City, CA); Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO); Millipore (Millipore, COrp., Billerica MA); Difeo (Difeo Laboratories, BD Diagnostic Systems, Detroit, MI); Daicel (Daicel, West Chester, PA); Genetix (Genetix USA, Inc., Beaverton, OR); Molecular Devices (Molecular Devices, LLC, Sunnyvale, CA); Applied Biosystems (Applied Biosystems, part of Life Technologies, Corp., Grand Island, NY), Agilent (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA); Thermo Scientific (part of Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA); (Infors; Infors-HT, Bottmingen/Basel, Switzerland); Corning (Corning, Inc., Palo Alto, CA); and Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA); Microfluidics (Microfluidics Corp., Newton, MA, United States of America).

Las siguientes secuencias tienen uso en la presente invención.

<img file="MX381306B_D0046.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

SEQ ID NO:1 (Secuencia de polinudeótidos WT de PGA)

ATGAAAAATAGAAATCGTATGATCGTGAACGGTATTGTGACTTCCCTGATCTGTTGTTCTA GCCTGTCAGCGCTGGCGGCAAGCCCGCCAACCGAGGTTAAGATCGTTCGCGATGAATACGGCATGCCGCATA TTTACGCCGATGATACCTATCGACTGTTTTACGGCTATGGCTACGTGGTGGCGCAGGATCGCCTGTTCCAGA TGGAAATGGCGCGCCGCAGTACTCAGGGGACCGTCTCCGAGGTGCTGGGCAAAGCATTCGTCAGrTTTGATA AAGATATTCGCCAGAACTACTGGCCGGATTCTATTCGCGCGCAGATAGCTTCCCTCTCCGCTGAGGATAAATC CATTCTGCAGGGCTATGCCGATGGCATGAATGCGTGGATCGATAAAGTGAACGCCAGCCCCGATAAGCTGTT ACCCCAGCAGTTCTCCACCTTTGGTTTTAAACCCAAGCATTGGGAACCGTTTGATGTGGCGATGATnTTGTC GGCACCATGGCGAACCGGTTTTCTGACAGCACCAGCGAAATTGATAACCTGGCGCTGCTGACGGCGCTAAAA GATAAATACGGCAAGCAGCAGGGCATGGCGGTCTTTAACCAGCTGAAATGGCTGGTTAATCCTTCCGCGCCA ACCACCATTGCGGCGCGGGAAAGCGCCTATCCGCTGAAGTTTGATCTGCAAAACACGCAAACGGCGGCGCTG CTGCCGCGCTACGACCAGCCGGCACCGATGCTCGACCGCCCGGCAAAAGGGACCGATGGCGCGCrGCTGGC GCTGACCGCCGATCAGAACCGGGAAACTATCGCCGCGCAGTTCGCGCAAAGCGGCGCTAACGGCCTGGCTGG CTACCCGACCACTAGCAATATGTGGGTGATTGGCAAAAACAAAGCCCAGGATGCGAAGGCCATTATGGTCAA TGGGCCGCAGTTTGGTTGGTATGCGCCGGCGTACACCTACGGTATCGGCCTGCACGGCGCGGGCTATGACG TCACCGGCAATACGCCGTTTGCCTATCCGGGCCTCGTTTTTGGTCACAACGGCACCATTTCATGGGGATCCAC CGCCGGTTTTGGTGATGATGTCGATATCTTTGCCGAAAAACrTTCCGCCGAGAAGCCGGGCTATTACCAGCA TAACGGCGAGTGGGTGAAGATGTTGAGCCGCAAGGAGACTATTGCGGTCAAAGACGGCCAGCCGGAGACCT TTACCGTTTGGCGCACGCrGCACGGCAACGTCATTAAAACCGATACTGCGACGCAGACCGCCTATGCCAAAGC GCGCGCCTGGGATGGCAAAGAGGTGGCGTCCCTGCrGGCGTGGACGCACCAGATGAAGGCCAAAAACTGGC CGGAGTGGACGCAGCAGGCGGCCAAACAGGCGCTGACCATTAACTGGTACTACGCCGATGTGAACGGCAATA TCGGCTATGTGCATACCGGCGCCTATCCGGATCGCCAGCCCGGCCACGACCCGCGTTTGCCGGTTCCCGGCA CTGGAAAATGGGACTGGAAAGGGTTGCTGTCGTTTGATTTGAATCCGAAAGTGTATAACCCGCAGTCGGGCT ATATCGCCAACTGGAACAACTCGCCGCAAAAAGACTACCCGGCCTCTGATCTGTTCGCGTTCCTGTGGGGCG GTGCGGATCGAGTTACTGAGATCGACACGATCCTCGATAAGCAACCGCGCTTCACCGCCGATCAGGCGTGGG ATGTGATCCGCCAAACCAGCCGTCGGGATCrCAACCTGCGGTTGTTCTTACCGGCGCTGAAGGACGCCACCG CGAACCTGGCGGAAAACGATCCGCGCCGCCAACTGGTGGATAAACTGGCGAGCTGGGACGGTGAAAACCTTG TCAACGATGACGGAAAAACCTATCAGCAACCGGGATCGGCGATTCTTAACGCCTGGCTGACCAGCATGCTCAA GCGCACGGTGGTTGCCGCGGTCCCAGCGCCGTTTGGCAAGTGGTACAGCGCCAGTGGCTATGAAACCACCCA GGACGGGCCAACCGGCTCGCTGAACATCAGCGTGGGGGCGAAAATCCTCrACGAAGCTCTGCAGGGTGATAA GTCGCCAATCCCGCAGGCGGTCGATCTGTTTGGCGGGAAACCGCAGCAGGAAGTGATACTGGCGGCGCTGG ACGACGCTTGGCAGACGCTGTCAAAACGCTACGGTAACGACGTCACCGGCTGGAAAACCCCTGCCATGGCGC TTACCTTCCGGGCCAATAACTTCTTCGGCGTGCCGCAGGCGGCAGCAAAAGAGGCGCGTCATCAGGCGGAGT ACCAGAACCGCGGTACGGAAAACGACATGATTGTCTTCTCACCGACGTCGGGTAACCGCCCGGTTCTTGCCT GGGATGTGGTGGCGCCGGGGCAAAGCGGTTTTATCGCGCCGGATGGCAAAGCCGATAAGCACTATGACGAT

<img file="MX381306B_D0047.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

CAGCTGAAAATGTACGAGAGCTTTGGCCGTAAATCGCTGTGGTTAACGCCTCAGGACGTTGACGAGCACAAA

GAGTCTCAGGAAGTGCTGCAGGTACAGCGCTAA (SEQ ID NO:1)

SEQ ID NO:2 (Secuencia de polipéptidos WT de PGA)

MKNRNRMIVNGIVTSLICCSSLSALAASPPTEVKIVRDEYGMPHIYADDTYRLFYGYGYWAQ DRLFQMEMARRSTQGTVSEVLGKAFVSFDKDIRQNYWPDSIRAQIASLSAEDKSILQGYADGMNAWIDKVNASP DKLLPQQFSTFGFKPKHWEPFDVAMIFVGTMANRFSDSTSEIDNLALLTALKDKYGKQQGMAVFNQLKWLVNPS APTnAARESAYPLKFDLQNTQTAALLPRYDQPAPMLDRPAKGTDGALLALTADQNREnAAQFAQSGANGLAGY PTTSNMWVIGKNKAQDAKAIMVNGPQFGWYAPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLVFGHNGnSWGSTA GFGDDVDIFAEKLSAEKPGYYQHNGEWVKMLSRKETIAVKDGQPETFTVWRTLHGNVIKTDTATQTAYAKARA WDGKEVASLLAWTHQMKAKNWPEWTQQAAKQALTINWYYADVNGNIGYVHTGAYPDRQPGHDPRLPVPGTG KWDWKGLLSFDLNPKVYNPQSGYIANWNNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRVTEIDTILDKQPRFTADQAWDVI RQTSRRDLNLRLFLPALKDATANLAENDPRRQLVDKLASWDGENLVNDDGKTYQQPGSAILNAWLTSMLKRTV VAAVPAPFGKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGAKILYEALQGDKSPIPQAVDLFGGKPQQEVILAALDDAWQTL SKRYGNDVTGWKTPAMALTFRANNFFGVPQAAAKEARHQAEYQNRGTENDMIVFSPTSGNRPVLAWDWAPG QSGFIAPDGKADKHYDDQLKMYESFGRKSLWLTPQDVDEHKESQEVLQVQR (SEQ ID NO:2)

SEQ ID NO:3 (Secuencia de polinudeótidos de variante 1 de PGA)

AGCAATATGTGGGTGATTGGCAAAAACAAAGCCCAGGATGCGAAGGCCATTATGGTCAATG GGCCGCAGTTTGGTTGGTATGTGCCGGCGTACACCTACGGTATCGGCCTGCACGGCGCGGGCTATGACGTCA CCGGCAATACGCCGTTTGCCTATCCGGGCCTCGTTTTTGGTCACAACGGCACCATTTCATGGGGATCCACCGC CGGTGGTGGTGATGATGTCGATATCTTTGCCGAAAAACTTTCCGCCGAGAAGCCGGGCTATTACCAGCATAA CGGCGAGTGGGTGAAGATGTTGAGCCGCAAGGAGACTATTGCGGTCAAAGACGGCCAGCCGGAGACCTTTA CCGTTTGGCGCACGCTGCACGGCAACGTCATTAAAACCGATACTGCGACGCAGACCGCCTATGCCAAAGCGC GCGCCTGGGATGGCAAAGAGGTGGCGTCCCrGCTGGCGTGGACGCACCAGATGAAGGCCAAAAACTGGCCG GAGTGGACGCAGCAGGCGGCCAAACAGGCGCTGACCATTAACTGGTACTACGCCGATGTGAACGGCAATATC GGCTATGTGCATACCGGCGCCTATCCGGATCGCCAGCCCGGCCACGACCCGCGTTTGCCGGTTCCCGGCACT GGAAAATGGGACTGGAAAGGGTTGCTGTCGTTTGATTTGAATCCGAAAGTGTATAACCCGCAGTCGGGCTAT ATCGCCAACTGGAACAACTCGCCGCAAAAAGACrACCCGGCCrCTGATCTGTTCGCGTTCCTGTGGGGCGGT GCGGATCGAGTTACTGAGATCGACACGATCCTCGATAAGCAACCGCGCTTCACCGCCGATCAGGCGrGGGAT GTGATCCGCCAAACCAGCCGTCGGGATCTCAACCTGCGGTTGTTCTTACCGGCGCTGAAGGACGCCACCGCG AACCTGGCGGAAAACGATCCGCGCCGCCAACTGGTGGATAAACTGGCGAGCTGGGACGGCGAAAACCTTGrC AACGATGACGGAAAAACCTATCAGCAACCGGGATCGGCGAITCTTAACGCCTGGCTGACCAGCATGCTCAAG CGCACGGTGGTTGCCGCGGTCCCAGCGCCGTTTGGTAAGTGGTACAGCGCCAGTGGCIATGAAACCACCCAG GACGGGCCAACCGGCTCGCTGAACATCAGCGTGGGGGCGAAAATCCTCTACGAAGCrCTGCAGGGTGATAAG

<img file="MX381306B_D0048.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

TCGCCAATCCCGCAGGCGGTCGATCTGTTTGGCGGGAAACCGCAGCAGGAAGTAATACTGGCGGCGCTGGAC GACGCTTGGCAGACGCTGTCAAAACGCTACGGTAACGACGTCACCGGCTGGAAAACCCCTGCCATGGCGCTT ACCTTCCGGGCCAATAACTTCTTCGGCGTGCCGCAGGCGGCAGCAAAAGAGGCGCGTCATCAGGCGGAGTAC CAGAACCGCGGTACGGAAAACGACATGATTGTCTTCTCACCGACGTCGGGTAACCGCCCGGTTCTTGCCTGG GATGTGGTGGCGCCGGGGCAAAGCGGTTTTATCGCGCCGGATGGCAAAGCCGATAAGCACTATGACGATCAG CTGAAAATGTACGAGAGCTTTGGCCGTAAATCGCTGTGGTTAACGCCTCAGGACGTTGACGAGCACCAAGAG TCTCAGGAAGTGCTGCAGGTACAGTTGGATCAGACCGAGGTTAAGATCGTTCGCGATGAATACGGCATGCCG CATATTTACGCCGATGATACCTATCGACTGTTTTACGGCTATGGCTACGTGGTGGCGCAGGATCGCCTGTTCC AGATGGAAATGGCGCGCCGCAGTACTCAGGGGACCGTCTCCGAGGTGCTGGGCAAAGCATTCGTCAGTTTTG ATAAAGATATTCGCCAGAACTACTGGCCGGATTCTATTCGCGCGCAGATAGCTTCCCTCTCCGCTGAGGATAA ATCCATTCTGCAGGGCTATGCCGATGGCATGAATGCGTGGATCGATAAAGTGAACGCCAGCCCCGATAAGCT GTTACCCCAGCAGTTCTCCACCTTTGGTTTTAAACCCAAGCATTGGGAACCGTTTGATGTGGCGATGATTTTT GTCGGCACCATGGCGAACCGTTTCTCTGACAGCACCAGCGAAATTGATAACCTGGCGCTGCTGACGGCGCTA AAAGACAAATACGGCAAGCAGCAGGGCATGGCGGTCTTTAACCAGCTGAAATGGCTGGTTAATCCTTCCGCG CCAACCACCATTGCGGCGCGGGAAAGCGCCTATCCGCTGAAGTTTGATCTGCAAAACACGCAAACGGCGTAA (SEQ ID NO:3)

SEQ ID NO:4 (Secuencia de polipéptidos de variante 1 de PGA)

SNMWVIGKNKAQDAKAIMVNGPQFGWYVPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLVFGHNG nSWGSTAGGGDDVDIFAEKLSAEKPGYYQHNGEWVKMLSRKETIAVKDGQPETFTVWRTLHGNVIKTDTATQ TAYAKARAWDGKEVASLLAWTHQMKAKNWPEWTQQAAKQALTINWYYADVNGNIGYVHTGAYPDRQPGHDP RLPVPGTGKWDWKGLLSFDLNPKVYNPQSGYIANWNNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRVTEIDTILDKQPRFT ADQAWDVIRQTSRRDLNLRLFLPALKDATANLAENDPRRQLVDKLASWDGENLVNDDGKTYQQPGSAILNAWL TSMLKRTWAAVPAPFGKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGAKILYEALQGDKSPIPQAVDLFGGKPQQEVILAA LDDAWQTLSKRYGNDVTGWKTPAMALTFRANNFFGVPQAAAKEARHQAEYQNRGTENDMIVFSPTSGNRPVL AWDWAPGQSGFIAPDGKADKHYDDQLKMYESFGRKSLWLTPQDVDEHQESQEVLQVQLDQTEVKIVRDEYG MPHIYADDTYRLFYGYGYWAQDRLFQMEMARRSTQGTVSEVLGKAFVSFDKDIRQNYWPDSIRAQIASLSAED KSILQGYADGMNAWIDKVNASPDKLLPQQFSTFGFKPKHWEPFDVAMIFVGTMANRFSDSTSEIDNLALLTALK DKYGKQQGMAVFNQLKWLVNPSAPTTIAARESAYPLKFDLQNTQTA (SEQ ID NO:4)

SEQ ID NO:5 (Secuencia de polinucleótidos de variante 6 de PGA)

AGCAATATGTGGGTGATTGGCAAAAACAAAGCCCAGGATGCGAAGGCCATTATGGTCAATG GGCCGCAGTTTGGTTGGTATGTGCCGGCGTATACCTACGGTATCGGCCTGCACGGCGCGGGCTATGACGTCA CCGGCAATACGCCGTTTGCCTATCCGGGCCTCGTTTTTGGTCACAACGGCACCATTTCATGGGGATCCACCGC

CGGTGGTGGTGATGATGTCGATATCTTTGCCGAAAAACTTTCCGCCGAGAAGCCGGGCTATTACCAGCATAA

<img file="MX381306B_D0049.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

CGGCGAGTGGGTGAAGATGTTGAGCCGCAAGGAGACTATTGCGGTCAAAGACGGCCAGCCGGAGACCTTTA CCGTTTGGCGCACGCTGCACGGCAACGTCATTAAAACCGATACTGCGACGCAGACCGCCTATGCCAAAGCGC GCGCCTGGGATGGCAAAGAGGTGGCGTCCCTGCTGGCGTGGACGCACCAGATGAAGGCCAAAAACTGGCCG GAGTGGACGCAGCAGGCGGCCAAACAGGCGCTGACCATCAACTGGTACTACGCCGATGTGAACGGCAATATC GGCTATGTGCATACCGGCGCCTATCCGGATCGCCAGCCCGGCCACGACCCGCGTTTGCCGGTTCCCGGCACT GGAAAATGGGACTGGAAAGGGTTGCTGTCGTTTGATTTGAATCCGAAAGTGTATAACCCGCAGTCGGGCTAT ATCGCCAACTGGAACAACTCGCCGCAAAAAGACTACCCGGCCTCrGATCTGTTCGCGTTCCTGTGGGGCGGT GCGGATCGAGCGACTGAGATCGACACGATCCTCGATAAGCAACCGCGCTTCACCGCCGATCAGGCGTGGGAT GTGATCCGCCAAACCAGCCGTCGGGATCTCAACCTGCGGTTGTTCTTACCGGCGCTGAAGGACGCCACCGCC AACCTGGCGGAAAACGATCCGCGCCGCCAACTGGTGGATAAACTGGCGAGCTGGGACGGCGAAAACC1TGTC AACGATGACGGAAAAACCTATCAGCAACCGGGATCGGCGATTCTTAACGCCTGGCTGACCAGCATGCTCAAG CGCACGGTGGTTGCCGCGGTCCCAGCGCCGTTTGGTAAGTGGTACAGCGCCAGTGGCTATGAAACCACCCAG GACGGGCCAACCGGCTCGCTGAACATCAGCGTGGGGGCGAAAATCCTCTACGAAGCTCTGCAGGGTGATAAG TCGCCAATCCCGCAGGCGGTCGATCTGTTTGGCGGGAAACCGCAGCAGGAAGTAATACTGGCGGCGCTGGAC GACGCTTGGCAGACGCTGTCAAAACGCTACGGTAACGACGTCACCGGCTGGAAAACCCCTGCCATGGCGCTT ACCTTCCGGGCCAATAACTTCTTCGGCGTGCCGCAGGCGGCAGCAAAAGAGGCGCGTCATCAGGCGGAGTAC CAGAACCGCGGTACGGAAAACAACATGATTGTCTTCTCACCGACGTCGGGTAACCGCCCGGTTCTTGCCTGG GATGTGGTGGCGCCGGGGCAAAGCGGTTTTATCGCGCCGGATGGCAAAGCCGATAAGCACTATGACGATCAG CTGAAAATGTACGAGAGCTTTGGCCGTAAATCGCTGTGGTTAACGCCTCAGGACGTTGACGAGCACAAAGAG TCTCAGGAAGTGCTGCAGGTACAGTTGGATCAGACCGAGGTTAAGATCGTTCGCGATGAATACGGCATGCCG CATATTTACGCCGATGATACCTATCGACTGTTTTACGGCTATGGCTACGTGGTGGCGCAGGATCGCCTGTTCC AGATGGAAATGGCGCGCCGCAGTACTCAGGGGACCGTCTCCGAGGTGCTGGGCAAAGCATTCGTCAGTTTTG ATAAAGATATTCGCCAGAACTACTGGCCGGATTCTATTCGCGCGCAGATAGCTTCCCTCTCCGCTGAGGATAA ATCCATTCTGCAGGGCTATGCCGATGGCATGAATGCGTGGATCGATAAAGTGAACGCCAGCCCCGATAAGCT GTTACCCCAGCAGTTCTCCACCTTTGGTTTTAAACCCAAGCATTGGGAACCGTTTGATGTGGCGATGATTTTT GTCGGCACCATGGCGAACCGTTTTTCTGACAGCACCAGCGAAATTGATAACCTGGCGCTGCTGACGGCGCTA AAAGACAAATACGGCAAGCAGCAGGGCATGGCGGTCTTTAACCAGCTGAAATGGCTGGTTAATCCTTCCGCG CCAACCACCATTGCGGCGCGGGAAAGCGCCTATCCGCTGAAGTTTGATCTGCAAAACACGCAAACGGCGTAA (SEQ ID NO:5)

SEQ ID NO:6 (Secuencia de polipéptidos de variante 6 de PGA)

SNMWVIGKNKAQDAKAIMVNGPQFGWYVPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLVFGHNG TISWGSTAGGGDDVDIFAEKLSAEKPGYYQHNGEWVKMLSRKEnAVKDGQPETFTVWRTLHGNVIKTDTATQ TAYAKARAWDGKEVASLtAWTHQMKAKNWPEWTQQAAKQALTINWYYADVNGNIGYVHTGAYPDRQPGHDP RLPVPGTGKWDWKGLLSFDLNPKVYNPQSGYIANWNNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRATEIDTILDKQPRFT

<img file="MX381306B_D0050.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

ADQAWDVIRQTSRRDLNLRLFLPALKDATANLAENDPRRQLVDKLASWDGENLVNDDGKTYQQPGSAILNAWL TSMLKRTWAAVPAPFGKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGAKILYEALQGDKSPIPQAVDLFGGKPQQEVILAA LDDAWQTLSKRYGNDVTGWKTPAMALTFRANNFFGVPQAAAKEARHQAEYQNRGTENNMIVFSPTSGNRPVL AWDWAPGQSGFIAPDGKADKHYDDQLKMYESFGRKSLWLTPQDVDEHKESQEVLQVQLDQTEVKIVRDEYG MPHIYADDTYRLFYGYGYWAQDRLFQMEMARRSTQGTVSEVLGKAFVSFDKDIRQNYWPDSIRAQIASLSAED KSILQGYADGMNAWIDKVNASPDKLLPQQFSTFGFKPKHWEPFDVAMIFVGTMANRFSDSTSEIDNLALLTALK DKYGKQQGMAVFNQLKWLVNPSAPTTIAARESAYPLKFDLQNTQTA (SEQ ID NO:6)

SEQ ID NO:7 (Secuencia de polinucleótidos de variante 53 de PGA)

AGCAATATGTGGGTGATTGGCAAAAACAAAGCCCAGGATGCGAAGGCCATTATGGTCAATG GGCCGCAGTTTGGTTGGTTTAATCCGGCGTACACCTACGGTATCGGCCTGCACGGCGCGGGCTATGACGTCA CCGGCAATACGCCGTTTGCCTATCCGGGCCTCCTGTTTGGTCACAACGGCACCATTTCATGGGGATCCACCGC CGGTGGTGGTGATGATGTCGATATCTTTGCCGAAAAACTTTCCGCCGAGAAGCCGGGCTATTACCAGCATAA CGGCGAGTGGGTGAAGATGTTGAGCCGCAAGGAGACTATTGCGGTCAAAGACGGCCAGCCGGAGACCTTTA CCGTTTGGCGCACGCTGCACGGCAACGTCATTAAAACCGATACTGCGACGCAGACCGCCTATGCCAAAGCGC GCGCCTGGGATGGCAAAGAGGTGGCGTCCCTGCTGGCGTGGACGCACCAGATGAAGGCCAAAAACTGGCCG GAGTGGACGCAGCAGGCGGCCAAACAGGCGCTGACCATTAACTGGTACTACGCCGATGTGAACGGCAATATC GGCTATGTGCATACCGGCGCCTATCCGGATCGCCAGCCCGGCCACGACCCGCGTTTGCCGGTTCCCGGCACT GGAAAATGGGACTGGAAAGGGTTGCTGTCGTTTGATTTGAATCCGAAAGTGTATAACCCGCAGTCGGGCTAT ATCGCCAACTGGAACAACTCGCCGCAAAAAGACTACCCGGCCTCTGATCTGTTCGCGTTCCTGTGGGGCGGT GCGGATCGAGTTACTGAGATCGACACGATCCTCGATAAGCAACCGCGCTTCACCGCCGATCAGGCGTGGGAT GTGATCCGCCAAACCAGCCGTCGGGATCTCAACCTGCGGTTGTTCTTACCGGCGCTGAAGGACGCCACCGCG AACCTGGCGGAAAACGATCCGCGCCGCCAACTGGTGGATAAACTGGCGAGCTGGGACGGCGAAAACCTTGTC AACGATGACGGAAAAACCTATCAGCAACCGGGATCGGCGATTCTTAACGCCTGGCTGACCAGCATGCTCAAG CGCACGGTGGTTGCCGCGGTCCCAGCGCCGTTTGGTAAGTGGTACAGCGCCAGTGGCTATGAAACCACCCAG GACGGGCCAACCGGCTCGCTGAACATCAGCGTGGGGGCGAAAATCCTCTACGAAGCTCTGCAGGGTGATAAG TCGCCAATCCCGCAGGCGGTCGATCTGTTTGGCGGGAAACCGCAGCAGGAAGTAATACTGGCGGCGCTGGAC GACGCTTGGCAGACGCTGTCAAAACGCTACGGTAACGACGTCACCGGCTGGAAAACCCCTGCCATGGCGCTT ACCTTCCGGGCCAATAACTTCTTCGGCGTGCCGCAGGCGGCAGCAAAAGAGGCGCGTCATCAGGCGGAGTAC CAGAACCGCGGTACGGAAAACGACATGATTGTCTTCTCACCGACGTCGGGTAACCGCCCGGTTCrTGCCTGG GATGTGGTGGCGCCGGGGCAAAGCGGTTTTATCGCGCCGGATGGCAAAGCCGATAAGCACTATGACGATCAG CTGAAAATGTACGAGAGCTTTGGCCGTAAATCGCTGTGGTTAACGCCTCAGGACGTTGACGAGCACCAAGAG TCTCAGGAAGTGCTGCAGGTACAGTTGGATCAGACCGAGGTTAAGATCGTTCGCGATGAATACGGCATGCCG CATATTTACGCCGATGATACCTATCGACTGTTTTACGGCTATGGCTACGTGGTGGCGCAGGATCGCCTGTTCC AGATGGAAATGGCGCGCCGCAGTACTCAGGGGACCGTCTCCGAGGTGCTGGGCAAAGCTTTCGTTTCrTTTG

<img file="MX381306B_D0051.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

ATAAAGATATTCGCCAGAACTACTGGCCGGATrCTATTCGCGCGCAGATAGCTTCCCTCTCCGCTGAGGATAA ATCCATTCTGCAGGGCTATGCCGATGGCATGAATGCGTGGATCGATAAAGTGAACGCCAGCCCCGATAAGCT GTTACCCCAGCAGTTCTCCACCTTTGGTTTTAAACCCAAGCATTGGGAACCGTTTGATGTGGCGATGATTTTT GTCGGCACCATGGCGAACCGTTTCTCTGACAGCACCAGCGAAATTGATAACCTGGCGCTGCTGACGGCGCTA AAAGACAAATACGGCAAGCAGCAGGGCATGGCGGTCTTTAACCAGCTGAAATGGCTGGTTAATCCTTCCGCG CCAACCACCAITGCGGCGCGGGAAAGCGCCTATCCGCTGAAGTTTGATCTGCAAAACACGCAAACGGCGTAA (SEQ ID NO:7)

SEQ ID NO:8 (Secuencia de polipéptidos de variante 53 de PGA) SNMWVIGKNKAQDAKAIMVNGPQFGWFNPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLLFGHNG TISWGSTAGGGDDVDIFAEKLSAEKPGYYQHNGEWVKMI-SRKEnAVKDGQPETFTVWRTLHGNVIKTDTATQ TAYAKARAWDGKEVASLLAWTHQMKAKNWPEWTQQAAKQALTINWYYADVNGNIGYVHTGAYPDRQPGHDP RLPVPGTGKWDWKGLLSFDLNPKVYNPQSGYIANWNNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRVTEIDTILDKQPRFT ADQAWDVIRQTSRRDLNLRLFLPALKDATANLAENDPRRQLVDKLASWDGENLVNDDGKTYQQPGSAILNAWL TSMLKRTWAAVPAPFGKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGAKILYEALQGDKSPIPQAVDLFGGKPQQEVILAA LDDAWQTLSKRYGNDVTGWKTPAMALTFRANNFFGVPQAAAKEARHQAEYQNRGTENDMIVFSPTSGNRPVL AWDWAPGQSGFIAPDGKADKHYDDQLKMYESFGRKSLWLTPQDVDEHQESQEVLQVQLDQTEVKIVRDEYG MPHIYADDTYRLFYGYGYWAQDRLFQMEMARRSTQGTVSEVLGKAFVSFDKDIRQNYWPDSIRAQIASLSAED KSILQGYADGMNAWIDKVNASPDKLLPQQFSTFGFKPKHWEPFDVAMIFVGTMANRFSDSTSEIDNLALLTALK ^;

DKYGKQQGMAVFNQLKWLVNPSAPTTIAARESAYPLKFDLQNTQTA (SEQ ID NO:8) i

SEQ ID NO:9 (Secuencia de polinucleótidos de variante 261 de PGA) i

AGCAATATGTGGGTGATTGGCAAAAACAAAGCCCAGGATGCGAAGGCCATTATGGTCAATG |

GGCCGCAGTTTGGTTGGTATAATCCGGCGTATACCTACGGTATCGGCCTGCACGGCGCGGGCTATGACGTCA CCGGCAATACGCCGTTTGCCTATCCGGGCCTCCTTTTTGGTCACAACGGCACCATTTCATGGGGATCCACCGC CGGTGCCGGTGATGTCGTCGATATCTTTGCCGAAAAACTTTCCGCCGAGAAGCCGGGCTATTACCAGCATAA CGGCGAGTGGGTGAAGATGTTGAGCCGCAAGGAGACTATTGCGGTCAAAGACGGCCAGCCGGAGACCrTTA CCGTTTGGCGCACGCTGCACGGCAACGTCATTAAAACCGATACrGCGACGCAGACCGCCTATGCCAAAGCGC GCGCCTGGGATGGCAAAGAGGTGGCGTCCCTGCTGGCGTGGACGCACCAGATGAAGGCCAAAAACTGGCCG GAGTGGACGCAGCAGGCGGCCAAACAGGCGCTGACCATCAACTGGTACTACGCCGATGTGAACGGCAATATC GGCTATGTGCATACCGGCGCCTATCCGGATCGCCAGCCCGGCCACGACCCGCGTTTGCCGGTTCCCGGCACT GGAAAATGGGACTGGAAAGGGTTGCTGTCGTTTGATTTGAATCCGAAAGTGTATAACCCGCAGTCGGGCTAT ATCGCCAACTGGAACAACTCGCCGCAAAAAGACTACCCGGCCrCrGATCTGTTCGCGTTCCTGTGGGGCGGT GCGGATCGAGCGACTGAGATCGACACGATCCTCGATAAGCAACCGCGCTTCACCGCCGATCAGGCGTGGGAT GTGATCCGCCAAACCAGCCGTCGGGATCTCAACCTGCGGTTGTTCTTACCGGCGCrGAAGGACGCCACCGCC

I I

<img file="MX381306B_D0052.tif" />

IMPI 2

DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL σ&gt;

AACCTGGCGGAAAACGATCCGCGCCGCCAACTGGTGGATAAACTGGCGAGCTGGGACGGCGAAAACCTTGTC AACGATGACGGAAAAACCTATCAGCAACCGGGATCGGCGATTCTTAACGCCTGGCTGACCAGCATGCTCAAG CGCACGGTGGTTGCCGCGGTCCCAGCGCCGTTTGGTAAGTGGTACAGCGCCAGTGGCTATGAAACCACCCAG GACGGGCCAACCGGCTCGCTGAACATCAGCGTGGGGGCGAAAATCCTCTACGAAGCTCTGCAGGGTGATAAG TCGCCAATCCCGCAGGCGGTCGATCTGTTTGGCGGGAAACCGCAGCAGGAAGTAATACTGGCGGCGCTGGAC GACGCTTGGCAGACGCTGrCAAAACGCTACGGTAACGACGTCACCGGCTGGAAAACCCCTGCCATGGCGCTT ACCTTCCGGGCCAATAACrTCTTCGGCGTGCCGCAGGCGGCAGCAAAAGAGGCGCGTCATCAGGCGGAGrAC CAGAACCGCGGTACGGAAAACAACATGATTGTCTTCTCACCGACGTCGGGTAACCGCCCGGTTCTTGCCTGG GATGTGGTGGCGCCGGGGCAAAGCGGTTTTATCGCGCCGGATGGCAAAGCCGATAAGCACTATGACGATCAG CTGAAAATGTACGAGAGCTTTGGCCGTAAATCGCTGTGGTTAACGCCTCAGGACGTTGACGAGCACAAAGAG TCTCAGGAAGTGCTGCAGGTACAGTTGGATCAGACCGAGGTTAAGATCGTTCGCGATGAATACGGCATGCCG CATATTTACGCCGATGATACCTATCGACTGTTTTACGGCTATGGCTACGTGGTGGCGCAGGATCGCCTGTTCC AGATGGAAATGGCGCGCCGCAGTACTCAGGGGACCGTCTCCGAGGTGCTGGGCAAAGCATTCGTTTCATTTG ATAAAGATATTCGCCAGAACTACTGGCCGGATrCTATTCGCGCGCAGATAGCTTCCCTCTCCGCTGAGGATAA ATCCATTCTGCAGGGCTATGCCGATGGCATGAATGCGTGGATCGATAAAGTGAACGCCAGCCCCGATAAGCT GTTACCCCAGCAGTTCrCCACCTTTGGTTTTAAACCCAAGCATTGGGAACCGTTTGATGTGGCGATGATTTTT GTCGGCACCATGGCGAACCGTTTTTCTGACAGCACCAGCGAAATTGATAACCTGGCGCTGCTGACGGCGCrA AAAGACAAATACGGCAAGCAGCAGGGCATGGCGGTCTTTAACCAGCTGAAATGGCTGGTTAATCCTTCCGCG CCAACCACCATTGCGGCGCGGGAAAGCGCCTATCCGCTGAAGTTTGATCTGCAAAACACGCAAACGGCGTAA (SEQ ID NO:9)

SEQ ID NO: 10 (Secuencia de polipéptidos de variante 261 de PGA)

SNMWVIGKNKAQDAKAIMVNGPQFGWYNPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLLFGHNG TISWGSTAGAGDWDIFAEKLSAEKPGYYQHNGEWVKMLSRKETIAVKDGQPETFTVWRTLHGNVIKTDTATQ TAYAKARAWDGKEVASLLAWTHQMKAKNWPEWTQQAAKQALTINWYYADVNGNIGYVHTGAYPDRQPGHDP RLPVPGTGKWDWKGLLSFDLNPKVYNPQSGYIANWNNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRATEIDTILDKQPRFT ADQAWDVIRQTSRRDLNLRLFLPALKDATANLAENDPRRQLVDKLASWDGENLVNDDGKTYQQPGSAILNAWL TSMLKRTWAAVPAPFGKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGAKILYEALQGDKSPIPQAVDLFGGKPQQEVILAA LDDAWQTLSKRYGNDVTGWKTPAMALTFRANNFFGVPQAAAKEARHQAEYQNRGTENNMIVFSPTSGNRPVL AWDWAPGQSGFIAPDGKADKHYDDQLKMYESFGRKSLWLTPQDVDEHKESQEVLQVQLDQTEVKIVRDEYG MPHIYADDTYRLFYGYGYWAQDRLFQMEMARRSTQGTVSEVLGKAFVSFDKDIRQNYWPDSIRAQIASLSAED KSILQGYADGMNAWIDKVNASPDKLLPQQFSTFGFKPKHWEPFDVAMIFVGTMANRFSDSTSEIDNLALLTALK DKYGKQQGMAVFNQLKWLVNPSAPTTIAARESAYPLKFDLQNTQTA (SEQ ID NO: 10) ^ΙΜΡΙ

INSTITUTO MEXICANO ^F DE LA PROPIEDAD

INDUSTRIAL

SEQ ID NO: 11 (Secuencia de polinucleótidos de variante 258 de PGA)

AGCAATATGTGGGTGATTGGCAAAAACAAAGCCCAGGATGCGAAGGCCATTATGGTCAATG GGCCGCAGTTTGGTTGGTATAATCCGGCGTATACCTACGGTATCGGCCTGCACGGCGCGGGCrATGACGrCA CCGGCAATACGCCGTTTGCCTATCCGGGCCTCCTTTTTGGTCACAACGGCACCATTTCATGGGGATCCACCGC CGGTGCCGGTGATAGCGTCGATATCTTTGCCGAAAAACTTTCCGCCGAGAAGCCGGGCTATTACCAGCATAA CGGCGAGTGGGTGAAGATGTTGAGCCGCAAGGAGACTATTGCGGTCAAAGACGGCCAGCCGGAGACCTTTA CCGTTTGGCGCACGCTGCACGGCAACGTCATTAAAACCGATACrGCGACGCAGACCGCCTATGCCAAAGCGC GCGCCTGGGATGGCAAAGAGGTGGCGTCCCTGCTGGCGTGGACGCACCAGATGAAGGCCAAAAACTGGCCG GAGTGGACGCAGCAGGCGGCCAAACAGGCGCTGACCATCAACTGGTACTACGCCGATGTGAACGGCAATATC GGCTATGTGCATACCGGCGCCTATCCGGATCGCCAGCCCGGCCACGACCCGCGTTTGCCGGTTCCCGGCACT GGAAAATGGGACTGGAAAGGGTTGCTGTCGTTTGATTTGAATCCGAAAGTGTATAACCCGCAGTCGGGCTAT ATCGCCAACTGGAACAACTCGCCGCAAAAAGACTACCCGGCCrCTGATCTGTTCGCGTTCCTGTGGGGCGGT GCGGATCGAGCGACTGAGATCGACACGATCCTCGATAAGCAACCGCGCTTCACCGCCGATCAGGCGTGGGAT GTGATCCGCCAAACCAGCCGTCGGGATCTCAACCTGCGGTTGTTCTTACCGGCGCTGAAGGACGCCACCGCC AACCrGGCGGAAAACGATCCGCGCCGCCAACTGGTGGATAAACTGGCGAGCTGGGACGGCGAAAACCTTGTC AACGATGACGGAAAAACCTATCAGCAACCGGGATCGGCGATTCTTAACGCCTGGCTGACCAGCATGCTCAAG CGCACGGTGGTTGCCGCGGTCCCAGCGCCGTTTGGTAAGTGGTACAGCGCCAGTGGCrATGAAACCACCCAG GACGGGCCAACCGGCTCGCTGAACATCAGCGTGGGGGCGAAAATCCTCTACGAAGCTCTGCAGGGTGATAAG TCGCCAATCCCGCAGGCGGTCGATCrGTTTGGCGGGAAACCGCAGCAGGAAGTAATACTGGCGGCGCTGGAC GACGCTTGGCAGACGCTGTCAAAACGCTACGGTAACGACGTCACCGGCTGGAAAACCCCTGCCATGGCGCTT ACCTTCCGGGCCAATAACTTCTTCGGCGTGCCGCAGGCGGCAGCAAAAGAGGCGCGTCATCAGGCGGAGTAC CAGAACCGCGGTACGGAAAACAACATGATTGTCTTCTCACCGACGTCGGGTAACCGCCCGGTTCTTGCCTGG GATGTGGTGGCGCCGGGGCAAAGCGGTTTTATCGCGCCGGATGGCAAAGCCGATAAGCACTATGACGATCAG CTGAAAATGTACGAGAGCTTTGGCCGTAAATCGCTGTGGTTAACGCCTCAGGACGTTGACGAGCACAAAGAG TCTCAGGAAGTGCTGCAGGTACAGTTGGATCAGACCGAGGTTAAGATCGTTCGCGATGAATACGGCATGCCG CATATTTACGCCGATGATACCTATCGACTGTTTTACGGCTATGGCTACGTGGTGGCGCAGGATCGCCrGTTCC AGATGGAAATGGCGCGCCGCAGTACTCAGGGGACCGTCTCCGAGGTGCTGGGCAAAGCATTCGTTAAGTTTG ATAAAGATATTCGCCAGAACTACrGGCCGGATTCTATTCGCGCGCAGATAGCTTCCCrcrCCGCTGAGGATAA ATCCATTCTGCAGGGCTATGCCGATGGCATGAATGCGTGGATCGATAAAGTGAACGCCAGCCCCGATAAGCT GTTACCCG^GCAGTTCTCCTXCCTTTGGTrrTAAACCCAAGCATTGGGAACCGTTTGATGTGGCGATGATTTTT GTCGGCACCATGGCGAACCGTTTTTCTGACAGCACCAGCGAAATTGATAACCTGGCGCTGCTGACGGCGCTA AAAGACAAATACGGCAAGCAGCAGGGCATGGCGGTCTTTAACCAGCTGAAATGGCTGGTTAATCCTrCCGCG CCAACCACCATTGCGGCGCGGGAAAGCGCCTATCCGCTGAAGTTTGATCTGCAAAACACGCAAACGGCGTAA (SEQ ID NO:11)

<img file="MX381306B_D0053.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

SEQ ID NO: 12 (Secuencia de polipéptidos de variante 258 de PGA)

SNMWVIGKNKAQDAKAIMVNGPQFGWYNPAYTYGIGLHGAGYDVTGNTPFAYPGLLFGHNG TISWGSTAGAGDSVDIFAEKLSAEKPGYYQHNGEVWKMLSRKETIAVKDGQPETFTVWRTLHGNVIKTDTATQT AYAKARAWDGKEVASLLAWTHQMKAKNWPEWTQQAAKQALTINWYYADVNGNIGYVHTGAYPDRQPGHDPR LPVPGTGKWDWKGLLSFDLNPKVYNPQSGYIANWNNSPQKDYPASDLFAFLWGGADRATEIDTILDKQPRFTA DQAWDVIRQTSRRDLNLRLFLPALKDATANLAENDPRRQLVDKLASWDGENLVNDDGKTYQQPGSAILNAWLT SMLKRTWAAVPAPFGKWYSASGYETTQDGPTGSLNISVGAKILYEALQGDKSPIPQAVDLFGGKPQQEVILAAL DDAWQTLSKRYGNDVTGWKTPAMALTFRANNFFGVPQAAAKEARHQAEYQNRGTENNMIVFSPTSGNRPVLA WDWAPGQSGFIAPDGKADKHYDDQLKMYESFGRKSLWLTPQDVDEHKESQEVLQVQLDQTEVKIVRDEYGM PHIYADDTYRLFYGYGYWAQDRLFQMEMARRSTQGTVSEVLGKAFVKFDKDIRQNYWPDSIRAQIASLSAEDK SILQGYADGMNAWIDKVNASPDKLLPQQFSTFGFKPKHWEPFDVAMIFVGTMANRFSDSTSEIDNLALLTALKD KYGKQQGMAVFNQLKWLVNPSAPTTIAARESAYPLKFDLQNTQTA (SEQ ID NO:12)

EJEMPLO 1

Huéspedes de expresión de E, coli que contienen genes de PGA recombinantes

Las enzimas de la PGA iniciales utilizadas para producir las variantes de la presente invención se obtuvieron de la Panel adlasa Codex® (Codexis). La placa de panel de PGA comprende una colección de polipéptidos de PGA diseñados que tienen propiedades mejoradas, en comparación con el PGA de Kluyvera citrophila de tipo natural. El gen PGA de tipo natural es un heterodímero que consiste en la subunidad alfa (23.8 KDa) y la subunidad beta (62.2KDa) unidas por la región espadadora 54aa. Debido a la presencia de región espadadora, se requiere un paso de autoprocesamiento para formar la proteína activa. El gen en estado natural se modificó para eliminar la región espaciadora, eliminando así la etapa de auto procesamiento. El Panel de Acilasa Codex® (Codexis) contiene variantes de PGA que carecen de la región espaciadora (Véase, por ejemplo, la publicación de solicitud de patente de EE.UU. 2010/0143968 Al). Los genes que codifican PGA se clonaron en el vector de expresión pCK110900 (Véase, Fig. 3 de la publicación de. solicitud de patente de EE.UU. No. 2006/0195947) operativamente unido al promotor lac bajo el control del represor lad. El vector de expresión también contiene el origen de replicación de P15a y el gen de resistencia a doranfenicol. Los plásmidos resultantes se transformaron en E. coli W3110, utilizando métodos estándar conocidos en la técnica. Los transformantes se aislaron sometiendo las células a la selección de doranfenicol, como se conoce en la técnica (véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. No. 8,383,346 y WO2010/144103).

<img file="MX381306B_D0054.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

EJEMPLO 2 Preparación de pellas de células húmedas que contienen PGA de HTP

Las células E. coli que contienen genes que codifican PGA recombinantes de colonias monoclonales se inocularon en 180 pl de LB que contienen 1% de glucosa y 30 pg/ml de cloranfenicol en los pocilios de placas de microtitulación de 96 pocilios huecos. Los cultivos se cultivaron durante la noche a 30 °C, 200 rpm y 85% de humedad. Luego, se transfirieron 10 μΙ de cada uno de los cultivos celulares en los pocilios de placas de 96 pocilios profundos que contienen 390 mL de TB y 30 pg/mL de CAM. Las placas de pocilios profundos se incubaron durante 3 horas (OD600 0.6-0.8) a 30 °C, 250 rpm y 85% de humedad. Los cultivos celulares fueron inducidos por IPTG a una concentración final de 1 mM y se incubaron durante la noche bajo las mismas condiciones que se usaron originalmente. Las células se sedimentaron luego usando centrifugación a 4000 rpm durante 10 minutos. Los sobrenadantes se desecharon y las pellas se congelaron a 80°C antes de la lisis.

EJEMPLO 3

Preparación v análisis de lisados de células que contienen PGA de HTP

Primero, se añadieron 250 μΙ de regulador de lisis que contiene 20 mM de regulador

Tris-HCI, pH 7.5, 1 mg/ml de lisozima y 0.5 mg/ml de PMBS a la pasta celular en cada pocilio producido como se describe en el Ejemplo 2. Las células se lisaron a temperatura ambiente durante 2 horas con agitación en un agitador de mesa de trabajo. La placa se centrifugó luego durante 15 min a 4000 rpm y 4o C. Los sobrenadantes claros usados en reacciones biocatalíticas para determinar sus niveles de actividad.

La actividad de las variantes de PGA se evaluó con base a la eficacia de las variantes para eliminar los tres grupos acetato de fenilo unidos químicamente a los residuos de insulina Al (glicina), B1 (fenilalanina) y B29 (lisina). Las reacciones del HTP se llevaron a cabo en placas de 96 pocilios profundos. Primero, 0.3 mi de la mezcla de reacción contuvo 0.1M de Tris-HCI, pH 8.0, 5g/L de insulina tri-protegida, lisado de HTP entre 25-125μ (dependiendo de la curva lineal). Las placas HTP se incubaron en agitadores Thermotron® (3 mm de tiro, modelo # A1185, Infors a 30°C, 300 rpm), durante 6 o 22 horas. Las reacciones se templaron con 300 μΙ de acetonitrilo y se mezclaron durante 3 minutos usando un agitador de mesa de trabajo. Las placas se centrifugaron a 4000 rpm durante 2 minutos y se cargaron en HPLC para su análisis. Para analizar las muestras de HTP se usó una columna Agilent eclipse XDB C18, 5 pm, 2.1 x 150 mm. El caudal se estableció a 0.5ml/min, y se estableció la temperatura a 50°C. La fase móvil A fue agua 0.05% de TFA y la fase móvil B fue

<img file="MX381306B_D0055.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL acetonitrilo + TFA al 0.05%. El tiempo de ejecución fue de 7.2 minutos con la superposición de inyección habilitada. El gradiente fue de 75% de fase móvil A en 00.2 minutos, 55% de fase móvil A en 4.9 minutos, 5% de fase móvil A en 5 minutos, de nuevo a 75% de fase móvil A en 5.9 minutos.

EJEMPLO 4

Preparación v análisis de Usados liofilizados de cultivos de matraz oscilante fSF)

Los cultivos de HTP seleccionados como se describe anteriormente se sembraron en placas de agar LB con 1% de glucosa y 30 pg/ml de CAM y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Se transfirió una sola colonia de cada cultivo a 50 mi de LB con 1% de glucosa y 30pg/ml de CAM. Los cultivos se cultivaron por 18 h a 30°C, 250 rpm, y se subcultivaron aproximadamente 1:10 en 250 mi de TB que contiene 30 pg/ml de CAM, a un OD600 final de 0.2. Los cultivos se cultivaron por 135 minutos a 30°C, 250 rpm, a un OD600 entre 0.6-0.8 y se incubaron con 1 mM IPTG. Los cultivos se cultivaron luego durante 20 h a 30 °C, 250 rpm. Los cultivos se centrifugaron a 4000 rpm x 20 min. El sobrenadante fue desechado, y las pellas fueron resuspendidas en 30 mi de 50 mM de fosfato de sodio a pH 7.5. Las células se colocaron en pellas (4000 rpm x 20 min) y se congelaron a -80°C durante 120 minutos. Las pellas congeladas se resuspendieron en 30 mi de 50 mM de fosfato sódico a pH 7.5, y se lisaron usando un sistema Microfluidizer (Microfluidics) a 124.10 MPa. Los lisados se colocaron en pellas (10,000 rpm x 60 min) y los sobrenadantes se congelaron y liofilizaron para generar las enzimas del matraz oscilante (SF).

La actividad de las variantes de PGA de matraz oscilante seleccionadas se evaluó con base a la eficacia de las variantes para eliminar los tres grupos acetato de fenilo unidos químicamente a los residuos de insulina Al (glicina), B1 (fenilalanina) y B29 (lisina). Las reacciones del matraz oscilante se llevaron a cabo en placas de 96 pocilios profundos. Primero, 0.3ml de la mezcla de reacción contuvo 0.1M Tris-HCI, pH 8.0, 5g/L de insulina tri-protegida, lisado de matraz oscilante entre 0.1-0.8g/L. Las placas de reacción de pocilios profundos se incubaron en agitadores Thermotron® (3 mm de banda, modelo # AJ185, Infors) a 30°C, 300 rpm, durante 22 o 6 horas (22 horas para la evolución de la ronda 1 y 6 horas para la evolución de la ronda 2). Las reacciones se templaron con 300 μΙ de acetonitrilo y se mezclaron durante 3 minutos en un agitador de mesa de trabajo. Las placas se centrifugaron a 4000 rpm durante 2 minutos y se cargaron en HPLC para su análisis. Para analizar las muestras de HTP se usó una columna Agilent eclipse XDB C18, 5 pm, 2.1 x 150 mm. El caudal se estableció a 0.6ml/min, y se estableció la temperatura a 50°C. La fase móvil A fue agua 0.05% de TFA y la fase móvil B fue acetonitrilo + TFA al 0.05%. El tiempo de ejecución fue de 18.2 minutos con la superposición de inyección habilitada. El gradiente fue de 80% de fase móvil A en 0-1 minutos, 60% de fase móvil A en 12 minutos, 5% de fase móvil A en 15 minutos, de

<img file="MX381306B_D0056.tif" />

S IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL nuevo a 80% de fase móvil A en 16 minutos.

EJEMPLO 5 Selección, construcción v cribado de la estructura de evolución de la ronda 1

Siguiendo el protocolo HTP se describe en los ejemplos anteriores, el Panel de acilasa Codex® (Codexis) se evaluó usando los protocolos de matraces de agitación descritos en el Ejemplo 4. Una de las variantes, designada como Variante 1 del Panel de acilasa Codex® (SEQ ID NO: 4) generó 54% de insulina libre con 0.8 g/L de carga de lisado de matraz oscilante en 22 h. Se realizó un estudio de inhibición del sustrato utilizando la Variante 1 (ver, Figura 1). Con la concentración creciente del sustrato de insulina tri-protegido, la generación de insulina libre catalizada por la Variante 1 disminuyó significativamente. En 5 horas, la generación de insulina libre descendió del 82% con una carga de sustrato de 1 g/l al 2% con una carga de sustrato de 10 g/l a una carga enzimática fija de 0.8 g/l. Si bien no se pretende que la presente invención esté limitada a ningún mecanismo particular, estos resultados sugieren que concentraciones más elevadas del sustrato de insulina tri-protegido causaron la inhibición del sustrato. La cantidad de producción de insulina libre aumentó a una concentración de sustrato más baja (ver, por ejemplo, Wang et al., Biopolymer 25: S109-S114 [1986]). Por lo tanto, una de las ventajas proporcionadas por la presente invención es la producción de variantes de PGA que superan la inhibición del sustrato. Esta variante fue elegida como la estructura para la evolución de la primera ronda. Un modelo de homología de la variante 1 se construyó usando PGA de E. coli como una plantilla (el PGA de E. col! tiene 87% de identidad de secuencia para PGA de K. citrophila tipo silvestre). La insulina tri-protegida se acopló al sitio activo de la Variante 1 para evaluar su interacción con PGA. Después, las 96 posiciones en su secuencia de aminoácidos se eligieron para la primera ronda de evolución, cubriendo la la capa (residuos de aminoácidos dentro de 5-6Á) y parte de la 2a capa (residuos de aminoácidos dentro 612Á) del sitio activo y sitio de unión a insulina tri-protegido. También se diseñaron dos bibliotecas combinatorias, basadas en un análisis de los resultados del cribado del panel PGA y las mutaciones de consenso. Todos los métodos de cribado de HTP para las variantes obtenidas en esta primera ronda de evolución se realizaron usando los mismos protocolos como se describió anteriormente, con el tiempo final de reacción de 22 horas. Las mutaciones activas con mejora de plegado correspondiente en la actividad total sobre la variante 1 se muestran en el siguiente cuadro 5.1. En este cuadro, el control positivo es la variante 1 (SEQ ID NO:4).

<img file="MX381306B_D0057.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

CUADRO 5-1

Mutaciones activas v resultados de FIOPC cara las variantes de la ronda 1

<td> Variante #</td><td> FIOPC</td><td> Mutaciones activas (en comparación con la variante 1)</td>

<td> 2</td><td> +++</td><td> V56I;V264A;A308T;T379A;D484N</td>

<td> 3</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 4</td><td> +</td><td> Q547K;L711Q;S750G</td>

<td> 5</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 6</td><td> + + +</td><td> V264A;D484N;Q547K</td>

<td> 7</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 8</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 9</td><td> + +</td><td> V56I;A308T;T379A;D484N</td>

<td> 10</td><td> -</td><td> F367S;L754P</td>

<td> 11</td><td> +</td><td> V56I</td>

<td> 12</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 13</td><td> 4-4-</td><td> D484N</td>

<td> 14</td><td> +++</td><td> V264A;A308T;T379A;D484N;Q547K</td>

<td> 15</td><td> +</td><td> L754P</td>

<td> 16</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 17</td><td> -</td><td> V264A;A308T;L711Q</td>

<td> 18</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 19</td><td> 4-+4-</td><td> V264A;T379A;D484N;S750G;L754P</td>

<td> 20</td><td> +</td><td> T379A;Q547K</td>

<td> 21</td><td> ++</td><td> Q547K</td>

<td> 22</td><td> ++</td><td> V56I;T379A;S750G</td>

<td> 23</td><td> -</td><td> Q547K;L711Q</td>

<td> 24</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 25</td><td> -</td><td> Q547K;L711Q</td>

<td> 26</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 27</td><td> ++</td><td> V56I;D484N;L711Q</td>

<td> 28</td><td> +</td><td> Q547K;L754P</td>

<td> 29</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 30</td><td> +</td><td> Y27F;T131N;G368D;S619K</td>

<td> 31</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 32</td><td> +</td><td> Y27F;V28N;G368D;S372L;A616D;V618I;S619K</td>

<td> 33</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 34</td><td></td><td> V28N;T131N</td>

<td> 35</td><td></td><td> Y27F;G368D;S372L;S619K</td>

<td> 36</td><td></td><td> Y27F;S372L;V618I;S619K</td>

<td> 37</td><td> +</td><td> Y27F;V56L;I127V;S372L;S619K</td>

<td> 38</td><td> +</td><td> Y27F;V28N;Q134H;A616D;S619K</td>

<img file="MX381306B_D0058.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

<td> 39</td><td> ++</td><td> I127V;Q134H;G368D;V618I;S619K</td>

<td> 40</td><td> +</td><td> Y27F;I127V;T131N;A616D;V618I;S619K</td>

<td> 41</td><td> +</td><td> T131N;S372L</td>

<td> 42</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 43</td><td> +</td><td> V56L;I127V;T131N;Q134H;G368D;A616D</td>

<td> 44</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 45</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 46</td><td> + +</td><td> Y27F;V56L;G368D;S372L</td>

<td> 47</td><td> +</td><td> V28N;I127V;T131N;G368D;S372L</td>

<td> 48</td><td> + +</td><td> V28N;G368D;A616D;V618I;S619K</td>

<td> 49</td><td> +</td><td> V28N;V56L;S372L</td>

<td> 50</td><td> +</td><td> V28N;A616D;S619K</td>

<td> 51</td><td> +</td><td> Q134H</td>

<td> 52</td><td> ++</td><td> Y27F;V28N;T131N;Q134H;G368D;A616D;V618I;S619K</td>

<td> 53</td><td> + +</td><td> Y27F;V28N;V56L</td>

<td> 54</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 55</td><td> +</td><td> V56L;Q134H;G368D;A616D</td>

<td> 56</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 57</td><td> ++</td><td> Y27F;V28N;T131N;G368D;S619K</td>

<td> 58</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 59</td><td> + +</td><td> Y27F;S619K</td>

<td> 60</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 61</td><td> ++</td><td> Y27F;V28N;V56L;T131N;Q134H;S619K</td>

<td> 62</td><td> +</td><td> Y27F;G368D;S372L;V618I;S619K</td>

<td> 63</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 64</td><td> +</td><td> V56L;G368D;A616D;V618I</td>

<td> 65</td><td> +</td><td> Y27F;V28N;I127V;T131N;G368D;A616D;V618I;S619K</td>

<td> 66</td><td> +</td><td> V28N;T131N;S372L</td>

<td> 67</td><td> +++</td><td> V28N;S619K</td>

<td> 68</td><td> +</td><td> V56L;S372L;A616D;S619K</td>

<td> 69</td><td> ++ +</td><td> Y27F;V28N;V56L;I127V;Q134H;G368D;S372L;S619K</td>

<td> 70</td><td> + +</td><td> V28N;T131N</td>

<td> 71</td><td> +++</td><td> Y27F; V56L;1127V;V618I; S619K</td>

<td> 72</td><td> +</td><td> I127V;T131N</td>

<td> 73</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 74</td><td> ++</td><td> Y27F;V28N;A616D;V618I;S619K</td>

<td> 75</td><td> + 4-</td><td> V56L</td>

<td> 76</td><td> + +</td><td> Y27F;V28N;V56L;G368D</td>

<td> 77</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 78</td><td> +</td><td> Y27F;V56L;S372L</td>

<img file="MX381306B_D0059.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

<td> 79</td><td> ++</td><td> S619K</td>

<td> 80</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 81</td><td> +</td><td> Y27F;V28N;I127V;Q134H;A616D;S619K</td>

<td> 82</td><td> +</td><td> V56L;I127V;T131N;S325R;V618I;S619K</td>

<td> 83</td><td> +</td><td> Y27F;V56L;I127V;Q134H;G368D;S372L</td>

<td> 84</td><td> +</td><td> Y27F;I127V;T131N;G368D</td>

<td> 85</td><td> ++</td><td> Y27F;I127V;G368D;S372L;V618I;S619K</td>

<td> 86</td><td> +</td><td> V28N</td>

<td> 87</td><td> +</td><td> Y27F;V56L;I127V;Q134H;S372L;V618I;S619K</td>

<td> 88</td><td> +++</td><td> Y27F;V28N;V56L;V618I</td>

<td> 89</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 90</td><td> +</td><td> G368D;S372L;V618I;S619K</td>

<td> 91</td><td> -</td><td> G71F;D74G</td>

<td> 92</td><td> ++</td><td> D74P</td>

<td> 93</td><td> + +</td><td> G71A;D74S</td>

<td> 94</td><td> + +</td><td> G71A;D74V</td>

<td> 95</td><td> ++</td><td> G71A;D74V</td>

<td> 96</td><td> +</td><td> D74A</td>

<td> 97</td><td> +++</td><td> G71A;D74V</td>

<td> 98</td><td></td><td> D74S</td>

<td> 99</td><td> ++</td><td> D74T</td>

<td> 100</td><td> ++ +</td><td> G71A;D74N</td>

<td> 101</td><td> +++</td><td> D74S</td>

<td> 102</td><td> ++</td><td> D74G</td>

<td> 103</td><td> + +</td><td> D74G</td>

<td> 104</td><td> + + +</td><td> D74N</td>

<td> 105</td><td> + +</td><td> G71A;D74A</td>

<td> 106</td><td> + +</td><td> D74V</td>

<td> 107</td><td> +++</td><td> G71A;D74S</td>

<td> 108</td><td> +++</td><td> D74N</td>

<td> 109</td><td> + +</td><td> D74G</td>

<td> 110</td><td> +++</td><td> D74S</td>

<td> 111</td><td> + +</td><td> D74P</td>

<td> 112</td><td> + +</td><td> D74N</td>

<td> 113</td><td> ++</td><td> D74N</td>

<td> 114</td><td> +</td><td> P49H;M697R</td>

<td> 115</td><td> +</td><td> D74H</td>

<td> 116</td><td> +</td><td> T32D</td>

<td> 117</td><td> +</td><td> P418Q</td>

<td> 118</td><td> +</td><td> V56I;D74L</td>

<img file="MX381306B_D0060.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

<td> 119</td><td> +++</td><td> D381F</td>

<td> 120</td><td> +++</td><td> K369C</td>

<td> 121</td><td> + + +</td><td> N388G</td>

<td> 122</td><td> +++</td><td> D381K</td>

<td> 123</td><td> ++</td><td> A255G</td>

<td> 124</td><td> 4-4-</td><td> L253S</td>

<td> 125</td><td> 4-4-</td><td> Y27T;</td>

<td> 126</td><td> 4-4-</td><td> D381W</td>

<td> 127</td><td> 4-4-</td><td> N348R</td>

<td> 128</td><td> + 4-</td><td> F254W</td>

<td> 129</td><td> + +</td><td> D381W</td>

<td> 130</td><td> + +</td><td> A373L</td>

<td> 131</td><td> 4-4-</td><td> L257N</td>

<td> 132</td><td> + +</td><td> L253V</td>

<td> 133</td><td> + +</td><td> W370I</td>

<td> 134</td><td> 4-4-</td><td> A255L</td>

<td> 135</td><td> 4-4-</td><td> A373L</td>

<td> 136</td><td> + 4-</td><td> T384R</td>

<td> 137</td><td> 4-4-</td><td> Q380R</td>

<td> 138</td><td> ++</td><td> D381M</td>

<td> 139</td><td> 4-4-</td><td> T384P</td>

<td> 140</td><td> 4-4-</td><td> D381I</td>

<td> 141</td><td> ++</td><td> W240F</td>

<td> 142</td><td> 4-4-</td><td> D381Q</td>

<td> 143</td><td> 4-4-</td><td> L387I</td>

<td> 144</td><td> 4-4-</td><td> D381G</td>

<td> 145</td><td> ++</td><td> L253W</td>

<td> 146</td><td> 4-4-</td><td> A255M</td>

<td> 147</td><td> 4-4-</td><td> V360A</td>

<td> 148</td><td> ++</td><td> W370F</td>

<td> 149</td><td> 4.4.</td><td> N348H</td>

<td> 150</td><td> ++</td><td> L253W</td>

<td> 151</td><td> 4-4-</td><td> N388S</td>

<td> 152</td><td> 4-4-</td><td> D381C</td>

<td> 153</td><td> + +</td><td> A255R</td>

<td> 154</td><td> ++</td><td> L253F</td>

<td> 155</td><td> + +</td><td> N348R</td>

<td> 156</td><td> 4-4-</td><td> D381L</td>

<td> 157</td><td> 4-4-</td><td> A255V</td>

<td> 158</td><td> + +</td><td> A255Y</td>

<img file="MX381306B_D0061.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

<td> 159</td><td> + +</td><td> A132R</td>

<td> 160</td><td> + +</td><td> A255L</td>

<td> 161</td><td> +</td><td> F454Y</td>

<td> 162</td><td> +</td><td> T129W</td>

<td> 163</td><td> +</td><td> N348H</td>

<td> 164</td><td> +</td><td> L387Q</td>

<td> 165</td><td> +</td><td> D381M</td>

<td> 166</td><td> +</td><td> L387F</td>

<td> 167</td><td> +</td><td> L387M</td>

<td> 168</td><td> +</td><td> S372A</td>

<td> 169</td><td> +</td><td> D381C</td>

<td> 170</td><td> +</td><td> T379S</td>

<td> 171</td><td> +</td><td> D381P</td>

<td> 172</td><td> +</td><td> L387G</td>

<td> 173</td><td> +</td><td> L387S</td>

<td> 174</td><td> +</td><td> N348D</td>

<td> 175</td><td> +</td><td> T378Q</td>

<td> 176</td><td> +</td><td> T379S</td>

<td> 177</td><td> +</td><td> I389P</td>

<td> 178</td><td> +</td><td> N348S</td>

<td> 179</td><td> +</td><td> T129W</td>

<td> 180</td><td> +</td><td> Q380K</td>

<td> 181</td><td> +</td><td> T379C</td>

<td> 182</td><td> +</td><td> A373L</td>

<td> 183</td><td> +</td><td> T384G</td>

<td> 184</td><td> +</td><td> T379R</td>

<td> 185</td><td> +</td><td> T384H</td>

<td> 186</td><td> +</td><td> D381R</td>

<td> 187</td><td> +</td><td> D381Q</td>

<td> 188</td><td> +</td><td> A132R</td>

<td> 189</td><td> +</td><td> L253T</td>

<td> 190</td><td> +</td><td> N348E</td>

<td> 191</td><td> +</td><td> T129K</td>

<td> 192</td><td> +</td><td> D381Y</td>

<td> 193</td><td> +</td><td> D381I</td>

<td> 194</td><td> +</td><td> A255L</td>

<td> 195</td><td> +</td><td> A373Y</td>

<td> 196</td><td> +</td><td> T133N</td>

<td> 197</td><td> +</td><td> V126I</td>

<td> 198</td><td> +</td><td> A365M</td>

<img file="MX381306B_D0062.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

<td> 199</td><td> +</td><td> D381C</td>

<td> 200</td><td> +</td><td> N348K</td>

<td> 201</td><td> +</td><td> T378C</td>

<td> 202</td><td> +</td><td> Y27H</td>

<td> 203</td><td> +</td><td> A373L</td>

<td> 204</td><td> +</td><td> D130E</td>

<td> 205</td><td> +</td><td> L387C</td>

<td> 206</td><td> +</td><td> A456T</td>

<td> 207</td><td> +</td><td> H156R</td>

<td> 208</td><td> +</td><td> T131R</td>

<td> 209</td><td> +</td><td> T384C</td>

<td> 210</td><td> +</td><td> D381R</td>

<td> 211</td><td> +</td><td> T453R</td>

<td> 212</td><td> +</td><td> T133C</td>

<td> 213</td><td> +</td><td> A255V</td>

<td> 214</td><td> +</td><td> Y27G</td>

<td> 215</td><td> +</td><td> Q380I</td>

<td> 216</td><td> +</td><td> L387E</td>

<td> 217</td><td></td><td> A255S</td>

<td> 218</td><td> +</td><td> T379L</td>

<td> 219</td><td> +</td><td> T133G;L557S</td>

<td> 220</td><td> +</td><td> D381V</td>

<td> 221</td><td> +</td><td> L387T</td>

<td> 222</td><td> +</td><td> T133G</td>

<td> 223</td><td> +</td><td> T133R</td>

<td> 224</td><td> +</td><td> V391N</td>

<td> 225</td><td> +</td><td> Q134S</td>

<td> 226</td><td> +</td><td> T384N</td>

<td> 227</td><td> +</td><td> T131D</td>

<td> 228</td><td> +</td><td> D381C</td>

<td> 229</td><td> +</td><td> A373L</td>

<td> 230</td><td> +</td><td> T384F</td>

<td> 231</td><td> +</td><td> T133S</td>

<td> 232</td><td> +</td><td> L387H</td>

<td> 233</td><td> +</td><td> F256Y</td>

<td> 234</td><td> +</td><td> T133S</td>

<td> 235</td><td> +</td><td> L387E</td>

<td> 236</td><td> +</td><td> T384A</td>

<td> 237</td><td> +</td><td> A132T</td>

<td> 238</td><td> +</td><td> T379G</td>

<img file="MX381306B_D0063.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

<td> 239</td><td> +</td><td> W370V</td>

<td> 240</td><td> +</td><td> L387F</td>

<td> 241</td><td> +</td><td> F116I</td>

<td> 242</td><td> +</td><td> T384R;F596L</td>

<td> 243</td><td> +</td><td> V391P</td>

<td> 244</td><td> +</td><td> T133A</td>

<td> 245</td><td> +</td><td> Y27V</td>

<td> 246</td><td> +</td><td> A160S</td>

<td> 247</td><td> +</td><td> L387E</td>

<td> 248</td><td> +</td><td> N348S</td>

<td> 249</td><td> +</td><td> L257R</td>

<td> 250</td><td> +</td><td> A373Q</td>

<td> 251</td><td> +</td><td> T133Q</td>

<td> 252</td><td> +</td><td> W26F</td>

<td> 253</td><td> +</td><td> Q380C</td>

<td> 254</td><td> +</td><td> A255F</td>

FIOPC&lt;0.7 + : FIOPC = 0.7 a 1.3

FIOPC = 1.4 a 2.0 +++: FIOPC&gt;2.1

Con base en estos resultados, las variantes 6, 19, 14, 67, 88 y 53 se ampliaron a volúmenes del matraz oscilante y sus actividades se analizaron utilizando los protocolos descritos en los Ejemplos anteriores. Los resultados se muestran en la Figura 2. La variante 6 generó 93% de insulina libre en 22 horas a una carga enzimática de 0.8 g/l (ver figura 2) y logró un mejor nivel de expresión en comparación con la variante 1. La variante 53 tuvo un nivel de expresión similar a la variante 1, pero generó un 73% de insulina libre en comparación con el 54% generado por la variante 1. Con base en los resultados, se seleccionó la variante 6 (SEQ ID NO: 6) como estructura inicial para la siguiente ronda (es decir, ronda 2) de evolución. Esta variante también fue designada como un golpe de expresión. La variante 53 (SEQ ID NO:8) también se seleccionó como una estructura de ronda 2 alternativa y se designó como un golpe de actividad.

EJEMPLO 6 Construcción v cribado de la biblioteca de la ronda 2

Las mutaciones más benéficas identificadas de la evolución de la ronda 1 fueron

D484N, V264A, Q547K, V56I, S750G, V56L, S619K, V28N, V618I y T131N. Se diseñaron dos

<img file="MX381306B_D0064.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL bibliotecas combinatorias, basadas en el análisis de los resultados de la primera ronda, utilizando la Variante 6 y Variante 53 como estructuras. Todos los métodos de cribado de HTP utilizados para las variantes de la ronda 2 se llevaron a cabo usando los protocolos descritos anteriormente, con el tiempo final de reacción de 6 horas. Las mutaciones activas con la correspondiente mejora de plegado en la actividad total sobre la Variante 6 y la Variante 53 se muestran en los cuadros 6.1 y 6.2 a continuación. El cuadro 6.1 proporciona los resultados para las variantes basadas en la Variante 6, mientras que el cuadro 6.2 proporciona los resultados para las variantes basadas en la Variante 53.

CUADRO 6.1 Mutaciones activas v resultados de FIOPC para las variantes de la ronda 2 basadas en SEO ID NO:6 (Variante 61

<td> Variante #</td><td> FIOPC</td><td> Mutaciones activas (en comparación con la variante 6)</td>

<td> 255</td><td> +++</td><td> V28N;G71A;D74V;S619K</td>

<td> 256</td><td> +++</td><td> V28N;G71A;D74V;S619K</td>

<td> 257</td><td> +++</td><td> G71A;D74N;S619K</td>

<td> 258</td><td> +++</td><td> V28N;V56L;G71A;D74S;S619K</td>

<td> 259</td><td> + +</td><td> G71A;D74V;V618I;S619K</td>

<td> 260</td><td> + +</td><td> G71A;D74S;S619K</td>

<td> 261</td><td> + +</td><td> V28N;V56L;G71A;D74V</td>

<td> 262</td><td> + +</td><td> V28N;G71A;D74N;S619K</td>

<td> 263</td><td> + +</td><td> G71A;D74V;S619K</td>

<td> 264</td><td> + +</td><td> G71A;D74V</td>

<td> 265</td><td> + +</td><td> G71A;D74V</td>

<td> 266</td><td> + +</td><td> G71A;D74S</td>

<td> 267</td><td> + +</td><td> S619K</td>

<td> 268</td><td> + +</td><td> V28N;S619K</td>

<td> 269</td><td> + +</td><td> V28N;S619K</td>

<td> 270</td><td> + +</td><td> V28N;S619K</td>

<td> 271</td><td> + +</td><td> V28N;S619K</td>

<td> 272</td><td> + -f-</td><td> V28N;G71A;D74S</td>

<td> 273</td><td> + +</td><td> S619K</td>

<td> 274</td><td> + +</td><td> D74V;S619K</td>

<td> 275</td><td> + +</td><td> G71A;S619K</td>

<td> 276</td><td> + +</td><td> S619K</td>

<td> 277</td><td> + +</td><td> V28N;S619K</td>

<td> 278</td><td> + +</td><td> S619K</td>

<td> 279</td><td> + +</td><td> S619K</td>

<img file="MX381306B_D0065.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

<td> 280</td><td> + +</td><td> S619K</td>

<td> 281</td><td> ++</td><td> S619K</td>

<td> 282</td><td> + +</td><td> S619K</td>

<td> 283</td><td> +</td><td> V28N</td>

<td> 284</td><td> +</td><td> V28N</td>

<td> 285</td><td> +</td><td> V618I;S619K</td>

<td> 286</td><td> +</td><td> D74V</td>

<td> 287</td><td> +</td><td> S619K</td>

<td> 288</td><td> +</td><td> S619K</td>

<td> 289</td><td> +</td><td> S619K</td>

<td> 290</td><td> +</td><td> G71A</td>

<td> 291</td><td></td><td> D74T;K139I;S619K</td>

<td> 292</td><td></td><td> R455W</td>

FIOPC&lt;0.7

FIOPC = 0.7 a 1.3

FIOPC = 1.4 a 2.0 +++: FIOPC&gt;2.1

CUADRO 6.2 Mutaciones activas v resultados de FIOPC cara las variantes de la ronda 2 basadas en SEO ID NO:8 (Variante 53)

<td> Variante #</td><td> FIOPC</td><td> Mutaciones activas (en comparación con la variante 53)</td>

<td> 293</td><td> +++</td><td> G71A; D74V;D484N ;Q547K</td>

<td> 294</td><td> +++</td><td> G71A;D74S;D484N;Q547K</td>

<td> 295</td><td> +++</td><td> D484N;Q547K;S619K</td>

<td> 296</td><td> +++</td><td> G71A;D74S;D484N;Q547K</td>

<td> 297</td><td> +++</td><td> D74N;D484N</td>

<td> 298</td><td> +++</td><td> G71A;D484N;Q547K;V618I;S619K</td>

<td> 299</td><td> + + +</td><td> D74N;V264A;D484N;Q547K</td>

<td> 300</td><td> +++</td><td> D74T;D484N</td>

<td> 301</td><td> + +</td><td> G71A;V264A;D484N</td>

<td> 302</td><td> ++</td><td> V264A;D484N;Q547K</td>

<td> 303</td><td> ++</td><td> V264A;D484N</td>

<td> 304</td><td> + +</td><td> L56I;G71A;D74S;V264A;D484N;Q547K;S619K</td>

<td> 305</td><td> ++</td><td> D74S;D484N;V618I;S619K</td>

<td> 306</td><td> ++</td><td> D484N</td>

<td> 307</td><td> ++</td><td> D484N;Q547K</td>

<td> 308</td><td> ++</td><td> G71A;D74N;D484N;V618I</td>

<img file="MX381306B_D0066.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

<td> 309</td><td> 4-4-</td><td> D484N;Q547K</td>

<td> 310</td><td> ++</td><td> F27Y;N28V;D484N;Q547K;V618I</td>

<td> 311</td><td> ++</td><td> D484N;S619K</td>

<td> 312</td><td> 4-4-</td><td> D484N;Q547K;V618I;S619K</td>

<td> 313</td><td> 4-4-</td><td> D484N;V618I</td>

<td> 314</td><td> 4-4-</td><td> D74N;Q547K</td>

<td> 315</td><td> 4-4-</td><td> Q547K;V618I;S619K</td>

<td> 316</td><td> 4-4-</td><td> D74N;V264A</td>

<td> 317</td><td> 4-4-</td><td> Q547K;S619K</td>

<td> 318</td><td> 4-4-</td><td> G71A;D74V;V264A;Q547K;V618I</td>

<td> 319</td><td> +</td><td> Q547K;S619K</td>

<td> 320</td><td> +</td><td> V264A;V618I;S619K</td>

<td> 321</td><td> +</td><td> Q547K;V618I</td>

<td> 322</td><td> +</td><td> D74V;Q547K;S619K;A741T</td>

<td> 323</td><td> +</td><td> S619K</td>

<td> 324</td><td> +</td><td> V264A;Q547K</td>

<td> 325</td><td> +</td><td> Q547K;V618I;S619K</td>

<td> 326</td><td> +</td><td> Q547K</td>

<td> 327</td><td> +</td><td> D74V</td>

<td> 328</td><td> +</td><td> D74T</td>

<td> 329</td><td> +</td><td> V618I;S619K</td>

<td> 330</td><td> +</td><td> V264A;S619K</td>

<td> 331</td><td> +</td><td> G71A;V264A;Q547K</td>

<td> 332</td><td> +</td><td> V618I</td>

<td> 333</td><td> -</td><td> V264A</td>

FIOPC&lt;0.7

FIOPC = 0.7 a 1.3 ++: FIOPC = 1.4 a 2.0 +++: FIOPC&gt;2.1

Se ampliaron las variantes 6 (SEQ ID NO: 6), 258 (SEQ ID NO: 12) y 261 (SEQ ID NO: 10) en matraces de agitación y sus actividades se analizaron usando los protocolos descritos en los Ejemplos anteriores. Los resultados se muestran en la figura 3. Como se indicó, la variante 258 generó &gt; 99% de insulina libre en 6 horas en &lt;0.8 g/l de una carga de lisado en un matraz oscilante, liberando completamente la inhibición del sustrato, mientras que la variante 261 generó ~90% de insulina libre en 6 horas en una carga de lisado de 0.8 g/l.

Por lo tanto, la presente invención proporciona variantes de PGA que tienen una ^ΙΜΡΙ

INSTITUTO MEXICANO ^F DE LA PROPIEDAD

INDUSTRIAL mejora de 8 veces la actividad total. También se determinó que la sustitución S619K afecta en gran medida la actividad, mientras que la sustitución D484N afecta predominantemente la expresión.

S619K se localiza en la la capa del sitio de unión a insulina y D484N se localiza en la 2a capa del sitio activo.

EJEMPLO 7

Tolerancia de DMSO

Se realizó un estudio de tolerancia de DMSO sobre las variantes mejoradas de PGA (Variantes N°. 6, 258 y 261). Las reacciones se llevaron a cabo en presencia de 0-50% v/v de DMSO siguiendo el protocolo descrito en el Ejemplo 4. Los resultados (Véase, Figura 4) indican que todas las variantes probaron la actividad perdida tras la adición de DMSO a las reacciones de prueba. Por ejemplo, en 30% v/v de DMSO, solo se generó 30% de insulina libre mediante la Variante 258.

Todas las publicaciones, patentes, solicitudes de patente y otros documentos citados en esta solicitud se incorporan por referencia en su totalidad a todos los efectos en la misma medida que si cada publicación individual, patente, solicitud de patente u otro documento estuviera individualmente indicada para ser incorporada por referencia para todos los propósitos.

Aunque se han ilustrado y descrito varias modalidades ilustrativas, se apreciará que varios cambios pueden hacerse en éstas sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención.

<img file="MX381306B_D0067.tif" />

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL ω

co w o σ&gt;

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN