Stabilized formulations containing anti-pcsk9 antibodies

FORMULACIONES ESTABILIZADAS QUE CONTIENEN ANTICUERPOS ANTI-PCSK9

CAMPO

La presente invención se refiere al campo de las formulaciones de anticuerpos terapéuticos. Más específicamente, la presente invención se refiere al campo de formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo humano que se une específicamente a la proproteína humana convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9).

LISTADO DE SECUENCIAS

Un archivo de texto compatible ST.25 de un listado de secuencias se presenta al mismo tiempo que la presente memoria descriptiva. El contenido del archivo de texto se incorpora por referencia en la presente memoria. Como parte de la presente memoria descriptiva se incluye una copia en papel del listado de secuencias, que es idéntica en su contenido al archivo de texto compatible ST.25.

ANTECEDENTES

Las macromoléculas terapéuticas (p. ej., anticuerpos) deben formularse de forma que las moléculas sean no solo aptas para administrarlas a los pacientes, sino que además conserven su estabilidad durante su almacenamiento y uso posterior. Por ejemplo, los anticuerpos terapéuticos en solución líquida tienen tendencia a degradarse, agregarse o sufrir modificaciones químicas no deseadas, a menos que la solución se formule adecuadamente. La estabilidad de un anticuerpo en formulación líquida depende no solo de los tipos de excipientes utilizados en la formulación, sino también de las cantidades y proporciones de los excipientes entre sí. Además, aparte de la estabilidad, deben tenerse en cuenta otras consideraciones al preparar una formulación líquida de anticuerpos. Algunos ejemplos de dichas consideraciones adicionales incluyen la viscosidad de la solución y la concentración del anticuerpo que puede incorporarse en una formulación dada y la calidad visual o atractivo de la formulación. Por tanto, al formular un anticuerpo terapéutico, deberá tenerse mucho cuidado para llegar a una formulación que permanezca estable, que contenga una concentración adecuada del anticuerpo y que posea una viscosidad adecuada, así como otras propiedades que permitan administrar la formulación convenientemente a los pacientes.

IMPI en £

Los anticuerpos contra la proteína humana proproteína convertasa subtilisina/kexina tipo 9 (PCSK9) son un ejemplo de macromolécula con importancia terapéutica que requiere una formulación adecuada. Los anticuerpos anti-PCSK9 son clínicamente útiles para el tratamiento o prevención de enfermedades tales como la hipercolesterolemia y otras dislipidemias, así como otras afecciones. Anticuerpos anti-PCSK9 ejemplares se describen, entre otros, en los documentos WO 2008/057457, WO 2008/057458, WO 2008/057459, WO 2008/063382, WO 2008/125623, Patente de Estados Unidos N° 7.572.618, WO 2010/077854, US 2010/0166768 y US 2011/0065902.

Aunque se conocen anticuerpos anti-PCSK9, sigue existiendo en la técnica la necesidad de nuevas formulaciones farmacéuticas que comprendan anticuerpos antiPCSK9 que sean suficientemente estables y adecuados para su administración a los pacientes.

COMPENDIO

La presente invención satisface la necesidad anteriormente mencionada proporcionando formulaciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo humano que se une específicamente a la proteína humana proproteína convertasa subtil ¡si na/kexina tipo 9 (PCSK9).

En un aspecto, se proporciona una formulación farmacéutica líquida, que comprende: (i) un anticuerpo humano que se une específicamente a la proteína humana proproteína convertasa subtilisina/kexína tipo 9 (PCSK9); (i¡) un tampón; (iii) un codisolvente orgánico; (iv) un estabilizador y opcionalmente (v) un reductor de la viscosidad.

En una realización, el anticuerpo se proporciona a una concentración de aproximadamente 50 ± 7,5 mg/ml a aproximadamente 200 ± 30 mg/ml. En otra realización, el anticuerpo se proporciona a una concentración de aproximadamente 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml. En otra realización, el anticuerpo se proporciona a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml ±15 mg/ml. En otra realización, el anticuerpo se proporciona a una concentración de aproximadamente 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml. En otra realización, el anticuerpo se proporciona a una concentración de aproximadamente 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml. En otra realización, el anticuerpo se proporciona concentración de aproximadamente 200 mg/ml ± 30 mg/ml.

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En una realización, el anticuerpo comprende una o más de una secuencia de

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- <3

ΙΌ aminoácidos de SEC ID NO: 1-8. En una realización el anticuerpo comprende (a) una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende regiones determinantes de complementariedad de cadena pesada 1, 2 y 3 (HCDR1-HCDR2-HCDR3) comprendiendo cada una de ellas una secuencia de SEC ID N°: 2, SEC ID N°: 3 y SEC ID N°: 4, respectivamente y (b) una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende regiones determinantes de complementariedad 1, 2 y 3 (LCDR1-LCDR2-LCDR3) comprendiendo cada una de ellas una secuencia de SEC ID N°: 6, SEC ID N°: 7 y SEC ID N°: 8, respectivamente. En una realización específica, el anticuerpo comprende una HCVR y una LCVR, comprendiendo cada una de ellas la secuencia de aminoácidos de SEC ID N°: 1 y SEC ID N°: 5, respectivamente.

En una realización, el pH de la formulación líquida es aproximadamente pH 6,0 ± 0,5, pH 6,0 ± 0,4, pH 6,0 ± 0,3, pH 6,0 ± 0,2, pH 6,0 ± 0,1, pH 6,0 ± 0,05, pH 6,0 ± 0,01, o pH 6,0. En una realización específica, el pH de la formulación líquida es aproximadamente pH 6,0 ± 0,3. En una realización, el tampón farmacéutico líquido comprende uno o más tampones, que tiene un intervalo efectivo de tampón de aproximadamente pH 5,5 a aproximadamente pH 7,4 o un pKa de aproximadamente 6,0.

En una realización, el tampón es histidina. En una realización, la histidina está a una concentración de 5 mM ± 0,75 mM a 50 mM ± 7,5 mM. En una realización, la histidina está a una concentración de 10 mM ±1,5 mM o aproximadamente 10 mM. En una realización, la histidina está a una concentración de 20 mM ± 3 mM o aproximadamente 20 mM. En una realización, la histidina está a una concentración de 40 nM ± 6 mM o aproximadamente 40 nM.

En una realización, el codisolvente orgánico es un polímero no iónico que contiene un resto de polioxietileno. En algunas realizaciones, el codisolvente orgánico es uno cualquiera o más de polisorbato 20, poloxámero 188 y polietielenglicol 3350. En una realización específica, el codisolvente orgánico es polisorbato 20.

En una realización el codisolvente orgánico está a una concentración de aproximadamente 0,005% ± 0,00075% a aproximadamente 1% ± 0,15% de “peso respecto al volumen” o “p/v”, en donde, p. ej., 0,1 g/ml = 10% y 0,01 g/ml = 1%. En una realización, el codisolvente orgánico es polisorbato 20, que está a una concentración de aproximadamente 0,2% ± 0,03% p/v. En otra realización, el codisolvente orgánico es polisorbato 20, que está a una concentración de 0,01% ± 0,0015% p/v o £

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Ul

ΙΌ aproximadamente 0,01% p/v.

En una realización, el estabilizador es un azúcar. En una realización, el azúcar se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, manitol y trehalosa. En una realización específica, el estabilizador es sacarosa.

En una realización, el estabilizador está a una concentración de 1% ± 0,15% p/v a 20% ± 3% p/v. En una realización específica, el estabilizador es sacarosa a una concentración de 5% ± 0,75% p/v o aproximadamente 5% p/v. En otra realización específica, el estabilizador es sacarosa a una concentración de 10% ± 1,5% p/v o aproximadamente 10% p/v. En otra realización específica, el estabilizador es sacarosa a una concentración de 12% ± 1,8% p/v o aproximadamente 12% p/v.

En una realización, el reductor de la viscosidad es una sal seleccionada del grupo que consiste en clorhidrato de arginina, tiocianato de sodio, tiocianato de amonio, sulfato de amonio, cloruro de amonio, cloruro de calcio, cloruro de cinc y acetato de sodio. En una realización, el reductor de la viscosidad es un clorhidrato de L-arginina.

En una realización, el reductor de la viscosidad está a una concentración de 10 mM ± • 1,5 mM a 150 mM ± 22,5 mM. En una realización, el reductor de la viscosidad es clorhidrato de L-arginina a una concentración de 50 mM ± 7,5 mM o aproximadamente 50 mM. En una realización, el reductor de la viscosidad es clorhidrato de L-arginina a una concentración de 40 mM ± 6 mM o aproximadamente 40 mM.

En una realización, la viscosidad del líquido o formulación farmacéutica liofilizada reconstituida a 25 °C es menor que o igual a aproximadamente 15 cPoise ± 10%. En una realización, la viscosidad a 25 °C está entre 1,0 cPoise ± 10% y 18 cPoise ± 10%. En una realización, la viscosidad a 25 °C es 1,6 cPoise ± 10%, 1,7 cPoise ± 10%, 3,3 cPoise ± 10%, 3,5 cPoise ± 10%, 4,8 cPoise ± 10%, 6,0 cPoise ± 10%, 7,0 cPoise ± 10%, 7,1 cPoise ± 10%, 7,2 cPoise ± 10%, 7,9 cPoise ± 10%, 8,9 cPoise ± 10%, 10,0 cPoise ±

10%, 10,6 cPoise ±10%, 11,4 cPoise ±10%, 11,6 cPoise ±10%, 11,8 cPoise ±10%, 12,4 cPoise ± 10%, 13,9 cPoise ± 10%, 14,0 cPoise ± 10%, 15,5 cPoise ± 10% o 17,9 cPoise ± 10%.

En una realización, la osmolalidad de la formulación farmacéutica líquida está entre 100 ± 15 mOsm/kg y 460 ± 69 mOsm/kg. En una realización, la osmolalidad de la formulación farmacéutica líquida es 103 ± 15 mOsm/kg o aproximadamente 103 mOsm/kg. En una realización, la osmolalidad de la formulación farmacéutica líquida es *

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

195 ± 29 mOsm/kg o aproximadamente 195 mOsm/kg. En una realización, la osmolalidad de la formulación farmacéutica líquida es 220 ± 33 mOsm/kg o aproximadamente 220 mOsm/kg. En una realización, la osmolalidad de la formulación farmacéutica líquida es 330 ± 50 mOsm/kg o aproximadamente 330 mOsm/kg. En una realización, la osmolalidad de la formulación farmacéutica líquida es 435 + 65 mOsm/kg o aproximadamente 435 mOsm/kg. En una realización, la osmolalidad de la formulación farmacéutica líquida es

440 ± 66 mOsm/kg o aproximadamente 440 mOsm/kg. En una realización, la osmolalidad de la formulación farmacéutica líquida es 458 ± 69 mOsm/kg o aproximadamente 458 mOsm/kg.

En una realización, al menos el 96% o al menos el 97% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 no agregada y no degradada se recupera de la formulación farmacéutica líquida después de tres meses de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a -80 °C, tal y como determinó la cromatografía de exclusión por tamaño. En una realización, al menos el 56% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 no básica y no ácida (es decir, el pico principal o la forma con carga principal) se recupera de la formulación r farmacéutica líquida después de tres meses de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a -80 °C, tal y como determinó la cromatografía de intercambio iónico.

En una realización, al menos el 96% o al menos el 97% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 no agregada y no degradada se recupera de la formulación farmacéutica líquida después de tres meses de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a -30 °C, tal y como determinó la cromatografía de exclusión por tamaño. En una realización, al menos el 56% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 con carga principal se recupera de la formulación farmacéutica líquida después de tres meses de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a -30 °C, tal y como determinó la cromatografía de intercambio iónico.

En una realización, al menos el 96% o al menos el 97% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 no agregada y no degradada se recupera de la formulación farmacéutica líquida después de tres meses de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a -20 °C, tal y como determinó la cromatografía de exclusión por tamaño. En una realización, al menos el 56% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 con carga principal se recupera de la formulación farmacéutica líquida después de tres meses de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a -20 °C, tal y como determinó la

ΙΌ

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IN TITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL cromatografía de intercambio iónico.

En una realización, al menos el 96% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 no agregada y no degradada se recupera de la formulación farmacéutica líquida después de seis meses de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a 5 °C, tal y como determinó la cromatografía de exclusión por tamaño. En una realización, al menos el 58% el 59% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 con carga principal se recupera de la formulación farmacéutica líquida después de tres meses de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a 5 °C, tal y como determinó la cromatografía de intercambio iónico.

En una realización, al menos el 94% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 no agregada y no degradada se recupera de la formulación farmacéutica líquida después de seis meses de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a 25 °C, tal y como

L determinó la cromatografía de exclusión por tamaño. En una realización al menos el 45% o el 47% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 no básica y no acida se recupera de la formulación farmacéutica líquida después de seis meses de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a 25 °C, tal y como determinó la cromatografía de intercambio iónico.

En una realización, al menos el 91% o el 92% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 no agregada y no degradada se recupera de la formulación farmacéutica líquida después de 28 días de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a 45 °C, tal y como determinó la cromatografía de exclusión por tamaño. En una realización, al menos el 35% o el 37% de la forma del anticuerpo anti-PCSK9 no básica y no acida se recupera de ia

I formulación farmacéutica líquida después de 28 días de almacenamiento de la formulación farmacéutica líquida a 45 °C, tal y como determinó la cromatografía de intercambio iónico.

En un aspecto, se proporciona una formulación farmacéutica líquida que comprende: (í) de 50 ± 7,5 mg/ml a 175 ± 26 mg/ml de un anticuerpo humano que se une específicamente a la PCSK9 humana; (ii) de 0 mM a 40 ± 6 mM de histidina; (iii) de 0% a 0,2% ± 0,03% (p/v) de polisorbato 20; (¡v) de 0% a 12% ± 1,8% (p/v) de sacarosa y (v) de 0 mM a 50 ± 7,5 mM de arginina, a un pH de aproximadamente 5,3 a aproximadamente 6,7. El anticuerpo anti-PCSK9 de este aspecto comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR) de forma que la combinación HCVR / LCVR comprende regiones determinantes de complementariedad de w en CD

ΙΌ £

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N) cadena pesada y ligera (HCDR1-HCDR2-HCDR3 / LCDR1-LCDR2-LCDR3), que comprenden las secuencias de aminoácidos de SEC ID N°: 2-3-4 / SEC ID NO; 6-7-8, respectivamente. En una realización en particular, el anticuerpo anti-PCSK9 comprende una región variable de cadena pesada (HCVR) y una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende una secuencia de aminoácidos de SEC ID NO: 1 y SEC ID NO: 5, respectivamente (en adelante “mAb-316P).

En una realización de este aspecto, la formulación líquida comprende (i) 50 ± 7,5 mg/ml de mAb-316P; (ii) 10 ± 1,5 mM de histidina; (iii) 0,1% ± 0,015% (p/v) de polisorbato 20 y (iv) 6% ± 0,9% (p/v) de sacarosa, a un pH 6,0 ± 0,3. En una realización de esta formulación en particular, la viscosidad es de aproximadamente 1,7 cPoise. En una realización de esta formulación en particular, la osmolalidad es 220 ± 44 mOsm/kg.

En otra realización, la formulación líquida comprende (i) 100 ± 20 mg/ml de mAb316P; (ii) 20 ± 4 mM de histidina; (iii) 0,2% ± 0,04% (p/v) de polisorbato 20 y (iv) 12% ± 2,4% (p/v) de sacarosa, a un pH 6,0 ± 0,3. En una realización de esta formulación en particular, la viscosidad es aproximadamente 3,5 cPoise. En una realización de esta formulación en particular, la osmolalidad es 440 ± 88 mOsm/kg.

En otra realización, la formulación líquida comprende (i) 150 ± 22,5 mg/ml de mAb316P; (ii) 10 ± 1,5 mM de histidina; (iii) 0,2% ± 0,03% o 0,01% ± 0,0015% (p/v) de polisorbato 20 y (iv) 10% ± 1,5% (p/v) de sacarosa, a un pH 6,0 ± 0,3. En una realización de esta formulación en particular, la viscosidad es de aproximadamente 6 cPoise. En una realización de esta formulación particular, la osmolalidad es 435 ± 65,25 mOsm/kg. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la formulación a 45 ° durante 28 días, > 92% del anticuerpo es nativo y > 35% del anticuerpo está en la forma con carga principal. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la formulación a 25 durante seis meses, > 94% del anticuerpo es nativo y > 45% del anticuerpo está en la forma con carga principal. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la formulación a 5 durante seis meses, > 96% del anticuerpo es nativo y > 58% del anticuerpo está en la forma con carga principal. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la formulación a -20 ° durante doce meses, > 97% del anticuerpo es nativo y > 56% del anticuerpo está en la forma con carga principal. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la

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Ü1

K) formulación a -80 durante doce meses, > 97% del anticuerpo es nativo y > 56% del anticuerpo está en la forma con carga principal. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la formulación a -80 ⁰ durante doce meses, > 97% del anticuerpo es nativo y > 56% del anticuerpo está en la forma con carga principal.

En algunas realizaciones de esta formulación en particular, > 85% del anticuerpo retiene su poder biológico después de 28 días a 45 °C, > 82% después de 28 días a 37 °C y/o > 98% después de 28 días a 25 °C. En algunas realizaciones de esta formulación en particular, > 85% del anticuerpo retiene su poder biológico después de seis meses a -20 °C, > 70% después de seis meses a -30 °C y/o > 79% después de seis meses a -80 °C. En algunas realizaciones de esta formulación en particular, > 81% del anticuerpo retiene su potencia biológica después de ocho ciclos hielo-deshielo y/o > 84% del anticuerpo retiene su actividad biológica después de 120 minutos de agitación.

En otra realización de este aspecto, la formulación líquida comprende (i) 175 ± 26,25 mg/ml de mAb-316P; (i¡) 10 ± 1,5 mM de histidina; (iii) 0,01% + 0,0015% (p/v) de polisorbato 20; (iv) 5% ± 0,75% (p/v) de sacarosa y (v) 50 ± 7,5 mM de arginina, a un pH 6,0 ± 0,3. En una realización de esta formulación en particular, la viscosidad es de aproximadamente 10,6 cPoise. En una realización de esta formulación en particular, la osmolalidad es 330 ± 50 mOsm/kg. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la formulación a 45 durante 28 días, > 91% del anticuerpo es nativo y el 38% del anticuerpo está en la forma con carga principal. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la formulación a 25 durante seis meses, > 94% del anticuerpo es nativo y > 47% del anticuerpo está en la forma con carga principal. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la formulación a 5 durante seis meses, >

96% del anticuerpo es nativo y > 59% del anticuerpo está en la forma con carga principal. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la formulación a -20 durante tres meses, > 96% del anticuerpo es nativo y > 56% del anticuerpo está en la forma con carga principal. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la formulación a -80 ⁰ durante tres meses, > 96% del anticuerpo es nativo y > 56% del anticuerpo está en la forma con carga principal. En una realización de esta formulación en particular, después del almacenamiento de la £

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U1

K) formulación a -80 ⁰ durante tres meses, > 96% del anticuerpo es nativo y > 56% del anticuerpo está en la forma con carga principal.

En un aspecto, se proporciona una formulación farmacéutica líquida de cualquiera de los aspectos precedentes en un envase. En una realización, el envase es un vial de policarbonato. En otra realización, el envase es un vial de cristal. En una realización, el vial de cristal es un vial de cristal de borosilicato tipo 1 con un tapón de goma butilo cubierto de fluorocarbono. En otra realización, el envase es un microinfusor. En otra realización, el envase es una jeringa. En una realización específica, la jeringa comprende un émbolo cubierto de fluorocarbono. En una realización específica, la jeringa es una jeringa de cristal de 1 mi de longitud que contiene menos de aproximadamente 500 partes por billón de tungsteno equipada con una aguja 27-G, un tapón de goma butilo cubierto de fluorocarbono y un capuchón con punta de goma sin látex y no citotóxica. En una realización más específica, la jeringa es una jeringa de cristal NUOVA OMPI de 1 mi de longitud equipada con una aguja de pared fina 27-G, un tapón de goma 4023/50 cubierto de FLUROTEC y un capuchón con punta de goma FM 27. En otra realización específica, la jeringa es una jeringa de plástico de 1 mi o 3 mi provista de una aguja 27-G. En una realización más específica, la jeringa de plástico la distribuye BECTON DICKINSON.

En un aspecto, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende (a) 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml de un anticuerpo anti-PCSK9, (b) 10 mM ± 1,5 mM de histidina, pH 6 ± 0,3, (c) 0,01% p/v ± 0,0015% de polisorbato 20, (d) 5% p/v ± 0,75% de sacarosa y (e) 50 mM ± 7,5 mM de arginina, en donde (a) el anticuerpo comprende un HCVD con SEC ID N°: 1 y un LCVD con SEC ID N°: 5, (b) más del 90% de los anticuerpos de la formulación tienen un peso molecular de 155 kDa ± 1 kDa, (c) más del 50% de los anticuerpos de la formulación tienen un punto isoeléctrico de aproximadamente 8,5 y (d) del 75% al 90% de los anticuerpos de la formulación están fucosilados.

En una realización, la formulación farmacéutica consiste en (a) 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml del anticuerpo anti-PCSK9 del párrafo inmediatamente precedente, (b) 10 mM ±1,5 mM de histidina, pH 6 ± 0,3, (c) 0,01% p/v ± 0,0015% de polisorbato 20, (d) 5% p/v ± 0,75% de sacarosa y (e) 50 mM ± 7,5 mM de arginina, en agua.

En un aspecto, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende (a) 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml de un anticuerpo anti-PCSK9, (b) 10 mM ±1,5 mM de histidina, pH 6 ± 0,3, (c) 0,2% p/v ± 0,03% de polisorbato 20, y (d) 10% p/v ± 1,5% de sacarosa, en σι

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INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

ΙΌ donde (i) el anticuerpo comprende un HCVD con SEC ID N°: 1 y un LCVD con SEC ID N°: 5, (ii) más del 90% de los anticuerpos de la formulación tienen un peso molecular de 155 kDa ± 1 kDa, (iii) más del 50% de los anticuerpos de la formulación tienen un punto isoeléctrico de aproximadamente 8,5, y (iv) del 75% al 90% de los anticuerpos de la formulación están fucosilados.

En una realización, la formulación farmacéutica consiste en (a) 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml del anticuerpo anti-PCSK9 del párrafo inmediatamente precedente, (b) 10 mM ±1,5 mM de histidina, pH 6 ± 0,3, (c) 0,2% p/v ± 0,03% de polisorbato 20 y (d) 10% p/v ± 1,5% de sacarosa, en agua.

En un aspecto, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende (a) 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml de un anticuerpo anti-PCSK9, (b) 10 mM ±1,5 mM de histidina, pH 6 ± 0,3, (c) 0,01% p/v ± 0,0015% de polisorbato 20, y (d) 10% p/v ± 1,5% de sacarosa, en donde (i) el anticuerpo comprende un HCVD de SEC ID N°: 1 y un LCVD de SEC ID N°: 5, (¡i) más del 90% de los anticuerpos tienen un peso molecular de 155 kDa ± 1 kDa, (iii) más del 50% de los anticuerpos de la formulación tienen un punto isoeléctrico de aproximadamente 8,5 y (iv) del 75% al 90% de los anticuerpos de la formulación están fucosilados.

En una realización, la formulación farmacéutica consiste en (a) 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml del anticuerpo anti-PCSK9 del párrafo inmediatamente precedente, (b) 10 mM ±1,5 mM de histidina, pH 6 ± 0,3, (c) 0,01% p/v ± 0,0015% de polisorbato 20 y (d) 10% p/v ± 1,5% de sacarosa, en agua.

En un aspecto, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende (a) 100 mg/ml ±15 mg/ml de un anticuerpo anti-PCSK9, (b) 20 mM ± 3 mM de histidina, pH 6 ± 0,3, (c) 0,2% p/v ± 0,03% de polisorbato 20 y (d) 12% p/v ± 1,8% de sacarosa, en donde (i) el anticuerpo comprende un HCVD con SEC ID N°: 1 y un LCVD con SEC ID N°: 5, (ii) más del 90% de los anticuerpos de la formulación tienen un peso molecular de 155 kDa ± 1 kDa, (iii) más del 50% de los anticuerpos de la formulación tienen un punto isoeléctrico de aproximadamente 8,5 y (iv) del 75% al 90% de los anticuerpos de la formulación están fucosilados.

En una realización, la formulación farmacéutica consiste en (a) 100 mg/ml ±15 mg/ml del anticuerpo anti-PCSK9 del párrafo inmediatamente precedente, (b) 20 mM ± 3 mM de histidina, pH 6 ± 0,3, (c) 0,2% p/v ± 0,03% de polisorbato 20 y (d) 12% p/v ± 1,8% de

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- <3

ΙΌ sacarosa, en agua.

En un aspecto, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende (a) 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml de un anticuerpo, (b) 10 mM ±1,5 mM de histidina, pH 6 ± 0,3, (c) 0,1% p/v ± 0,015% de polisorbato 20 y (d) 6% p/v ± 0,9% de sacarosa, en donde (i) el anticuerpo comprende un HCVD de SEC ID N°: 1 y un LCVD de SEC ID N°: 5, (ii) más del 90% de los anticuerpos de la formulación tienen un peso molecular de 155 kDa ± 1 kDa, (¡ii) más del 50% de los anticuerpos de la formulación tienen un punto isoeléctrico de aproximadamente 8,5 y (iv) del 75% al 90% de los anticuerpos de la formulación están fucosilados.

En una realización, la formulación farmacéutica consiste en (a) 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml del anticuerpo anti-PCSK9 del párrafo inmediatamente precedente, (b) 10 mM ±1,5 mM de histidina, pH 6 ± 0,3, (c) 0,1% p/v ± 0,015% de polisorbato 20 y (d) 6% p/v ± 0,9% de sacarosa, en agua.

En un aspecto, se proporciona un método para preparar una composición liofilizada que comprende un anticuerpo anti-PCSK9 y menos del 0,3% de agua. El método comprende las etapas de (a) combinar en un vial de cristal agua, un anticuerpo antiPCSK9, histidina, sacarosa y polisorbato 20, (b) a continuación mantener la combinación aproximadamente 5 °C durante aproximadamente 60 minutos, (c) a continuación disminuir la temperatura a una proporción de aproximadamente 0,5 °C por minuto, (d) a continuación mantener la combinación aproximadamente -45 °C durante aproximadamente 120 minutos, (e) a continuación reducir la presión atmosférica a aproximadamente 100 mTorr, (f) a continuación aumentar la temperatura a una proporción de aproximadamente 0,5 °C por minuto, (g) a continuación mantener la combinación a aproximadamente -25 °C durante aproximadamente 78 horas, (h) a continuación aumentar la temperatura a una proporción de 0,2 °C por minuto, (i) a continuación mantener a aproximadamente 35 °C durante aproximadamente 6 horas, (j) a continuación disminuir la temperatura a una proporción de aproximadamente 0,5 °C, (k) y mantener la combinación a aproximadamente 25 ° durante aproximadamente 60 minutos, antes de su almacenamiento.

En una realización, el método comprende además las etapas de (I) rellenar el vial de cristal que contiene la combinación de la etapa (k) con gas nitrógeno y (m) cerrar el vial a presión atmosférica de aproximadamente 80%. En una realización, la composición se lleva a 2-8 °C después de la etapa (i), (j) o (k) y antes de la etapa de cierre del vial.

IMPI

OI

En algunas realizaciones, en la etapa (a) el anticuerpo anti-PCSK9 está a 50 mg/ml ±

7,5 mg/ml, la histidina está a 10 mM ±1,5 mM (pH 6,0), el polisorbato 20 está al 0,1% ± 0,015%, y la sacarosa está al 6% ± 0,9%. En una realización, el anticuerpo anti-PCSK9 comprende una HCDR1 de SEC ID N°: 2, una HCDR2 de SEC ID N°: 3, una HCDR3 de SEC ID N°: 4, una LCDR1 de SEC ID N°: 6, una LCDR2 de SEC ID N°: 7 y una LCDR3 de SEC ID N°: 8. mAb-316P. En una realización, el anticuerpo anti-PCSK9 comprende un HCVD de SEC ID N°: 1 y un LCVD de SEC ID N°: 5. En una realización, (i) el anticuerpo comprende un HCVD de SEC ID N°: 1 y un LCVD de SEC ID N°: 5, (ii) más del 90% de los anticuerpos de la combinación tienen un peso molecular de 155 kDa ± 1 kDa, (iii) más del 50% de los anticuerpos de la combinación tienen un punto isoeléctrico de aproximadamente 8,5 y (iv) del 75% al 90% de los anticuerpos de la combinación están fucosilados.

En un aspecto, se proporciona una composición farmacéutica liofilizada que comprende un anticuerpo anti-PCSK9 y menos del 0,3% de agua, producida según el método del aspecto precedente. F

En un aspecto, se proporciona una composición farmacéutica, que comprende la composición farmacéutica liofilizada del aspecto precedente resuspendida en agua. En una realización, la composición farmacéutica consiste en 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml del anticuerpo anti-PCSK9, 10 mM ±1,5 mM de histidina (pH 6,0), 0,1% ± 0,015% de polisorbato 20 y 6% ± 0,9% de sacarosa, en agua. En una realización, la composición farmacéutica consiste en 100 mg/ml ±15 mg/ml del anticuerpo anti-PCSK9, 20 mM ± 3 mM de histidina (pH 6,0), 0,2% ± 0,03% de polisorbato 20 y 12% ± 1,8% de sacarosa, en agua. En otra realización, la composición farmacéutica consiste en 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml de anticuerpo anti-PCSK9, 30 mM ± 4,5 mM de histidina (pH 6,0), 0,3% ± 0,045% de polisorbato 20 y 18% ± 2,7% de sacarosa, en agua. En otra realización adicional la composición farmacéutica consiste en 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml del anticuerpo antiPCSK9, 35 mM ± 5,25 mM de histidina (pH 6,0), 0,35% ± 0,0525% de polisorbato 20 y 21% ± 3,15% de sacarosa, en agua.

En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-PCSK9 comprende un HCVD de SEC ID N°: 1 y un LCVD de SEC ID N°: 5 y (b) más del 90% de los anticuerpos de la composición tienen un peso molecular de 155 kDa ± 1 kDa, (c) más del 50% de los anticuerpos de la composición tiene un punto isoeléctrico de aproximadamente 8,5 y (d) del 75% al 90% de

IMPI

Ü1

N) los anticuerpos de la composición están fucosilados.

En un aspecto, se proporciona una composición farmacéutica de cualquiera de los aspectos precedentes, en donde dicha composición está contenida en un envase. En una realización, el envase es un vial, el cual, en algunas realizaciones, es un vial de cristal. En otra realización, el envase es una jeringa. En algunas realizaciones, la jeringa es una jeringa de cristal con bajo contenido de tungsteno. En una realización, la jeringa es una jeringa de cristal NUOVA OMPI de 1 mi de longitud equipada con una aguja de pared fina 27-G, un tapón de goma 4023/50 cubierto de FLUROTEC y un capuchón con punta de goma FM 27.

En un aspecto, se proporciona un kit que comprende una composición farmacéutica de cualquiera de los aspectos precedentes, un envase e instrucciones. En una realización, el envase es una jeringa precargada. En una realización en particular, la jeringa es una jeringa de cristal NUOVA OMPI de 1 mi de longitud equipada con una aguja de pared fina 27-G, un tapón de goma 4023/50 cubierto de FLUROTEC y un capuchón con punta de goma FM 27.

Otras realizaciones de la presente invención resultarán obvias tras la revisión de la descripción detallada a continuación.

DESCRIPCION DETALLADA

Antes de describir la presente invención, deberá entenderse que esta invención no se limita a los métodos particulares y condiciones experimentales descritas, ya que dichos métodos y condiciones pueden variar. Deberá entenderse además que la terminología empleada en esta memoria se utiliza únicamente con el fin de describir realizaciones en particular y no pretender ser limitativa, ya que el alcance de la presente invención estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina de otra forma, todos los términos técnicos y específicos empleados en esta memoria tienen el mismo significado que generalmente le daría un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención. Tal y como se emplea en la presente memoria, el término “aproximadamente”, cuando se usa en referencia a un valor numérico o intervalo de valores citados en particular, significa que el valor puede variar respecto al valor citado en no más del 1%. Por ejemplo, tal y como ya se ha empleado en esta memoria, la expresión “aproximadamente 100” incluye 99 y 101 y todos los valores entre ellos (p. ej., 99,1, 99,2, 99,3, 99,4, etc.).

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IMPI σι

ΙΌ

Aunque algunos métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en esta memoria pueden utilizarse en la práctica o análisis de la presente invención, los métodos y materiales preferidos se describen a continuación. Todas las publicaciones mencionadas en esta memoria se incorporan en la misma por referencia para describirla en su totalidad.

FORMULACIONES FARMACÉUTICAS

Tal y como se utiliza en esta memoria, la expresión “formulación farmacéutica” significa una combinación de al menos un principio activo (p. ej., una molécula pequeña, macromolécula, compuesto, etc. que es capaz de ejercer un efecto biológico en un ser humano o en un animal no humano) y al menos un principio inactivo que, al combinarse con el principio activo o uno o más de los principios inactivos adicionales, es apta para su administración terapéutica a un ser humano o a un animal no humano. El término “formulación”, tal y como se emplea en esta memoria, significa “formulación farmacéutica , a menos que se indique específicamente lo contrario. La presente invención proporciona formulaciones farmacéuticas que comprenden al menos un polipéptido terapéutico. Según ciertas realizaciones de la presente invención, el polipéptido terapéutico es un anticuerpo, o un fragmento del mismo que se une a un antígeno, que se une específicamente a la proteína humana proproteína convertasa subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9). Más específicamente, la presente invención incluye formulaciones farmacéuticas que comprenden: (i) un anticuerpo humano que se une específicamente a la PCSK9 humana (ii) un tampón de histidina; (iii) un codisolvente orgánico que es un tensioactivo no iónico; (iv) un estabilizador térmico que es un carbohidrato y, opcionalmente, (v) un reductor de la viscosidad que es una sal. A continuación se describen en detalle componentes y formulaciones específicas a modo de ejemplo que se incluyen en la presente invención.

ANTICUERPOS QUE SE UNEN ESPECIFICAMENTE A LA PCSK9

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender un anticuerpo humano, o un fragmento del mismo que se une a un antígeno, que se une específicamente a la PCSK9 humana. Tal y como se emplea en esta memoria, el término “PCSK9” significa una proproteína humana convertasa que pertenece a la subfamilia de la proteinasa K de la familia de la subtilasa secretora. Las pruebas sugieren que la PCSK9 £

IMPI σι

Μ aumenta los niveles de LDL del plasma al unirse al receptor de la partícula de lipoproteína de baja densidad y promover su degradación. Una secuencia de aminoácido PCSK9 humano ejemplar se describe en SEC ID N°: 9. Los anticuerpos contra la PCSK9 humana se describen en las solicitudes de publicación de patente US 2010/0166768, US 2011/0065902 y WO 2010/077854.

El término “anticuerpo” tal y como se emplea en esta memoria, generalmente se refiere a moléculas de inmunoglobulina que comprende cuatro cadenas polipeptídicas, dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por enlaces disulfuro, así como sus multímeros (p. ej., IgM); sin embargo, las moléculas de inmunoglobulina que consisten solo en cadenas pesadas (es decir, que no tienen cadenas ligeras) se incluyen también en la definición del término anticuerpo. Cada una de las cadenas pesadas comprende una región variable de cadena pesada (abreviada en esta memoria como HCVR o V_H) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada comprende tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera comprende una región variable de cadena ligera (abreviada en esta memoria como LCVR o V_L) y una región constante de cadena ligera. La región constante de cadena ligera comprende un dominio (CL1). Las regiones V_H y V_L pueden subdividirse además en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad (CDR), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones de marco (FR). Cada V_H y V_L está compuesta de tres CDR y cuatro FR, dispuestas desde el extremo amino al extremo carboxilo en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

A menos que se indique específicamente lo contrario, se deberá entender que el término “anticuerpo”, tal y como se emplea en esta memoria, incluye moléculas de anticuerpo completas así como fragmentos de los mismos que se unen a antígenos. El término “porción que se une a un antígeno” o “fragmento que se une a un antígeno” de un anticuerpo (o simplemente “porción de anticuerpo” o “fragmento de anticuerpo”) tal y como se emplea en esta memoria, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conservan la habilidad de unirse específicamente a la PCSK9 humana o a un epítopo de la misma.

Un “anticuerpo aislado”, tal y como se emplea en esta memoria, pretende hacer referencia a un anticuerpo que está substancialmente libre de otros anticuerpos que tienen otras especificidades antigénicas diferentes (p. ej., un anticuerpo aislado que se £

IMPI σι une específicamente a la PCSK9 humana está sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos diferentes a la PCSK9 humana).

La expresión “se une específicamente”, o similar, significa que un anticuerpo o fragmento del mismo se une a un antígeno que forma un compuesto con un antígeno que es relativamente estable en condiciones fisiológicas. La unión específica puede estar caracterizada por una constante de disociación de al menos aproximadamente 1x10 M o mayor. Los métodos para determinar si dos moléculas se unen específicamente son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, diálisis de equilibrio, resonancia de plasmón superficial, y similares. Un anticuerpo aislado que se une específicamente a la PCSK9 humana puede, sin embargo, tener reactividad cruzada con otros antígenos, como las moléculas de PCSK9 de otras especies (ortólogos). En el contexto de la presente invención, se considera que los anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, biespecíficos) que se unen a la PCSK9 humana y a uno o más antígenos adicionales se tt unen específicamente” a la PCSK9 humana. Además, un anticuerpo aislado puede estar sustancialmente libre de otros materiales celulares o productos químicos.

Los anticuerpos anti PCSK9 humana ejemplares que pueden incluirse en las formulaciones farmacéuticas de la presente invención están establecidos en las publicaciones de solicitud de patente US 2010/0166768, US 2011/0065902 y WO 2010/077854, cuyas descripciones se incorporan por referencia en su totalidad.

Según ciertas realizaciones de la presente invención, el anticuerpo mAb-316P antiPCSK9 humana es una lgG1 humana que comprende una región variable de cadena pesada que es del subtipo IGHV3-23 y una región variable de cadena ligera que es del subtipo IGKV4-1 (véase Barbie y Lefranc, The Human Immunoglobulin Kappa Variable (IGKV) Genes and Joining (IGKJ) Segmente, Exp. Clin. Immunogenet. 1998; 15: 171-183; y Scaviner, D. et al., Protein Displays of the Human Immunoglobulin Heavy, Kappa and Lambda Variable and Joining Regions, Exp. Clin. Immunogenet., 1999; 16: 234-240).

En algunas realizaciones, el mAb-316P anti-PCSK9 humana comprende al menos una sustitución de aminoácido, que resulta en un cambio de carga en una superficie expuesta del anticuerpo relativo a la secuencia de línea germinal IGKV4-1. La secuencia de línea germinal IGKV4-1, y los números de designación de la posición del aminoácido presentados en esta memoria van acordes con el sistema de información internacional de ImMunoGeneTics (IMGT), según se describe en Lefranc, M.-P., et al., IMGT®, the International ImMunoGeneTics Information system®, Nucí. Acids Res, 37, D1006-D1012 κ

m

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL (2009). En algunas realizaciones, la superficie expuesta comprende una región determinante de complementariedad (CDR). En algunas realizaciones, la sustitución o sustituciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en un aminoácido básico sustituido por un aminoácido polar no cargado dentro de la CDR1 (p. ej., en la posición 32) de la IGKV4-1. Se esperaría que las permutaciones únicas en la distribución de la carga de un anticuerpo, especialmente en una interfaz ambiental (como, p. ej., en una

CDR), crearan condiciones impredecibles a la hora de mantener o avanzar la estabilidad del anticuerpo en solución.

En algunas realizaciones, el anticuerpo mAb-316P anti-PCSK9 humana comprende al menos una sustitución de aminoácido, lo que crea un cambio de carga dentro de una región marco de una región variable del anticuerpo relativa a la secuencia de línea germinal IGHV3-23 o la secuencia de línea germinal IGKV4-1. En algunas realizaciones la sustitución o sustituciones de aminoácidos se seleccionan del grupo que consiste en (a) un aminoácido hidrófobo sustituido por un aminoácido polar en la región marco 3 (FR3) (p. ej., en la posición 77) de la IGHV3-23, y (b) un aminoácido polar sustituido por un aminoácido básico en la región marco 2 (FR2) (por ejemplo, en la posición 51) de la IGKV4-1. Se esperaría que los cambios en cuanto a la capacidad de plegamiento de la cadena peptídica, especialmente dentro de una región marco, que afecta a la interfaz de la CDR con el disolvente, crearan condiciones impredecibles a la hora de mantener o avanzar la estabilidad del anticuerpo en solución.

Según ciertas realizaciones de la presente invención, el anticuerpo anti-PCSK9 humana, o fragmento del mismo que se une a un antígeno, comprende una región determinante de complementariedad de cadena pesada (HCDR) 1 de SEC ID N°: 2, una HCDR2 de SEC ID N°: 3 y una HCDR3 de SEC ID N°: 4. En ciertas realizaciones, el anticuerpo anti-PCSK9 humana, o fragmento del mismo que se une a un antígeno, comprende un HCVD de SEC ID N°: 1.

Según ciertas realizaciones de la presente invención, el ant¡-PCSK9 humana, o fragmento del mismo que se une a un antígeno, comprende una región determinante de complementariedad de cadena (kappa) ligera (LCDR) 1 de SEC ID N°: 6, una LCDR2 de SEC ID N°: 7 y una LCDR3 de SEC ID N°: 8. En ciertas realizaciones el anticuerpo antiPCSK9 humana, o fragmento del mismo que se une a un antígeno, comprende un LCVD de SEC ID N°: 5.

Se hace referencia al anticuerpo ejemplar no limitativo utilizado en los Ejemplos de la κ>

IMPI presente memoria como “mAb-316P”. También se hace referencia a este anticuerpo en el documento US 7.608.693 como H4H098P. El mAb-316P (H4H098P) comprende un par de secuencias de aminoácidos que tienen HCVR/LCVR de SEC ID N°: 1/5 y dominios HCDR1-HCDR2-HCDR3 / LCDR1-LCDR2-LCDR3 representados por las SEC ID Nos: 23-4 / SEC ID Nos: 6-7-8.

La cantidad de anticuerpo, o de fragmentos de unión a antígeno del mismo, contenida dentro de las formulaciones farmacéuticas de la presente invención puede variar dependiendo de las propiedades específicas deseadas de las formulaciones, así como de las circunstancias y fines particulares para los que se pretenda utilizar las formulaciones. En ciertas realizaciones, las formulaciones farmacéuticas son formulaciones líquidas que pueden contener 50 ± 7,5 mg/ml a 250 ± 37,5 mg/ml del anticuerpo; 60 ± 9 mg/ml a 240 ± 36 mg/ml del anticuerpo; 70 ± 10,5 mg/ml a 230 ± 34,5 mg/ml del anticuerpo; 80 ± 12 mg/ml a 220 ± 33 mg/ml del anticuerpo; 90 ± 13,5 mg/ml a 210 ± 31,5 mg/ml del anticuerpo; 100 ± 15 mg/ml a 200 + 30 mg/ml del anticuerpo; 110 ± 16,5 mg/ml a 190 ± 28,5 mg/ml del anticuerpo; 120 ± 18 mg/ml a 180 ± 27 mg/ml del anticuerpo; 130 ± 19,5 mg/ml a 170 ± 25,5 mg/ml del anticuerpo; 140 ± 21 mg/ml a 160 ± 24 mg/ml del anticuerpo; 150 ± 22,5 mg/ml del anticuerpo; o 175 ± 26,25 mg/ml. Por ejemplo, las formulaciones de la presente invención pueden comprender aproximadamente 50 mg/ml; aproximadamente 60 mg/ml; aproximadamente 65 mg/ml; aproximadamente 70 mg/ml; aproximadamente 75 mg/ml; aproximadamente 80 mg/ml; aproximadamente 85 mg/ml; aproximadamente 90 mg/ml; aproximadamente 95 mg/ml; aproximadamente 100 mg/ml; aproximadamente 105 mg/ml; aproximadamente 110 mg/ml; aproximadamente 115 mg/ml; aproximadamente 120 mg/ml; aproximadamente 125 mg/ml; aproximadamente

130 mg/ml;

aproximadamente 135 mg/ml;

aproximadamente 140 mg/ml;

aproximadamente 145 mg/ml; aproximadamente 150 mg/ml; aproximadamente 155 mg/ml; aproximadamente 160 mg/ml; aproximadamente 165 mg/ml; aproximadamente

170 mg/ml;

aproximadamente 175 mg/ml;

aproximadamente 180 mg/ml;

aproximadamente 185 mg/ml; aproximadamente 190 mg/ml; aproximadamente 195 mg/ml; aproximadamente 200 mg/ml; aproximadamente 205 mg/ml; aproximadamente

210 mg/ml;

aproximadamente 215 mg/ml;

aproximadamente 220 mg/ml;

aproximadamente 225 mg/ml; aproximadamente 230 mg/ml; aproximadamente 235 mg/ml; aproximadamente 240 mg/ml; aproximadamente 245 mg/ml o aproximadamente σι

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

250 mg/ml de un anticuerpo o de un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a la PCSK9 humana.

EXCIPIENTES y pH

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención comprenden uno o más excipientes. El término “excipiente”, tal y como se usa en la presente memoria, significa cualquier agente no terapéutico añadido a la formulación para proporcionar consistencia, viscosidad o efecto estabilizador deseado.

En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica de la invención comprende al menos un codisolvente orgánico de un tipo y en una cantidad que estabiliza el anticuerpo PCSK9 humano en condiciones de manipulación brusca o agitación, tal y como, p. ej. agitación vorticial. En algunas realizaciones, estabiliza” significa la prevención de la formación de más del 3% de anticuerpo agregado de la cantidad total del anticuerpo (desde el punto de vista de su molaridad) durante una manipulación brusca. En algunas realizaciones, una manipulación brusca es una agitación vorticial de una solución que contiene el anticuerpo y el codisolvente orgánico durante aproximadamente 60 minutos o aproximadamente 120 minutos.

En ciertas realizaciones, el codisolvente orgánico es un tensioactivo no iónico, tal y como un alquil poli(óxido de etileno). Algunos tensioactivos no iónicos específicos que pueden incluirse en las formulaciones de la presente invención incluyen, p. ej. polisorbatos tal como polisorbato 20, polisorbato 28, polisorbato 40, polisorbato 60 polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81 y polisorbato 85; poloxámeros como el poloxámero 181, poloxámero 188, poloxámero 407 o polietilenglicol (PEG). El polisorbato 20 también se conoce como TWEEN 20, monolaurato de sorbitán y monolaurato de polioxíetilensorbitán. El poloxámero 188 también se conoce como PLURONIC F68.

La cantidad de tensioactivo no iónico contenida dentro de las formulaciones farmacéuticas de la presente invención puede variar dependiendo de las propiedades específicas deseadas de las formulaciones, así como de las circunstancias y fines particulares para los que se pretende utilizar las formulaciones. En ciertas realizaciones, las formulaciones pueden contener 0,01% ± 0,0015% a 0,2% ± 0,03% de tensioactivo. Por ejemplo, las formulaciones de la presente invención pueden comprender κ>

aproximadamente 0,0085%;

aproximadamente 0,03%;

aproximadamente 0,01%;

aproximadamente 0,04%;

aproximadamente 0,02%;

aproximadamente 0,05%;

£

IMPI uí

Ío aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente

0,06%;

0,09%;

0,12%;

0,15%;

0,18%;

aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente

0,07%;

0,1%;

0,13%;

0,16%;

0,19%;

aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente

0,08%;

0,11%;

0,14%;

0,17%;

0,20%;

0,21%; aproximadamente 0,22% o aproximadamente 0,23% de polisorbato 20 o poloxámero 188.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender uno o más estabilizadores de un tipo y en una cantidad que estabilicen el anticuerpo PCSK9 humano en condiciones de estrés térmico. En algunas realizaciones, “estabiliza” significa que mantiene más de aproximadamente el 91% del anticuerpo en su P conformación nativa cuando la solución que contiene el anticuerpo y el estabilizador térmico se mantiene a aproximadamente 45 °C durante hasta aproximadamente 28 días. En algunas realizaciones, a lo que se refiere “estabiliza”, es en donde menos de aproximadamente el 6% del anticuerpo se agrega cuando la solución que contiene el anticuerpo y el estabilizador térmico se mantiene a aproximadamente 45 °C durante hasta aproximadamente 28 días. Tal y como se emplea en esta memoria, “nativo” significa la forma principal del anticuerpo por exclusión de tamaño, que generalmente es un monómero intacto del anticuerpo.

En ciertas realizaciones, el estabilizador térmico es un azúcar o alcohol de azúcar seleccionado de sacarosa, trehalosa y manitol, o cualquier combinación de los mismos, cuyas cantidades contenidas en la formulación pueden variar dependiendo de las circunstancias y fines específicos para los que se utilice la formulación. En ciertas realizaciones, las formulaciones pueden contener de aproximadamente el 3% a aproximadamente el 14% de azúcar o alcohol de azúcar; de aproximadamente el 4% a aproximadamente el 13% de azúcar o alcohol de azúcar; de aproximadamente el 5 %a aproximadamente el 12% de azúcar o alcohol de azúcar; de aproximadamente el 6%a aproximadamente el 11% de azúcar o alcohol de azúcar; de aproximadamente el 7%a aproximadamente el 10% de azúcar o alcohol de azúcar; de aproximadamente el 8%a aproximadamente el 9% de azúcar o alcohol de azúcar; de aproximadamente del 4% a aproximadamente el 6% de azúcar o alcohol de azúcar; de aproximadamente el 5%a aproximadamente el 7% de azúcar o alcohol de azúcar; de aproximadamente el 9%a aproximadamente el 11% de azúcar o alcohol de azúcar o de aproximadamente el 11% a £

IMPI σι aproximadamente el 13% de azúcar o alcohol de azúcar. Por ejemplo las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender 4% ± 0,6%; 5% ± 0,75%; 6% ± 0,9%; 7% ± 1,05%; 8% ± 1,2%; 9% ± 1,35%; 10% + 1,5%; 11% ± 1,65%; 12% ± 1,8%; 13% ± 1,95% o aproximadamente 14% ± 2,1% de azúcar o alcohol de azúcar (por ejemplo, sacarosa, trehalosa o manitol).

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender un tampón o sistema tampón, que sirve para mantener un pH estable y para ayudar a estabilizar el anticuerpo PCSK9 humano. En algunas realizaciones, a lo que se refiere “estabiliza” es donde menos del 4,5% ± 0,5% o menos del 6,0 ± 0,5% del anticuerpo se agrega cuando la solución que contiene el anticuerpo y el tampón se mantienen a aproximadamente 45 °C hasta aproximadamente 28 días. En algunas realizaciones, a lo que se refiere “estabiliza” es donde menos del 3% ± 0,5% o menos del 2,6% ± 0,5% del anticuerpo se agrega cuando la solución que contiene el anticuerpo del tampón se mantiene a aproximadamente 37 °C hasta aproximadamente 28 días. En algunas realizaciones, a lo que se refiere “estabiliza” es donde al menos el 91% ± 0,5% o al menos el 92% ± 0,5% del anticuerpo está en su conformación nativa tal y como determinó la cromatografía de exclusión por tamaño cuando la solución que contiene el anticuerpo y el tampón se mantienen a aproximadamente 45 °C durante hasta aproximadamente 28 días. En algunas realizaciones, a lo que se refiere “estabiliza” es donde al menos el 94% ± 0,5% o al menos el 95% ± 0,5% del anticuerpo está en su conformación nativa tal y como determinó la cromatografía de exclusión por tamaño cuando la solución que contiene el anticuerpo y el tampón se mantiene a aproximadamente 37 °C durante hasta aproximadamente 28 días.

Nativo “conformación nativa”, significa la fracción del anticuerpo que no está agregada o degradada. Esto viene generalmente determinado por un ensayo que mide el tamaño relativo de la entidad anticuerpo, tal y como realiza el ensayo de cromatografía de exclusión por tamaño. El anticuerpo no agregado y no degradado se eluye a una fracción que es igual al anticuerpo nativo y es generalmente la fracción de elución principal. El anticuerpo agregado se eluye a una fracción que indica un tamaño mayor que el anticuerpo nativo. El anticuerpo degradado se eluye a una fracción que indica un tamaño menor que el anticuerpo nativo.

En algunas realizaciones, a lo que se refiere “estabiliza” es donde al menos el 38% + £

IMPI uí

0,5% o al menos el 29% ± 0,5% del anticuerpo está en su forma de carga principal, tal y como determinó la cromatografía de intercambio catiónico, cuando la solución que contiene el anticuerpo-yel tampón se mantienen a aproximadamente 45 °C durante hasta aproximadamente 28 días. En algunas realizaciones, a lo que se refiere “estabiliza es donde al menos el 46% ± 0,5% o al menos el 39% ± 0,5% del anticuerpo está en su forma de carga principal, tal y como determinó la cromatografía de intercambio catiónico, cuando la solución que contiene el anticuerpo y el tampón se mantienen aproximadamente a 37 °C durante hasta aproximadamente 28 días. “Carga principal” o “forma de carga principal”, significa la fracción del anticuerpo que se eluye de una resina de intercambio iónico en el pico principal, que generalmente está flanqueado por picos más “básicos” a un lado y picos más “ácidos” al otro lado.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden tener un pH de aproximadamente 5,2 a aproximadamente 6,4. Por ejemplo, las formulaciones de la presente invención pueden tener un pH de aproximadamente 5,5; aproximadamente 5,6; aproximadamente 5,7; aproximadamente 5,8; aproximadamente 5,9; aproximadamente

6,0;

aproximadamente 6,1;

aproximadamente

6,2;

aproximadamente

6,3;

aproximadamente 6,4; o aproximadamente 6,5. En algunas realizaciones, el pH es 6,0 ± 0,4; 6,0 ± 0,3; 6,0 ±0,2; 6,0± 0,1; aproximadamente 6,0; o 6,0.

En algunas realizaciones, el tampón o sistema tampón comprende al menos un tampón que tiene un intervalo de tampón que se solapa completamente o en parte con el intervalo del pH 5,5 - 7,4. En una realización, el tampón tiene un pKa de aproximadamente 6,0 ± 0,5. En ciertas realizaciones, el tampón comprende un tampón de histidina. En ciertas realizaciones, la histidina está presente a una concentración de 5 mM ± 0,75 mM a 15 mM ± 2,25 mM; 6 mM ± 0,9 mM a 14 mM ± 2,1 mM; 7 mM ± 1,05 mM a 13 mM ± 1,95 mM; 8 mM ± 1,2 mM a 12 mM ± 1,8 mM; 9 mM ± 1,35 mM a 11 mM ± 1,65 mM; 10 mM ±1,5 mM; o aproximadamente 10 mM. En ciertas realizaciones, el sistema tampón comprende histidina a 10 mM ±1,5 mM, a un pH de 6,0 ± 0,3.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender uno o más excipientes que sirven para mantener una viscosidad reducida o para rebajar la viscosidad de las formulaciones que contienen una elevada concentración de la sustancia farmacológica con anticuerpo anti-PCSK9 (p. ej., en general >150 mg/ml del anticuerpo). En algunas realizaciones, la formulación comprende arginina en una £

IMPI uí cantidad suficiente para mantener la viscosidad de la formulación líquida a menos de 20 ± 3 cPoise, menos de 15 ± 2,25 cPoise, o menos de 11 ± 1,65 cPoise. En algunas realizaciones, la formulación comprende arginina en una cantidad suficiente para mantener la viscosidad a un nivel igual o inferior a 10,6 ± 1,59 cPoise. En ciertas realizaciones, la formulación farmacéutica de la presente invención contiene arginina preferiblemente como hidrocloruro de L-arginina, a una concentración de 10 mM ±1,5 mM a 90 mM ± 13,5 mM, 20 mM ± 3 mM a 80 mM ± 12 mM, 30 mM ± 4,5 mM a 70 mM ± 10,5, 40 mM ± 6 mM a 60 ± 9 mM o 50 mM ± 7,5 mM.

FORMULACIONES EJEMPLARES

Según un aspecto de la presente invención la formulación farmacéutica es una formulación líquida de baja viscosidad, generalmente fisiológicamente ¡sotónica, que comprende: (i) un anticuerpo humano que se une específicamente a la PCSK9 humana (p. ej., mAb~316P), a una concentración de 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml, 100 mg/ml ±15 mg/ml, 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml o 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml; (i¡) un sistema tampón que proporciona suficiente tampón a aproximadamente un pH 6,0 ± 0,3; (iü) un azúcar que sirve, entre otras cosas, como estabilizador térmico; (iv) un codisolvente orgánico, que protege la integridad estructural del anticuerpo; y (v) una sal de un aminoácido, que mantiene la viscosidad adecuada para ser inyectada en un volumen conveniente para su administración por vía subcutánea.

Según una realización, la formulación farmacéutica comprende: (i) un anticuerpo humano lgG1 que se une específicamente a la PCSK9 humana y que comprende una región variable de cadena pesada de tipo IGHV3-23 sustituida y una región variable de cadena ligera de tipo IGLV4-1 sustituida (p. ej., mAb-316P) a una concentración de 50 ± 7,5 mg/ml a aproximadamente 175 ± 26,25 mg/ml; (ii) un sistema tampón que comprende histidina que actúa como tampón de forma efectiva a aproximadamente un pH 6,0 ± 0,3; (¡ii) sacarosa; (iv) un detergente no iónico, tal y como un polisorbato; y opcionalmente (v) una sal de arginina.

Según una realización, la formulación farmacéutica comprende: (i) un anticuerpo lgG1 humano que se une específicamente a la PCSK9 humana y que comprende una HCDR1 de SEC ID N °: 2, una HCDR2 de SEC ID N °: 3, una HCDR3 de SEC ID N °: 4, una LCDR1 de SEC ID N °: 6, una LCDR2 de SEC ID N °: 7 y una LCDR3 de SEC ID N°: 8, a £

IMPI uí

Ío una concentración de 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml; (¡i) histidina al 10 mM ±1,5 mM, que actúa como tampón a un pH 6,0 ± 0,3; (iii) sacarosa al 5% p/v ± 0,75% p/v; (iv) polisorbato 20 a 0,01 % p/v ± 0,0015% p/v y (v) hidrocloruro de L-arginina a 50 mM ± 7,5 mM.

Según una realización, la formulación farmacéutica comprende: (i) un anticuerpo lgG1 humano que se une específicamente a la PCSK9 humana y que comprende una HCDR1 de SEC ID N °: 2, una HCDR2 de SEC ID N °: 3, una HCDR3 de SEC ID N °: 4, una LCDR1 de SEC ID N °: 6, una LCDR2 de SEC ID N °: 7 y una LCDR3 de SEC ID N °: 8, a una concentración de aproximadamente 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml; (ii) histidina a 10 mM ± 1,5 mM, que actúa como tampón a un pH 6,0 ± 0,3; (iii) sacarosa a 10% p/v ± 1,5% p/v y (iv) polisorbato 20 a 0,2% p/v ± 0,03% p/v o 0,01% p/v ± 0,0015% p/v.

Según una realización, la formulación farmacéutica comprende: (i) un anticuerpo lgG1 humano que se une específicamente a la PCSK9 humana y que comprende una HCDR1 de SEC ID N °: 2, una HCDR2 de SEC ID N °: 3, una HCDR3 de SEC ID N °: 4, una LCDR1 de SEC ID N °: 6, una LCDR2 de SEC ID N °: 7 y una LCDR3 de SEC ID N °: 8, a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml ± 15 mg/ml; (ii) histidina a aproximadamente 20 mM ± 3 mM, que actúa como tampón a un pH 6,0 ± 0,3; (iii) sacarosa a 12% p/v ± 1,8% p/v y (iv) polisorbato 20 a 0,2% p/v ± 0,03% p/v o 0,01% p/v ± 0,0015% p/v.

Según una realización, la formulación farmacéutica comprende: (i) un anticuerpo humano lgG1 que se une específicamente a la PCSK9 humana y que comprende una HCDR1 de SEC ID N °: 2, una HCDR2 de SEC ID N °: 3, una HCDR3 de SEC ID N °: 4, una LCDR1 de SEC ID N °: 6, una LCDR2 de SEC ID N °: 7 y una LCDR3 de SEC ID N °: 8, a una concentración de aproximadamente 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml; (ii) histidina a 10 mM ±1,5 mM, que actúa como tampón a un pH 6,0 ± 0,3; (iii) sacarosa al 6% p/v ± 0,9% p/v y (iv) polisorbato 20 a 0,1% p/v ± 0,015% p/v o 0,01% p/v ± 0,0015% p/v.

Según una realización, la formulación farmacéutica comprende: (i) un anticuerpo lgG1 humano que se une específicamente a la PCSK9 humana y que comprende un dominio variable de cadena pesada de SEC ID N °: 1 y un dominio variable de cadena ligera de SEC ID N °: 5, a una concentración de 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml; (ii) histidina a 10 mM ± 1,5 mM, que actúa como tampón a un pH 6,0 ± 0,3; (iii) sacarosa al 5% p/v ± 0,75% p/v; (iv) polisorbato 20 a 0,01% p/v ± 0,0015% p/v e (v) hidrocloruro de L-arginina a 50 mM ± 7,5 mM.

IMPI ui

Según una realización, la formulación farmacéutica comprende: (i) un anticuerpo lgG1 humano que se une específicamente a la PCSK9 humana y que comprende un domino variable de cadena pesada de SEC ID N °: 1 y un dominio variable de cadena ligera de SEC ID N°: 5, a una concentración de 150 mg/ml ± 22,5 mg/ml; (ii) histidina a 10 mM ± 1,5 mM, que actúa como tampón a un pH 6,0 ± 0,3; (iii) sacarosa al 10% p/v ± 1,5% p/v y (iv) polisorbato 20 a 0,2% p/v ± 0,03% p/v o 0,01% p/v ± 0,0015% p/v.

Según una realización, la formulación farmacéutica comprende: (i) un anticuerpo lgG1 humano que se une específicamente a la PCSK9 humana y que comprende un domino variable de cadena pesada de SEC ID N °: 1 y un dominio variable de cadena ligera de SEC ID N °: 5, a una concentración de aproximadamente 100 mg/ml ±15 mg/ml; (¡i) histidina a aproximadamente 20 mM ± 3 mM, que actúa como tampón a un pH 6,0 ± 0,3; (¡ii) sacarosa al 12% p/v ± 1,8% p/v; y (iv) polisorbato 20 a 0,2% p/v ± 0,03% p/v o 0,01% p/v ±0,0015% p/v.

Según una realización, la formulación farmacéutica comprende: (i) un anticuerpo lgG1 humano que se une específicamente a la PCSK9 humana y que comprende un domino variable de cadena pesada de SEC ID N °: 1 y un dominio variable de cadena ligera de k

SEC ID N °: 5, a una concentración de aproximadamente 50 mg/ml ± 7,5 mg/ml; (ii) histidina a 10 mM ±1,5 mM, que actúa como tampón a un pH 6,0 ± 0,3; (¡ii) sacarosa al 6% p/v ± 0,9% p/v y (iv) polisorbato 20 a 0,1% p/v ± 0,015% p/v o 0,01% p/v ± 0,0015% p/v.

Ejemplos adicionales no limitativos de formulaciones farmacéuticas incluidas en la presente invención se presentan en otra parte de la presente memoria, incluidos los Ejemplos de trabajo presentados a continuación.

ESTABILIDAD Y VISCOSIDAD DE LAS FORMULACIONES FARMACEUTICAS

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención normalmente muestran niveles de estabilidad elevados. El término “estable”, tal y como se emplea en esta memoria en referencia a las formulaciones farmacéuticas, significa que los anticuerpos dentro de las formulaciones farmacéuticas retienen un grado aceptable de estructura química o función biológica después de su almacenamiento en condiciones definidas. Una formulación puede permanecer estable incluso si el anticuerpo que contiene no mantiene el 100% de su estructura química o función biológica después del almacenamiento

IMPI £

durante un periodo de tiempo definido. En ciertas circunstancias, el mantenimiento de aproximadamente el

90%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% de la estructura o función de un anticuerpo después de su almacenamiento durante un periodo de tiempo definido puede considerarse como “estable”.

La estabilidad puede medirse, entre otros métodos, determinando el porcentaje de anticuerpo nativo que permanece en la formulación después de su almacenamiento durante un periodo de tiempo definido a una temperatura definida. El porcentaje de anticuerpo nativo puede determinarse, entre otros métodos, por cromatografía de exclusión por tamaño (p. ej., cromatografía líquida de alto rendimiento y exclusión por tamaño [SE-HPLC]), de forma que nativo significa no agregado y no degradado. Un “grado de estabilidad aceptable”, tal y como se emplea en esta memoria, significa que al menos el 90% de la forma nativa del anticuerpo puede detectarse en la formulación después de su almacenamiento durante un periodo de tiempo definido a una temperatura dada. En ciertas realizaciones, al menos aproximadamente el 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,

95%, 96%, 97%, 98%, el 99% o 100% de la forma nativa del anticuerpo puede detectarse en la formulación después de su almacenamiento durante un periodo de tiempo determinado a una temperatura definida. La cantidad de tiempo definida después de la cual se mide la estabilidad puede ser al menos 14 días, al menos 28 días, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses o más. La temperatura definida a la que la formulación farmacéutica puede almacenarse cuando se evalúa la estabilidad puede ser cualquier temperatura desde aproximadamente -80 °C a aproximadamente 45 °C, p. ej., almacenamiento a aproximadamente -80 °C, aproximadamente -30 °C, aproximadamente -20 aproximadamente 4 aproximadamente 0 °C, aproximadamente 5 °C, aproximadamente 25 aproximadamente 35 °C, aproximadamente 37 °C o aproximadamente 45 °C. Por ejemplo, una formulación farmacéutica puede considerarse estable si después de 6 meses de i almacenamiento a 5 °C, más de aproximadamente el 94%, 95%, 96%, 97% o 98% del anticuerpo nativo se detecta por SE-HPLC. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de 6 meses de almacenamiento a 25 °C, más de aproximadamente el 94%, 95%, 96%, 97% o 98% del anticuerpo nativo se detecta por κ

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IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL κ>

SE-HPLC. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de 28 días de almacenamiento a 45 °C más de aproximadamente el 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97% o 98% del anticuerpo nativo se detecta por SE-HPLC. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de tres meses de almacenamiento a -20 °C, más de aproximadamente el 96%, 97% o 98% del anticuerpo nativo se detecta por SE-HPLC. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de tres meses de almacenamiento a -30 °C, más de aproximadamente el 96%, 97% o 98% del anticuerpo nativo se detecta por SE-HPLC. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de tres meses de almacenamiento a -80 °C, más de aproximadamente el 96%, 97% o 98% del anticuerpo nativo se detecta por SE-HPLC.

La estabilidad puede medirse, entre otros métodos, determinando el porcentaje de anticuerpo que se forma en un agregado dentro de la formulación después de su almacenamiento durante un periodo de tiempo definido a una temperatura definida, donde la estabilidad es inversamente proporcional al porcentaje de agregado que se forma. El porcentaje de anticuerpo agregado se puede determinar, entre otros métodos, por cromatografía de exclusión por tamaño (p. ej., cromatografía líquida de alto rendimiento de exclusión por tamaño [SE-HPLC]). Un “grado de estabilidad aceptable”, tal y como se emplea en esta memoria, significa que como máximo el 6% del anticuerpo está en forma agregada detectado en la formulación después de su almacenamiento durante un periodo de tiempodefinido a una temperatura dada. En ciertas realizaciones un grado de estabilidad aceptable significa que puede detectarse un máximo de aproximadamente 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% de anticuerpo en un agregado en la formulación después de su almacenamiento durante un periodo de tiempo definido a una temperatura dada. La cantidad de tiempo definida después de la cual se mide la estabilidad puede ser de al menos 2 semanas, al menos 28 días, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses o más. La temperatura a la cual la formulación farmacéutica se puede almacenar al evaluar la estabilidad puede ser cualquier temperatura de aproximadamente -80 °C a aproximadamente 45 °C, p. ej., almacenamiento a aproximadamente -80 °C, aproximadamente -30 °C, aproximadamente

-20 °C, aproximadamente 0 °C, aproximadamente 4

8°C, aproximadamente 5 °C, σι aproximadamente 25 °C

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL aproximadamente 35 °C, aproximadamente 37 °C o aproximadamente 45 °C. Por ejemplo, una formulación farmacéutica puede considerarse estable si después de 6 meses de almacenamiento a 5 °C, menos de aproximadamente el 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% del anticuerpo se detecta en forma agregada. Una formación farmacéutica también puede considerarse estable si después de seis meses almacenamiento a 25 °C, menos de aproximadamente el 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% del anticuerpo se detecta en forma agregada. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de 28 días de almacenamiento a 45 °C, menos de aproximadamente el 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% del anticuerpo se detecta en forma agregada. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de tres meses de almacenamiento a -20 °C, -30 °C o -80 °C menos de aproximadamente el 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% del anticuerpo se detecta en forma agregada.

La estabilidad puede medirse, entre otros métodos, determinando el porcentaje de anticuerpo que migra en una fracción más ácida durante el intercambio iónico (“forma ácida”) que en la fracción principal del anticuerpo (“forma con carga principal”), en donde la estabilidad es inversamente proporcional a la fracción del anticuerpo en la forma ácida. Aunque sin desear ligarse a una teoría, la desamidación del anticuerpo puede provocar que el anticuerpo se cargue más negativamente y así se vuelva más ácido en relación al anticuerpo no desamidado (véase, p. ej. Robinson, N., Protein Deamidation, PNAS, April

2002, 99(8): 5283-5288). El porcentaje de anticuerpo “acidificado” puede

ΙΌ determinarse, entre otros métodos, por cromatografía de intercambio iónico (p. ej., cromatografía líquida de alto rendimiento e intercambio catíónico [CEX-HPLC]). Un “grado de estabilidad aceptable”, tal como se expresa en la presente memoria, significa que como máximo un 49% del anticuerpo que se detecta en la formulación está en una forma más ácida después de su almacenamiento durante un periodo de tiempo definido y a una temperatura definida. En ciertas realizaciones un grado de estabilidad aceptable significa que como máximo aproximadamente del 49%, 45%, 40%, 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% del anticuerpo puede detectarse en una forma ácida en la formulación después de su almacenamiento durante un periodo de tiempo definido a una temperatura dada. La cantidad de tiempo definida después de la cual se mide la estabilidad puede ser al menos de 2 semanas, al menos 28 días, al menos 1 mes, al menos 2 meses, al menos 3 meses, al menos 4 meses, al menos 5 meses, al menos 6 £

IMPI σι

ΙΌ meses, al menos 7 meses, al menos 8 meses, al menos 9 meses, al menos 10 meses, al menos 11 meses, al menos 12 meses, al menos 18 meses, al menos 24 meses o más. La temperatura a la que la formulación farmacéutica puede almacenarse al evaluar la estabilidad puede ser cualquier temperatura de aproximadamente -80 °C a aproximadamente aproximadamente aproximadamente

ρ. ej., almacenamiento a aproximadamente -80 °C, °C, aproximadamente -20 °-8°C, aproximadamente 5

C, aproximadamente 0 °C,

C, aproximadamente 25 °C o aproximadamente 45 °C. Por ejemplo, una formulación farmacéutica puede considerarse estable si después de tres meses de almacenamiento a -80 °C, -30 °C o -20 °C menos de aproximadamente el 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% del anticuerpo está en una forma más acida. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de seis meses de almacenamiento a 5 °C menos de aproximadamente el 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% del anticuerpo está en una forma más ácida. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de seis meses de almacenamiento a 25 °C, menos de aproximadamente el 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% del anticuerpo está en una forma más ácida. Una formulación farmacéutica también puede considerarse estable si después de 28 días de almacenamiento a 45 °C, menos de aproximadamente el 49%, 48%, 47%, 46%, 45%, 44%, 43%, 42%, 41%, 40%, 39%, 38%, 37%, 36%, 35%, 34%, 33%, 32%, 31%, 30%, 29%, 28%, 27%, 26%, 25%, 24%, 23%, 22%, 21%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 0,5% o 0,1% del anticuerpo puede detectarse en una forma más ácida.

Para evaluar la estabilidad de las formulaciones de la presente invención pueden utilizarse otros métodos, tales como p. ej., la calorimetría diferencial de barrido (DSC) para determinar la estabilidad térmica, la agitación controlada para determinar la estabilidad mecánica y la absorbancia a aproximadamente 350 nm o aproximadamente 405 nm para determinar la turbidez de la solución. Por ejemplo, una formulación de la presente invención puede considerarse estable si, después de 6 meses o más de

IMPI almacenamiento de aproximadamente 5 °C a aproximadamente 25 °C, el cambio de la DO405 de la formulación es menor de aproximadamente 0,05 (p. ej., 0,04, 0,03, 0,02, 0,01, o menos) de la DO405 de la formulación a tiempo cero.

La medición de la actividad biológica o afinidad de unión del anticuerpo a su diana también puede utilizarse para evaluar la estabilidad. Por ejemplo, una formulación de la presente invención puede considerarse estable si después de almacenamiento a, p. ej., 5 °C, 25 °C, 45 °C, etc. durante un periodo de tiempo definido (p. ej.1 a 12 meses), el anticuerpo anti-PCSK9 contenido dentro de la formulación se une a PCSK9 con una afinidad que es al menos el 90%, 95% o más de la afinidad de unión del anticuerpo antes de dicho almacenamiento. La afinidad de unión puede determinarse, p. ej., por ELISA o por resonancia de plasmón. La actividad biológica puede determinarse por un ensayo de actividad de PCSK9, tal como, p. ej., poner en contacto una célula que exprese PCSK9 con la formulación que comprende el anticuerpo anti PCSK9. La unión del anticuerpo con dicha célula puede medirse directamente, tal como, p. ej., mediante análisis FACS. Alternativamente, la actividad aguas abajo del sistema PCSK9 puede medirse en presencia del anticuerpo y compararse con la actividad del sistema PCSK9 en ausencia del anticuerpo. En algunas realizaciones, PCSK9 puede ser endógeno a la célula. En otras realizaciones, PCSK9 puede expresarse de forma ectópica en la célula.

Otros métodos para evaluar la estabilidad de un anticuerpo en formulación se demuestran en los ejemplos presentados a continuación.

Las formulaciones farmacéuticas líquidas de la presente invención pueden, en ciertas realizaciones, mostrar niveles de viscosidad bajos a moderados. La “viscosidad” tal y como se emplea en esta memoria puede ser “viscosidad cinemática” o viscosidad absoluta”. La “viscosidad cinemática” es una medida del flujo resistivo de un fluido bajo la influencia de la gravedad. Cuando dos fluidos del mismo volumen se colocan en viscosímetros de igual capilaridad y se permite que fluyan por gravedad, un fluido viscoso tarda más tiempo que un fluido menos viscoso en fluir a través de la capilaridad. Por ejemplo, sí un fluido tarda 200 segundos en completar su flujo y otro fluido tarda 400 segundos, el segundo fluido es dos veces más viscoso que el primero en una escala de viscosidad cinemática. La “viscosidad absoluta”, a veces denominada viscosidad dinámica o simple, es el producto de la viscosidad cinemática y la densidad del fluido (Viscosidad Absoluta = Viscosidad Cinemática x Densidad). La dimensión de la viscosidad cinemática es L²/T donde L es una longitud y T es un tiempo. Comúnmente, la viscosidad cinemática w

en o

ΙΌ

IMPI £

Λ se expresa en centistokes (cSt). La unidad del SI de la viscosidad cinemática es mm /s, que es un 1 cSt. La viscosidad absoluta se expresa en unidades de centipoise (cP). La unidad SI de viscosidad absoluta es el miliPascal-segundo (mPa-s), donde 1 cP = 1 mPa

s.

Tal y como se emplea en esta memoria, un nivel de viscosidad bajo, en referencia a una formulación fluida de la presente invención, mostrará una viscosidad absoluta de menos de aproximadamente 15 cPoise (cP). Por ejemplo, se estimará que una formulación fluida de la invención tiene “baja viscosidad”, si, cuando se mide utilizando b técnicas estándar de medición de la viscosidad, la formulación muestra una viscosidad absoluta de aproximadamente 15 cP, aproximadamente 14 cP, aproximadamente 13 cP, aproximadamente 12 cP, aproximadamente 11 cP, aproximadamente 10 cP, aproximadamente 9 cP, aproximadamente 8 cP o menos. Tal y como se usa en la presente memoria, un nivel de viscosidad moderado, en referencia a una formulación fluida de la presente invención, mostrará una viscosidad absoluta de entre aproximadamente 35 cP y aproximadamente 15 cP. Por ejemplo, estimará que una formulación fluida de la invención tiene una “viscosidad moderada, si al medirla utilizando técnicas estándar de medición de la viscosidad, la formulación muestra una viscosidad absoluta de aproximadamente 34 cP, aproximadamente 33 cP, aproximadamente 32 cP, aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente cP, cP, cP, cP.

aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente cP, cP, cP, cP aproximadamente aproximadamente aproximadamente aproximadamente cP, cP, cP, cP, aproximadamente 19 cP, 18 cP, aproximadamente 17 cP, aproximadamente 16 cP, o aproximadamente 15.1 cP.

Tal y como se ilustra en los ejemplos a continuación, los presentes inventores han realizado el sorprendente descubrimiento de que pueden obtenerse formulaciones líquidas con una viscosidad de baja a moderada que comprenden concentraciones elevadas de un anticuerpo anti-PCSK9 humana (p. ej., de aproximadamente 100 mg/ml hasta al menos 200 mg/ml) formulando el anticuerpo con arginina de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 100 mM. Además, también se descubrió que incluso podía disminuirse aún más la viscosidad de la formulación ajustando el contenido de sacarosa a menos de aproximadamente el 10%.

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ENVASES Y MÉTODOS DE ADMINISTRACIÓN

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL κ>

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluirse dentro de cualquier envase adecuado para el almacenamiento de medicinas y otras composiciones terapéuticas. Por ejemplo, las formulaciones farmacéuticas pueden incluirse en un envase de plástico o de cristal esterilizado y sellado que tenga un volumen definido tal y como un vial, ampolla, jeringa, cartucho o botella. Pueden utilizarse diferentes tipos de viales para contener las formulaciones de la presente invención incluyendo p. ej., viales de cristal o de plástico transparentes y opacos (p. ej., color ámbar). De igual forma, puede utilizarse cualquier tipo de jeringa para contener o administrar las formulaciones farmacéuticas de la presente invención.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden incluirse en jeringas de “contenido normal de tungsteno” o en jeringas de “bajo contenido de tungsteno”. Tal y como apreciarán los expertos habituales en la técnica, el proceso para elaborar jeringas de cristal generalmente implica la utilización de una varilla de tungsteno caliente con el objetivo de perforar el cristal y crear así un orificio por el que pueden introducirse y extraerse los líquidos de la jeringa. Este proceso resulta en la deposición de cantidades traza de tungsteno en la superficie interior de la jeringa. Pueden realizarse etapas posteriores dé lavado y otras etapas de procesado para reducir la cantidad de tungsteno en la jeringa. Tal y como se emplea en esta memoria, la expresión “contenido normal de tungsteno” significa que la jeringa contiene una cantidad mayor o igual a 500 partes por billón (ppb) de tungsteno. La expresión “bajo contenido de tungsteno” significa que la jeringa contiene menos de 500 ppb de tungsteno. Por ejemplo, una jeringa de bajo contenido de tungsteno, según la presente invención, puede contener menos de aproximadamente 490, 480, 470, 460, 450, 440, 430, 420, 410, 390, 350, 300, 250, 200, 150, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10 o menos ppb de tungsteno.

Los émbolos de goma utilizados en las jeringas y los tapones de goma utilizados para cerrar la entrada de los viales, pueden cubrirse para impedir la contaminación del contenido medicinal de la jeringa o vial, o para conservar su estabilidad. Así, las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, según ciertas realizaciones, pueden incluirse en una jeringa que comprenda un émbolo cubierto o en un vial que esté sellado con un tapón de goma cubierto. Por ejemplo, el émbolo o tapón puede estar cubierto de una película de fluorocarbono. Algunos ejemplos de tapones o émbolos £

IMPI

U1

NJ cubiertos adecuados para utilizar con viales y jeringas que contienen formaciones farmacéuticas de la presente invención se mencionan, p. ej., en las Patentes de Estados Unidos Nos 4.997.423; 5.908.686; 6.286.699; 6.645.635; y 7.226.554, cuyos contenidos se incorporan en su totalidad por referencia en la presente memoria. Algunos ejemplos en particular de tapones y émbolos de goma cubiertos que pueden utilizarse en el contexto de la presente invención están disponibles comercialmente con el nombre comercial FluroTec®”, disponible en West Pharmaceutical Services, Inc. (Lionville, PA). FluroTec® es un ejemplo de cobertura de fluorocarbono utilizada para minimizar o impedir que el producto farmacológico se adhiera a las superficies de goma.

Según ciertas realizaciones de la presente invención, las formulaciones farmacéuticas pueden incluirse en una jeringa de bajo contenido de tungsteno que comprenda un émbolo cubierto de fluorocarbono.

Las formulaciones farmacéuticas pueden administrarse a un paciente por vía parenteral, tal y como por inyección (p. ej., subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, etc.) o por administración percutánea, mucosa, nasal, pulmonar u oral.

Pueden utilizarse numerosos dispositivos de administración como plumas o autoinyectores reutilizables para administrar por vía subcutánea las formulaciones farmacéuticas de la presente invención. Algunos ejemplos incluyen, pero sin limitación, AUTOPEN™ (Owen Mumford, Inc., Woodstock, Reino Unido), pluma DISETRONIC™ (Disetronic Medical Systems, Bergdorf, Suiza), pluma HUMALOG MIX 75/25™, pluma HUMALOG™, pluma HUMALIN 70/30™ (Eli Lilly and Co., Indianápolis, IN), NOVOPEN™ I, II y III (Novo Nordisk, Copenague, Dinamarca), NOVOPEN JUNIOR™ (Novo Nordisk, Copenague, Dinamarca), pluma BD™ (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), OPTIPEN™, OPTIPEN PRO™, OPTIPEN STARLET™ y OPTICLIK™ (sanofi-aventis, Frankfurt, Alemania). Algunos ejemplos de dispositivos de administración tales como plumas o autoinyectores desechadles con aplicación en la administración subcutánea de una composición farmacéutica de la presente invención incluyen, pero sin limitación, la pluma SOLOSTAR™ (sanofi-aventis), el FLEXPEN

TM (Novo Nordisk) y el KWIKPEN™ (Eli

Lilly), el Autoinyector SURECLICK™ (Amgen, Thousand Oaks, CA), el PENLET™ (Haselmeier, Stuttgart, Alemania), el EPIPEN (Dey, L. P.) y la Pluma HUMIRA™ (Abbott Labs, Abbott Park, IL).

El uso de un microinfusor para administrar las formulaciones farmacéuticas de la presente invención también se contempla en la presente memoria. Tal y como se emplea £

IMPI uí en esta memoria, el término “microinfusor” significa un dispositivo de administración subcutánea diseñado para administrar lentamente grandes volúmenes (p. ej., hasta aproximadamente 2,5 mi o más) de una formulación terapéutica durante un periodo de tiempo prolongado (p. ej., aproximadamente 10, 15, 20, 25, 30 o más minutos). Véase p. ej., el documento U.S. 6.629.949; US 6.659.982 y Meehan et al., J. Controlled Release 46: 107-116 (1996). Los microinfusores son especialmente útiles para administrar grandes dosis de proteínas terapéuticas incluidas en soluciones de alta concentración (p. ej., aproximadamente 100, 125, 150, 175, 200 o más mg/ml) o viscosas.

En una realización, la formulación líquida farmacéutica que contiene aproximadamente 175 mg/ml ± 26,25 mg/ml del anticuerpo anti-PCSK9 se administra por vía subcutánea en un volumen de aproximadamente 1,14 mi ± 0,17 mi en una jeringa precargada. En una i realización, la jeringa es una jeringa de cristal de 1 mi de longitud cargada con una aguja de pared fina de calibre 27, un émbolo de goma cubierto de fluorocarbono y una tapa de aguja de goma. En una realización, la jeringa es una jeringa de cristal OMPI de 1 mi de longitud provista de una aguja de calibre 27, un capuchón de goma FM27 para la aguja y un émbolo de goma 4023/50 cubierto de FLUROTEC®.

En una realización, la formulación farmacéutica líquida que contiene aproximadamente

150 mg/ml ± 22,5 mg/ml del anticuerpo anti-PCSK9 se administra por vía subcutánea en un volumen de aproximadamente 1 mi ± 0,15 mi en un jeringa precargada. En una realización, la jeringa es una jeringa de cristal de 1 mi de longitud cargada con una aguja de pared fina de calibre 27, un tapón de goma cubierto de fluorocarbono y un capuchón de goma para la aguja. En una realización, la jeringa es una jeringa de cristal OMPI de 1 mi de longitud provista de una aguja de calibre 27, un capuchón de goma FM27 para la aguja y un émbolo de goma 4023/50 cubierto de FLUROTEC®.

USOS TERAPÉUTICOS DE LAS FORMULACIONES FARMACÉUTICAS

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención son útiles, entre otros usos, para el tratamiento, la prevención o mejora de cualquier enfermedad o trastorno asociado con la actividad de PCSK9, incluyendo las enfermedades y los trastornos mediados por

PCSK9. Algunas enfermedades y trastornos ejemplares, no limitativos, que pueden tratarse o evitarse por medio de la administración de las formulaciones farmacéuticas de la presente invención incluyen diversas dislipidemias tales como,

P· ej., £

IMPI uí hipercolesterolemia, hipercolesterolemia familiar, hiperlipidemia, hiperlipidemia familiar disbetalipoproteinemia, hipertrigliceridemia familiar.

EJEMPLOS disbetalipoproteinemia familiar, hipertrigliceridemia

Para proporcionar a los expertos en la técnica una descripción completa de cómo elaborar y utilizar los métodos y composiciones de la invención Se presentan los siguientes ejemplos y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran su invención. Se han realizado esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los números utilizados (p. ej, cantidades, temperatura, etc.) pero deberían explicarse algunos errores experimentales y desviaciones. A menos que se indique lo contrario, las partes son partes por mol, el peso molecular es peso molecular medio, la temperatura de da en grados Centígrados y la presión es igual o cercana a la presión atmosférica.

Las actividades iniciales del desarrollo de la formulación incluyeron el examen de codisolventes orgánicos, estabilizadores térmicos y tampones en formulaciones líquidas y liofilizadas de mAb-316P (anticuerpos anti-PCSK9 de la invención) para identificar los excipientes que son compatibles con la proteína y aumentar su estabilidad, a la vez que se mantiene una osmolalidad casi fisiológica y una baja viscosidad para su inyección intravenosa y subcutánea. Las condiciones del tampón se examinaron igualmente para determinar el pH óptimo para una máxima estabilidad de la proteína.

EJEMPLO 1: Desarrollo de la FORMULACIÓN ANTI-PCSK1 MAB-316P

Se examinaron varios tampones, codisolventes orgánicos y estabilizadores térmicos para identificar los excipientes que aumentan la estabilidad del anticuerpo PCSK9. Las condiciones de tampón se examinaron igualmente para determinar el pH óptimo para una máxima estabilidad del anticuerpo. Los resultados generados de estos estudios se utilizaron para desarrollar una formulación líquida estable, así como una formulación liofilizada estable adecuada para uso clínico, tanto para su administración intravenosa (IV) como subcutánea (SC). Para el producto farmacológico liofilizado, se desarrolló una única formulación de doble uso que podía reconstituirse con agua estéril para inyección (WFI

Water For Injection) a una concentración de 50 mg/ml para administración IV o 100 mg/ml para administración SC. Una vez reconstituida a 50 mg/ml, el producto farmacológico

IMPI puede diluirse además en una bolsa IV que contiene 0,9% de cloruro de sodio para su administración IV. Para la formulación líquida, el mAb-316P se formuló a 175 ± 27 mg/ml y 150 ± 23 mg/ml. En una realización, el mAb-316P 175 ± 27 mg/ml se formuló en 10 ± 1,5 mM de histidina (pH 6,0 ± 0,3), 0,01% ± 0,0015% de polisorbato 20, 5% ± 0,75% de sacarosa. En una realización, se formuló 150 ±23 mg/ml de mAb-316P en 10 ± 1,5 mM de histidina (pH 6,0 ± 0,3), 0,2% ± 0,03% o 0,01% ± 0,0015% de polisorbato 20, 10% ± 1,5% de sacarosa.

EJEMPLO 2: TAMPÓN y pH para MAB-316P ANTI-PCSK1

El efecto del pH y del tipo de tampón sobre la estabilidad de los anticuerpos PCSK9 se examinó en formulaciones líquidas. Se incubaron 2 mg/ml de mAb-316P anti-PCSK9 a 45 °C en 10 mM cada uno de los lampones de acetato (pH 5,0-5,5), citrato (pH 5,5-6,0) succinato (pH 6,0), histidina (pH 6,0), fosfato (pH 6,0-7,5) o Tris (pH 8,0) para evaluar el efecto del tampón y del pH sobre la estabilidad térmica de la proteína (Tabla 1). Para este experimento, se mantuvieron todas las formulaciones líquidas como 0,35 mi en un vial de cristal de borosilicato Tipo 1 de 2 mi de capacidad con un tapón de goma de butilo 4432/50 cubierto de FLUROTEC®. La cantidad total de mAb-316P recuperada se determinó utilizando cromatografía de fase inversa. El porcentaje de la forma nativa en relación a la forma agregada de mAb-316P se determinó utilizando cromatografía de exclusión por tamaño. El porcentaje de especies acidas y básicas de mAb-316P se determinó utilizando cromatografía de intercambio catiónico. Se observó la máxima estabilidad de la proteína, tal y como determinó tanto la cromatografía de exclusión por tamaño (SE) y la cromatografía de intercambio catiónico (CEX), cuando se formuló el mAb-316P anti-PCSK9 en 10 mM de tampón de histidina a un pH 6,0.

El pH óptimo para el mAb-316P se determinó entonces incubando.10 mg/ml del mAb316P a 45 °C en tampón de histidina entre un pH 5,5 y un pH 6,5. Se observó la mayor estabilidad de la proteína, tal y como determinó el SE y el CEX, cuando se formuló el mAb-316P en histidina tamponada a un pH 6,0 (Tabla 2). Estos análisis también revelaron que las rutas principales de degradación de la proteína eran la formación de agregados, productos de escisión y variantes de carga. En base a estos resultados, se eligió tampón de histidina 10 mM a pH 6,0 para desarrollar una formulación líquida y liofilizada de mAb316P.

£

IMPI uí

Los resultados de los estudios del desarrollo de la formulación indicaron que en condiciones básicas (pH > 6,5), el mAb-316P anti-PCSK9 en solución puede experimentar reacciones de desaminación. En cambio, a un pH < 5,5, se observó una mayor tasa de formación de variantes de peso molecular del mAb-316P. En base a estos datos, el pH del tampón utilizado para la formulación del mAb-316P se mantuvo entre pH 5,7 y pH 6,3. La estabilidad acelerada del mAb-316P es similar a lo largo de este intervalo de pH.

EJEMPLO 3: SELECCIÓN DE PROTECTORES CONTRA EL ESTRÉS POR AGITACIÓN

Se analizaron diversos codisolventes individualmente para evaluar su habilidad para minimizar la formación de partículas en mezclas que contenían mAb-316P debido al estrés por agitación. Los análisis de turbidez de la sustancia farmacológica agitada demostraron un aumento de la densidad óptica (DO) a 405 nm cuando una solución que contenía mAb-316P (0,35 mi de 25 mg/ml de mAb-316P, 10 mM de histidina, pH 6,0 ± 0,2 en un vial de cristal de borosilicato Tipo 1 de 2 mi de capacidad con un tapón de goma de butilo 4432/50 cubierto de FLUROTEC®) se sometió a agitación vorticial durante 120 minutos (Tabla 3). La formulación con cualquiera de los codisolventes evaluados parece haber impedido el aumento de turbidez inducido por agitación. Sin embargo, el PEG 300 al 20%, el PEG 300 al 10% y el propilenglicol al 20% disminuyeron significativamente la estabilidad térmica del mAb-316P tal y como determinó la SE (Tabla 4; mismas condiciones de concentración, tampón y envase del mAb-316P que en el estudio anterior con agitación vorticial). Las formulaciones con polisorbato 20, polisorbato 80, Pluronic F68 y PEG 3350 no tuvieron efectos significativos sobre la estabilidad térmica del mAb-316P tal y como determinó por SE y CEX, haciendo que estos codisolventes resulten adecuados para formular el mAb-316P anti-PCSK9. El polisorbato 20 se eligió como codisolvente orgánico para el desarrollo tanto de la formulación líquida como la liofilizada del mAb-316P ya que demostró tener buenas características de estabilidad en el estudio tanto de agitación como térmico del mAb-316P.

EJEMPLO 4: SELECCIÓN DE PROTECTORES CONTRA EL ESTRÉS TÉRMICO

De manera individual, se analizaron diversos excipientes, seleccionados de una lista variada que contenía azúcares, aminoácidos y sales inorgánicas, para aumentar de una forma óptima la estabilidad térmica del mAb-316P. En la Tabla 5 se presenta un resumen £

IMPI uí de algunos de los estabilizadores térmicos examinados. Para estos experimentos, los excipientes “estabilizadores térmicos” se incluyeron en una solución de 20 mg/ml de mAb316P en 10 mM de histidina (0,35 mi en un vial de cristal de borosilicato Tipo 1 de 2 mi de capacidad con un tapón de goma de butilo 4432/50 cubierto de FLUROTEC®). Las formulaciones que contenían sacarosa, sorbitol, manitol y trehalosa tuvieron la menor cantidad de degradación de mAb-316P tal y como determinó el análisis por SE. Sin embargo, las formulaciones que contenían sorbitol mostraron un sorprendente aumento en la turbidez en comparación con las formulaciones que contenían sacarosa, trehalosa y manitol (Tabla 5). Aunque se observó que la sacarosa, la trehalosa y el manitol no tuvieron ningún efecto en la formación de variantes de carga del mAb-316P anti-PCSK9 se observó que el manitol desestabilizaba la proteína durante ciclos múltiples de congelación-descongelación. Por tanto, el mAb-316P tiene una estabilidad similar cuando se formula con sacarosa o trehalosa.

EJEMPLO 5: FORMULACION LIOFILIZADA

Se desarrolló una formulación liofilizada para aumentar la estabilidad del mAb-316P anti-PCSK9, en concreto con respecto a las variantes de carga y para aumentar la concentración máxima administrable de mAb-316P.

Se combinaron diversos lioprotectores con 0,7 mi de 50 mg/ml de mAb-316P, histidina 10 mM en un vial de cristal de borosilicato Tipo 1 de 2 mi de capacidad con un tapón de goma de butilo 4432/50 cubierto de FLUROTEC®, liofilizado y examinado para determinar su habilidad para estabilizar un mAb-316P liofilizado al ser incubado a 50 °C. Antes del análisis, la torta liofilizada se reconstituyó a 100 mg/ml de mAb-316P. Las dos formulaciones liofilizadas con mayor estabilidad tal y como determinó la SE y CEX contenían: 1) 6% de sacarosa o 2) 2% de sacarosa más 2% de arginina. Se eligió 6% de sacarosa para la formulación del producto farmacológico mAb-316P. Por tanto, el producto farmacológico liofilizado mAb316P anti-PCSK9 se produjo por liofilización en una formulación tampón optimizada y acuosa que contenía 10 mM de histidina, pH 6,0 ± 0,1, 0,1% (p/v) de polisorbato 20, 6% (p/v) de sacarosa y 50 mg/ml de mAb-316P anti-PCSK9. El almacenamiento y la estabilidad frente al estrés de esta formulación liofilizada se presentan en la Tabla 7.

El ciclo de liofilización del mAb-316P anti-pPCSK9 se desarrolló en base a la medición 4 de Tg’ (temperatura de transición vitrea por congelación) de la formulación, que se midió £

IMPI uí

Ío utilizando calorimetría diferencial de barrido modulada subambiente (mDSC). La temperatura del producto no deberá sobrepasar la Tg’ durante el primer secado, cuya temperatura se determinó que sería -27,9 °C.

El mAb-316P liofilizado se produjo cargando 5,3 mi de la formulación 50 mg/ml de mAb-316P, histidina 10 mM (pH 6,0), polisorbato 20 al 0,1%, sacarosa al 6% en viales de cristal Tipo 1 de 20 mi y liofilizando según las etapas siguientes:

1. Temperatura de almacenamiento necesaria durante la carga:

2. Mantenimiento inicial a:

3. Pendiente (tiempo) para congelación

4. Mantenimiento a:

5-25 °C °C durante 60 minutos

0,5 °C/min (100 minutos)

-45 °C durante 120 minutos

5. Punto de vacío fijado

6. Pendiente (tiempo) de calentamiento hasta primer secado:

7. Temperatura de almacenamiento del primer secado:

100 mTorr

0.5 °C/min (40 minutos)

-25 °C

8. Duración del primer secado:

horas

9. Intervalo de rampa (tiempo) para el calentado hasta 0,2 °C/min. (300 minutos) el segundo secado:

10. Temperatura del estante del segundo

11. Duración del segundo secado:

12. Pendiente (tiempo) para enfriamiento:

13. Mantenido a:

secado:

°C horas

0,5 °C/min (20 minutos) °C durante 60 minutos

14. Rellenado con gas nitrógeno:

15. Cierre el vacío:

80% de presión (608.000 mTorr) atmosférica

Cuando sea necesario un almacenamiento prolongado después del segundo secado y antes de la etapa de cierre, la temperatura de almacenamiento del liofilizador se llevará a 2-8 °C. El producto farmacológico liofilizado que se produjo utilizando los ciclos finales descritos anteriormente tuvo buen aspecto de torta, a bajo contenido en humedad (0,3%), tiempo de reconstitución menor de 4 minutos y ninguna turbidez de la solución reconstituida.

IMPI w

en o

En aspecto de la torta liofilizada no se vio afectado cuando el producto farmacológico mAb-316P (mAb-316P PF) se incubó durante 2 meses a 50 °C o se almacenó durante 3 meses a 5 °C. No se vio afectado ni el pH, ni el aspecto, ni la turbidez del producto farmacológico reconstituido mAb-316P, y no se observó ninguna diferencia significativa en la cantidad del mAb-316P recuperado. Tras 2 meses de incubación a 50 °C, el producto farmacológico mAb-316P liofilizado estaba un 1,1% más degradado tal y como determinó la SE-HPLC y un 8,3% más degradado tal y como determinó la CEXHPLC. No se observó ninguna degradación significativa cuando el producto farmacológico mAb-316P liofilizado se almacenó durante 3 meses a 5 °C. No se observó ninguna pérdida de potencia significativa, en ninguna de las muestras sometidas a estrés, tal y como determinó un bioensayo anti-PCSK9.

EJEMPLO 6: MAB-316P LÍQUIDO Y RECONSTITUIDO

Hay dos métodos para reconstituir el producto farmacológico mAb-316P liofilizado dependiendo de la vía de administración. Para la administración IV, el producto farmacológico mAb-316P se reconstituyó con 5,0 mi de WFI estéril que resultó en 5,3 mi de solución que contenía 50 mg/ml de mAb-316P, histidina 10 mM, pH 6,0, polisorbato 20 al 0,1% (p/v) y sacarosa al 6% (p/v). Para la administración SC, el producto farmacológico mAb-316P se reconstituyó con 2,3 mi de WFI estéril que resultó en una solución de 2,7 mi que contenía 100 mg/ml de REGN727, histidina 20 mM, pH 6,0, polisorbato 20 al 0,2% (p/v) y sacarosa al 12% (p/v). El volumen de extracción disponible es 4,8 mi para la inyección IV y de 2,0 mi para la inyección SC; el vial SC contenía una solución reconstituida mayor de 0,7 mi.

En la alternativa, se formula mAb-316P líquido como una formulación líquida, sin la intervención de la etapa de liofilización. Las formulaciones de mAb-316P líquido están bien a 150 mg/ml (± 15%) o 175 mg/ml (± 15%) de mAb-316P anti-PCSK9, en 10 ± 1,5 mM de histidina (pH 6,0 ± 0,3), polisorbato 20 a 0,01% ± 0,0015% o 0,2% ± 0,03%, sacarosa al 5% ± 0,75% o 10% + 1,5% y en el caso de la formulación de 175 mg/ml, arginina a 50 ± 7,5 mM.

El mAb-316P anti-PCSK9 resultó ser estable al filtrarse estéril. Se utilizó una unidad r de filtración Millipore MILLIPAK en la fabricación de los suministros clínicos, mientras que se utilizó un filtro de idéntica composición en los estudios de investigación (Millipore κ

m

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

MILLEX DURAPORE). Comparado con el almacenamiento en viales de cristal, la estabilidad de la sustancia farmacológica mAb-316P formulada (mAb-316P FDS) no se vio significativamente afectada al almacenarla bien en un tubo de polipropileno, en un tubo de poliestireno, en un tubo de policarbonato o bien en un vial de cristal que contenía una bolita de acero inoxidable (Tabla 8).

EJEMPLO 7: FORMULACIÓN LÍQUIDA EN JERINGAS PRECARGADAS

Se realizaron estudios de desarrollo de formulación con objeto de desarrollar una formulación líquida de alta concentración del mAb-316P que pudiera utilizarse en jeringas precargadas (PFS) para su administración SC. Los resultados de la etapa de desarrollo de la formulación REGN727 liofilizada demostraron que el tampón, pH, codisolvente orgánico y estabilizador térmico óptimos eran histidina, pH 6.0, polisorbato 20 y sacarosa, respectivamente (mencionados anteriormente). Estos mismos excipientes se utilizaron para desarrollar las formulaciones del producto farmacológico mAb-316P tanto de 150 mg/ml como de 175 mg/ml. La arginina se añadió a la versión del producto farmacológico mAb-316P de 175 mg/ml para reducir la viscosidad de la formulación. Se examinó la estabilidad frente al estrés del producto farmacológico mAb-316P de 150 y 175 mg/ml en jeringas precargadas (PFS) de cristal Nuova OMPI de 1 mi de longitud y se compararon con la estabilidad del producto farmacológico de 150 y 175 mg/ml en viales de cristal de control. No se observó ninguna diferencia significativa en la cantidad de degradación física o química tras la incubación del producto farmacológico mAb-316P de 150 o 175 mg/ml a 45 °C entre la OMPI PFS y el vial de cristal de control. Estos datos indican que las formulaciones del producto farmacológico mAb-316P anti-PCSK9 de 150 y 175 mg/ml son suficientemente estables para su uso en PFS.

EJEMPLO 8: ESTABILIDAD DE LA SUSTANCIA FARMACOLÓGICA MAB-316P FORMULADA

Se realizaron estudios de estabilidad para determinar la estabilidad tanto al almacenamiento como al estrés de las formulaciones mAb-316P de 150 y 175 mg/ml. Los ensayos de turbidez y de RP-HPLC se utilizaron para evaluar la estabilidad física del mAb-316P. La estabilidad física se define como la recuperación de las formas solubles del mAb-316P anti-PCSK9 en solución. La pérdida de proteínas podría deberse bien a la κ>

£

IMPI σι precipitación de las proteínas o a la adsorción a la superficie. La presencia de partículas en solución puede detectarse mediante la medición por inspección visual o por densidad óptica (DO) a 405 nm (mediciones de turbidez). En este último ensayo, un aumento en la DO indica un aumento de la turbidez debido a la formación de partículas. La presencia de partículas, tal y como determinan las mediciones de DO, indica que la muestra no ha mantenido su estabilidad. La recuperación del mAb-316P se mide por RP-HPLC. En el ensayo RP-HPLC, el anticuerpo mAb-316P anti-PCSK9 se eluye de la columna de fase inversa como un solo pico. La concentración de cada una de las muestras de análisis viene determinada por el área del pico del anticuerpo mAb-316P eluído comparado con la curva de calibrado generada utilizando estándares mAb-316P de cargas de proteína definidas.

La estabilidad química se refiere a la integridad de la estructura química del anticuerpo anti-PCSK9 (mAb-316P) en una muestra. La mayoría de la inestabilidad química puede atribuirse a la formación de formas de la proteína modificadas de manera covalente (p. ej., agregados covalentes, productos de escisión o variantes de carga) y formas dé la proteína modificadas de manera no covalente (p. ej. agregados no covalentes). En este punto los únicos productos de degradación del mAb-316P que se han detectado son especies que difieren bien en el peso molecular o en la carga. Los productos de degradación de mayor y menor peso molecular pueden separarse del mAb-316P nativo por SE-HPLC. El porcentaje de mAb-316P nativo en el método de cromatografía de exclusión por tamaño viene determinado por la proporción de área de pico nativo con respecto al área total de todos los picos del anticuerpo mAb-316P.

Las formas de variante de carga del mAb-316P se resuelven a partir del mAb-316P nativo utilizando cromatografía de intercambio catiónico. Los picos que se eluyen de la columna CEX-HPLC con tiempos de retención anteriores al del pico principal se denominan “Picos ácidos”, mientras que los que se eluyen de la columna CEX-HPLC con tiempos de retención posteriores a los del pico principal se denominan “Picos básicos”. El porcentaje de mAb-316P degradado en el método de cromatografía por intercambio catiónico viene determinado por el cambio en el porcentaje relativo de las áreas del pico principal, ácido y básico comparado con el área total de todos los picos del mAb-316P.

La evaluación del mAb-316P en condiciones aceleradas se llevó a cabo sometiendo al R ¹ anticuerpo a diversos análisis de estrés. Estos análisis representan las condiciones de manipulación extremas a las que puede someterse la sustancia farmacológica formulada £

IMPI σι durante la fabricación del producto farmacológico. La sustancia farmacológica mAb-316P formulada se cargó en viales de policarbonato de 5 mi para su agitación, ciclos de congelación/descongelación y condiciones de almacenamiento en estado de congelación. La sustancia farmacológica mAb-316P formulada se cargó en viales de cristal para examinar su estabilidad frente al estrés a altas temperaturas.

EJEMPLO 9: ESTUDIOS DE ESTABILIDAD EN ALMACENAMIENTO DE LA SUSTANCIA FARMACOLÓGICA FORMULADA (FDS)

Se encontró que la sustancia farmacológica formulada mAb-316P de 150 mg/ml (FDS; 0,5 mi en vial de policarbonato de 5 mi; anticuerpo mAb-316P 150 mg/ml, histidina 10 mM (pH 6,0), polisorbato 20 al 0,2% y sacarosa al 10%) era física y químicamente estable cuando se almacenaba a &lt; - 20 °C durante 12 meses. No se observó ninguna pérdida significativa de mAb-316P ni se detectó ninguna degradación química significativa por cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico. Una cantidad mayor al 97% del mAb-316P recuperado era de estructura “nativa” tal y como determinó la exclusión por tamaño y una cantidad mayor al 56% del mAb-316P recuperado era de la variante con carga principal” tal y como determinó el intercambio catiónico. Los resultados se resumen en la Tabla 9.

Se encontró que la sustancia farmacológica formulada mAb-316P de 175 mg/ml (FDS; 0,75 mi en vial de policarbonato de 5 mi; anticuerpo mAb-316P 175 mg/ml, histidina 10 mM (pH 6,0), polisorbato 20 al 0,01%, sacarosa al 5% y arginina 50 mM) era física y químicamente estable cuando se almacenaba a &lt;-20 °C durante 3 meses. No se observó ninguna pérdida significativa de mAb-316P ni se detectó ninguna degradación química significativa por cromatografía de exclusión por tamaño o de intercambio iónico. Una cantidad mayor al 96% del mAb-316P recuperado era de estructura “nativa”, tal y como determinó la exclusión por tamaño y una cantidad mayor al 56% del mAb-316P recuperado era de la “variante con carga principal”, tal y como determinó el intercambio catiónico. Los resultados se resumen en la Tabla 10.

EJEMPLO 10: ESTUDIOS DE ESTABILIDAD FRENTE AL ESTRÉS DE LA SUSTANCIA FARMACOLÓGICA FORMULADA

Se realizaron estudios de estabilidad frente al estrés en la sustancia farmacológica

IMPI formulada mAb-316P de 150 mg/ml (FDS) (0,35 mi

0,5 mi de mAb-316P 150 mg/ml, histidina 10 mM (pH 6,0), polisorbato 20 al 0,2%, sacarosa al 10% ) y la sustancia farmacológica formulada mAb-316P de 175 mg/ml (0,5 mi

1,7 mi de mAb-316P 175 mg/ml, histidina 10 mM (pH 6,0), polisorbato 20 al 0,01%, sacarosa al 5%, arginina 50 mM). Se realizaron estudios a alta temperatura en un cristal de borosilicato Tipo 1 de 2 mi de capacidad, con tapón de goma de butil 4432/50 cubierto de FLUROTEC®; los restantes estudios se realizaron en un vial de policarbonato de 5 mi. La sustancia farmacológica formulada mAb-316P anti-PCSK9 de 150 mg/ml y 175 mg/ml formulada resultó ser física y químicamente estable al ser agitada (agitación vorticial) durante dos horas. La solución permaneció visiblemente transparente, no ocurrió ninguna pérdida de proteínas y no se formó ninguna especie de peso molecular o variantes de carga (Tablas 11 y 12). Se observó además que el mAb-316P era tanto física como químicamente estable cuando se sometía a ocho ciclos de congelación a -80 °C y descongelación a temperatura ambiente. Tras los ocho ciclos de congelación/descongelacíón, la solución de proteínas permaneció visiblemente transparente y no se observó ninguna pérdida de proteínas. No se detectó ningún peso molecular (bien agregados solubles o productos de escisión) ni formas de variantes de carga por medio de los ensayos de SE o CEX, respectivamente.

Aunque la sustancia farmacológica formulada mAb-316P anti-PCSK9 de 150 y 175 mg/ml era físicamente estable al incubarse a 37 °C o 45 °C durante 28 días, no obstante se observó cierta degradación química (Tablas 11 y 12). Estos análisis del estrés indicaron que las secuencias principales de degradación eran la formación de agregados, de productos de escisión y de variantes de carga. Tal y como se esperaba, el índice de · degradación del anticuerpo mAb-316P anti-PCSK9 era menor a 37 °C que a 45 °C. No 4.

hubo ningún cambio significativo en la estabilidad física o química de la sustancia farmacológica mAb-316P de 150 o 175 mg/ml formulada al incubarse a 25 °C durante 28 días.

EJEMPLO 11: ESTABILIDAD DURANTE EL ALMACENAMIENTO DEL PRODUCTO FARMACOLÓGICO (PF)

El producto farmacológico mAb-316P de 150 mg/ml consiste en histidina 10 mM, pH 6,0, polisorbato 20 al 0,01%, sacarosa al 10% y 150 mg/ml del anticuerpo mAb-316P antiPCSK9. El producto farmacológico mAb-316P de 175 mg/ml consiste en histidina 10 mM £

IMPI

OI pH 6,0, polisorbato 20 al 0,01%, sacarosa al 5%, arginina 50 mM y 175 mg/ml del anticuerpo mAb-316P anti-PCSK9. No hubo ningún cambio en la estabilidad .física y química del producto farmacológico mAb-316P de 150 mg/ml ni de 175 mg/ml (PF) al almacenarse a 5 °C durante 6 meses en la jeringa precargada (PFS; jeringa de cristal ¥

OMPI de 1 mi de longitud con una aguja de pared fina de calibre 27 y un capuchón de goma FM27 para la aguja cerrada con un émbolo de goma 4023/50 cubierto de FLUROTEC®) (Tabla 13 y Tabla 14). Las soluciones permanecieron visiblemente transparentes, no se observó ninguna pérdida de proteínas y no se produjo cambio en el pH tras el estrés. Además, no hubo ningún cambio significativo en las especies de peso molecular o en las variantes de carga que pudieran detectarse por SE y CEX respectivamente.

EJEMPLO

12:

ESTABILIDAD

FRENTE

AL

ESTRES

DEL

PRODUCTO

FARMACOLOGICO (PF)

Las estabilidades frente al estrés del producto farmacológico mAb-316P de 150 mg/ml y de 175 mg/ml se examinaron incubando las jeringas precargadas a 25 °C y 45 °C. Cada uno de los respectivos productos farmacológicos era estable físicamente al incubarse a 45 °C durante 28 días o incubarse a 25 °C durante 6 meses (Tablas 13 y 14). La solución permaneció visiblemente transparente, no se observó ninguna pérdida de proteínas y no se produjo cambio en el pH tras dichos episodios de estrés. Sin embargo, se detectaron agregados y variantes de carga cuando la proteína se incubó a 45 °C y 25 °C. Estos análisis de estrés indican que estas son las rutas de degradación principales del producto farmacológico. Del producto farmacológico de 150 mg/ml, el agregado de mAb-316P aumentó un 1,9% y las especies acidas aumentaron un 19,1% tras la incubación a 45 °C durante 28 días. Se detectó un nivel reducido de degradación química cuando la proteína se incubó a 25 °C. Hubo un aumento del 0,8% en la cantidad de agregado relativa y un aumento del 10,3% en las especies acidas tras 6 meses de incubación a 25 °C. Del producto farmacológico de 175 mg/ml, el agregado de mAb-316P aumentó un 1,8% y las especies ácidas aumentaron 17,0% tras la incubación a 45 °C durante 28 días. Se detectó un nivel reducido de degradación química cuando la proteína se incubó a 25 °C. Hubo un aumento del 0,7% de agregados y un aumento del 9,4% de especies ácidas tras 6 meses de incubación a 25 °C. Para los productos farmacológicos tanto de 150 como de 175 mg/ml, no ocurrió ningún cambio significativo en la estabilidad del mAb-316P tras 1 mes de incubación a 25 °C.

£

IMPI uí

EJEMPLO 13: VOLUMENES DE CARGA

El volumen inyectable de una jeringa precargada (PFS) que contiene el producto farmacológico REGN727 de 150 mg/ml es de 1,0 mi. El volumen inyectable de una PFS que contiene el producto farmacológico REGN727 de 175 mg/ml es de 1,14 mi. No se incluye una mayor cantidad en ninguna de las PFS porque el volumen muerto de la jeringa es insignificante (0,005 a 0,01 mi).

EJEMPLO 14: ESTABILIDAD DEL MAB-316P EN MATERIALES DE ALMACENAMIENTO

Se encontró que el mAb-316P anti-PCSK9 era estable cuando se filtraba estéril. Se utilizó una unidad de filtración MILLIPORE MILLIPAK para los estudios de investigación y en la fabricación de los suministros clínicos. Comparado con el almacenamiento en viales de cristal, la estabilidad del sustancia farmacológica mAb-316P de 150 y 175 mg/ml formulada no se vio significativamente afectada cuando se almacenó en un tubo de polipropileno, tubo de poliestireno, tubo de policarbonato o en un vial de cristal que contenía un tapón de acero inoxidable (Tabla 15 y Tabla 16). Aunque se observó cierta degradación cuando la sustancia farmacológica formulada se incubó a 40 °C durante 14 días, no se observó una diferencia significativa en la cantidad de degradación del mAb316P entre el vial de cristal de control y la exposición a los envases de plástico y al acero inoxidable.

EJEMPLO 15: CARACTERIZACIÓN DEL ANTICUERPO MAB-316P ANTI-PCSK9

Se analizaron al menos dos lotes de mAb-316P (Lote 1 y Lote 2) se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaño y dispersión de luz láser multiángulo (SECMALLS), un método analítico que ofrece una estimación de la masa molar de una proteína o glucoproteína. Los lotes 1 y 2 tenían masas molares respectivas de 154,5 y 154,6 kDa. Otros lotes tenían masas molares que variaban de 154,4 a 154,8 kDa (una media de aproximadamente 155 kDa) para el pico de la especie principal eluido de la matriz SE.

Este pico principal representó aproximadamente el 96,7

99,2% del área de pico total de la proteína y corresponde al monómero intacto de mAb-316P (es decir, “nativo tal y como se emplea en esta memoria).

El mAb-316P se analizó por isoelectroenfoque capilar (clEF) para determinar los puntos isoeléctricos de las principales ¡soformas constituyentes. El pl y el área de pico £

IMPI uí promedio (% del área total de pico) de las muestras de mAb-316P determinado por clEF se resumen en la Tabla 17. Cada lote mostró una especie principal (pico 5) con un pl calculado de aproximadamente 8,5, que estaba presente en el 66,4% y 68,0% para los lotes 1 y 2, respectivamente. La especie dominante (pico 5) representa más probablemente el anticuerpo completamente glucosilado intacto al que le falta la lisina C terminal (es decir, la “forma con carga principal” tal y como se usa en la presente memoria).

El análisis de espectrometría de masas (EM) de los mapas trípticos del mAb-316P reducido del Lote 1 y del Lote 2 confirmó un solo sitio de glucosilación, Asn298, en el dominio Fe en ambos lotes. Los principales glucanos unidos por enlace covalente que forman este sitio de glucosilación aparecen resumidos en la Tabla 18. En general, se determinó que ambos lotes poseían glucanos bianntenarios complejos, la mayoría de ellos fucosilados a Asn298. Sin embargo, la cantidad relativa de agalactosilo fucosilado (G0) que contenía especies de cadena de azúcar en el Lote 2 era ligeramente superior en relación a la cantidad de esta glucoforma en el Lote 1. Al contrario, las cantidades relativas de digalactosilo fucosilado (G2) y monogalactosilo fucosilado (G1) que contenían formas de cadena de azúcar en el Lote 2 eran reducidas en comparación con las cantidades relativas de estas estructuras de cadena azúcar en el Lote 1. El análisis de los resultados de LC/MS de las dos muestras de sustancias farmacológicas (pico 16) también identificó un 2,9% y un 8,4% de péptidos de cadena pesada que no tenían ocupación de glucanos en Asn298 en el Lote 1 y en el Lote 2, respectivamente.

Se analizaron los perfiles de los glucanos generados por la HPLC tras la liberación de los oligosacáridos de cada uno de los dos lotes de mAb-316P. En cada cromatograma, los oligosacáridos derivatizados se separaron en dos grupos principales: las especies biantenarias no fucosiladas y las especies biantenarias fucosiladas. Dentro de cada grupo (fucosilado frente a no fucosilado), los oligosacáridos se separaron además en las formas digalactosilo (G2), monogalactosilo (G1) y agalactosilo (G0). Las asignaciones estructurales de oligosacáridos se obtuvieron mediante espectrometría de masas MALDITOF. La integración de cada pico en los dos cromatogramas reveló que el nivel de fucosilación de los dos lotes de mAb-316P era generalmente alto, observándose un 80,0% y un 86,9% de fucosilación en los Lotes 1 y 2, respectivamente.

Aunque el porcentaje total de fucosilación de los dos lotes era similar, hubo diferencias cuantitativas en la abundancia relativa de cada una de las formas de glucanos presentes σι

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL κ>

en los dos lotes (Tabla 19). En el Lote 1, los porcentajes de área de pico de 34,4%, 39,6% y 11,7%, se determinaron por las estructuras de glucano fucosilado G0, G1 y G2, respectivamente. Por otro lado,los porcentajes de área de pico para el Lote 2 fueron 45,8%, 33,3% y 7,1%, para las estructuras de glucoforma fucosilada G0, G1 y G2, respectivamente, indicando diferencias en el grado de galactosilación entre los dos lotes. Se detectó un pico de glucanomanosa (man5 glucano) elevado (pico 2) con una abundancia relativa del 1,8 - 2,9% en relación a la.cantidad total de cadenas de azúcar observadas en los dos lotes (Tabla 19). Se detectó un total de nueve picos no identificados con porcentajes de área de pico con intervalos de 0,5% a 1,5% igualmente en ambos lotes examinados mediante este método y representan &lt;3% de las áreas de pico de glucano total detectadas en cada lote. El análisis de una mezcla equimolar de los dos lotes no produjo nuevos picos y los porcentajes de área de pico de todos los picos en la mezcla se correlacionaron bien con los valores esperados en base a los análisis individuales de cada lote (Tabla 19).

£

IMPI uí

Tabla 1: Efecto del tampón y del pH en la estabilidad del mAb-316P a 45 °C durante 28 días

Total pH/Tampón

Turbidez % Nativo (mg/ml) % Agregado % Principal % Ácido % Básico sin incubación pH 8,0, Tris pH 8,0,

Fosfato pH 7,5,

Fosfato pH 7,0,

Fosfato pH 6,5,

Fosfato pH 6,0,

Fosfato pH 6,0,

Histidina pH 6,0, Succinato pH 6,0,

C ¡trato pH 5,5,

Citrato pH 5,5,

Acetato pH 5,0,

Acetato

0,00

0,00

0,01

0,01

0,01

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

0,00

1,8

1,7

2,0

1,9

2,1

2,0

1,8

1,9

1,9

1,9

2,1

2,0

1.8

98,1

88,9

89,4

91,7

92,4

93,2

93,9

94,5

93,1

95,1

94,6

92,4

93,0

0,3

0,8

1,3

0,9

0,7

0,6

0,3

0,0

0,4

0,4

0,4

0,2

0,2

57,0

15,2

NA

NA

16,7

25,0

29,8

36,9

31,9

32,1

28,0

34,5

31,1

Turbidez = cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida.

Valores medios del material no incubado para las 12 formulaciones

33,0

82,4

NA

NA

78,8

68,3

62,3

54,0

59,8

58,1

62,0

56,9

57,5

10,0

2,4

NA

NA

4,5

6,6

8,0

9,1

8,3

9,9

9,9

8,5

11,4 £

IMPI σι

ΙΌ

Tabla 2: Efecto del pH en 10 mg/ml de mAb-316P, histidína 10 mM a 45 °C durante 28 Días pH/Tampón

Turbidez

Total (mg/ml) % Nativo % Agregado % Principal % Ácido % Básico sin incubación

0,00

9,5

98,1

0,2

57,8

31,1

11,1 pH 5,5 pH 6,0 pH 6,5

0,01

0,01

0,01

9,5

9,7

10,1

94,3

94,7

93,4

0,5

0,9

1,8

34,7

37,5

35,7

Turbidez = cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida.

Valores medios del material no incubado para las 3 formulaciones

52,2

51,8

55,2

13,1

10,6

9,1

Tabla 3: Efecto de los Codisolventes en 25 mg/ml de mAb-316P con agitación vorticial durante 120 Minutos

Codisolvente

Orgánico

Sin agitación vorticial

Turbidez

Total (mg/ml) % Nativo % Agregado % Principal % Acido % Básico

Sin

Cod ¡solvente

0,2%

Polisorbato 20

0,2%

Polisorbato 80

0,00

0,10

0,01

0,01

25,6

97,3

0,5

50,6

39,2

10,3

25,6

24,7

24,7

97,3

97,2

97,3

0,5

0,5

0,5

51,1

51,1

50,9

39,0

38,9

38,9

9,9

10,1

10,2

0,2%

Pluronic F68

0,01

25,2

96,9

0,5

50,5

39,2

10,3

3%

PEG 3350

0,01

25,3

97,1

0,5

50,7

39,0

10,2

1,5%

PEG 3350

0,01

24,9

97,1

0,5

50,8

39,1

10,1

20%

PEG 300

0,00

26,7

97,0

0,6

48,8

40,5

10,7

10%

0,01

25,7

97,2

0,5

49,9

39,8

10,3 £

IMPI

ΟΊ

K)

Tabla 3: Efecto de los Codisolventes en 25 mg/ml de mAb-316P con agitación vorticial durante 120 Minutos

Codisolvente

Orgánico PEG 300

Turbidez

Total (mg/ml) % Nativo % Agregado % Principal % Ácido % Básico

20%

Propilenglicol

0,01

25,8

96,9

0,5

51,1

38,6

10,3

Turbidez = cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida.

Valores medios del material sin agitación vorticial para las 9 formulaciones

Tabla 4: Efecto de los Codisolventes en 25 mg/ml de mAb-316P Incubado a 45 °C durante 28 Días

Codisilvente

Orgánico sin incubación sin

Codisolvente

0,2%

Polisorbato 20

0,2%

Polisorbato 80

0,2%

Pluronic F68

3%

PEG 3350

1,5%

PEG 3350

20%

PEG 300

10%

PEG 300

20%

Propilenglicol

Turbidez

0,00

0,02

0,03

0,02

0,03

0,03

0,02

0,12

0,09

0,03 pH

6,1

6,2

6,2

6,2

6,1

6,2

6,2

4,8

5,4

6,1

Total (mg/ml)

25,6

24,9

24,3

24,3

24,6

24,8

24,4

25,4

25,0

24,6 % Nativo

97,3

94,5

94,6

94,8

94,7

95,0

94,8

88,8

93,7

89,9 % Agregado

0,5

0,7

0,5

0,6

0,6

0,7

0,6

4,2

0,9

5,6 % Principal

50,6

34,8

35,2

35,1

33,8

35,9

36,0

NA

24,1

34,6 % Ácido

39,2

54,7

54,3

54,5

55,6

53,5

53,5

NA

67,0

54,2 % Básico

10,3

10,5

10,5

10,4

10,6

10,6

10,5

NA

8,9

11,2

Turbidez = cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida.

£

IMPI

ΟΊ

NJ

Valores medios del material sin agitación vorticial para las 9 formulaciones

Tabla 5: Efecto del estabilizador en 20 mg/ml de mAb-316P, histidina 10 mM a 45 °C durante 28 días

Excipiente

Visual

Turbidez pH sin incubación

Pasa

0,00

6,0

Total (mg/ml) 20^2 % Nativo

97,7 sin

Estabilizador

NaC1150 mM

20% Sacarosa

20% Sorbitol

10% Manitol

20% Trehalosa

5% Glicerol

3% Arginina

3%Glicina

Pasa

Falla

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

0,02

0,03

0,04

0,16

0,02

0,05

0,10

0,02

0,03

6,1

6,0

6,0

5,8

6,0

6,0

5,9

6,1

6,1

19,8

20,0

22,6

21,8

21,2

22,7

20,8

21,1

19,8

93,6

91,0

94,4

94,3

94,8

94,7

90,2

92,9

93,7 % Agregado

0,5

2,0

4,6

1,0

1,0

0,9

0,5

5,4

3,0

1,7 % Principal

51,1

33,5

35,3

32,1

23,5

34,4

33,2

NA

37,5

31,0 % Ácido

39,3

56,5

51,0

57,0

67,4

54,5

56,6

NA

49,2

58,0 % Básico

9,6

10,1

13,6

10,9

9,1

11,1

10,2

NA

13,3

10,9

Turbidez = cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida.

Valores medios del material no incubado para las 9 formulaciones

Tabla 6: Efecto de los lioprotectores en el mAb-316P incubado a 50 °C durante 28 días

Total

Excipiente

Visual

T urbidez pH (mg/ml)

Nativo

Agregado

Principal %

Ácido

Básico sin incubación sin

Lioprotector

2% Sacarosa

6% Sacarosa

2% Sac., 2%

Gli

2% Sac., 2%

Arg

Pasa

Falla

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

0,00

0,09

0,02

0,00

0,02

0,00

6,0

6,1

6,1

6,1

6,0

5,9

100

100

104

105

114

109

97,1

70,0

90,7

96,1

94,5

95,9

1,2

51,0

38,3

10,7

28,5

24,2

35,1

40,7

7,4

1,8

3,4

2,0

37,4

46,8

40,9

47,2

39,1

39,2

42,4

38,4

23,6

14,1

16,8

14,4

Producto farmacológico liofilizado reconstituido a 100 mg/ml de REGN727 antes del i

Turbidez = cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida.

£

IMPI σι

K) análisis.

Valores medios del material de partida de las 4 formulaciones.

Tabla 7: Estabilidad del Producto farmacológico liofilizado reconstituido a 100 mg/ml

Temperatura

Almacenamiento de

Turbidez pH % Total recuperado % Nativo % Agregado % Principal % Acido % Básico

Bioensayo (% Estd. de ref.)²

Sin

Almacenamiento 0^0

6,2

100

96,0

1,7

50,6

38,0

11,4

146 °C 4 me.

0,01

6,3

104

96,5

1,4

51,5

37,9

10,5

NP °C 3 me. 0,01

6,2

100

96,2

1,7

49,2

38,2

12,7

NP °C me. 0,02

6,2

95,7

2,4

46,2

39,5

14,3

NP °C 2 me. 0,02

6,2

105

94,9

2,9

43,5

40,1

16,2

152

Turbidez = cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida. Criterio de aceptación: 50-200% del estándar de referencia

Tabla 8: Compatibilidad de mAb-316P 50 mg/ml de durante 14 días a 40 °C y 75% de humedad

Almacenamiento

Sin

Almacenamiento

Cristal

Polipropileno

Poliestireno

Policarbonato

Acero inoxidable

Turbidez

0,00

0,00

0,01

0,00

0,01

0,01 % Total % Nativo % Agregado % Principal % Acido % Básico

100

104

103

97,0

2j

96,3

ÜT

96,3

L9~

96,2

96,2

2^

96,1

2^0”

50,8

45,7

44,9

45,2

45,6

45,5

38,1

11,2

42,8

43,6

43,0

42,5

43,2

11,5

11,6

11,9

11,8

11,2

Turbidez - cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida.

£

U1

Tabla 9: Estabilidad de mAb-316P anti-PCSK9 150 mg/ml durante 12 meses a -80 °C

Temperatura de almacenamiento

Turbidez (DO 405 nm) % Total de mAb-316P recuperado % Nativo recuperado % Agregado recuperado % Principal recuperado % Ácido recuperado % Básico recuperado control

-80 °C

-30 °C

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL

-20 °C

0,00

100

97,5

1,7

56,2

26,5

17,4

0,00

104

97,3

1,8

56,5

25,7

17,9

0,01

108

0,01

111

97,2

1,8

56,4

25,7

17,9

97,2

1,9

56,3

25,4

18,2

Tabla 10: Estabilidad de mAb-316P anti-PCSK9 175 mg/ml durante 3 meses a -80 °C

Temperatura de Almacenamiento

Turbidez (DO 405 nm)¹ % Total REGN727 recuperado (RP-HPLC) % Nativo REGN727 recuperado (SE-HPLC) % REGN727 agregado recuperado (SE-HPLC) % REGN727 principal recuperado (CEXHPLC) % REGN727 ácido recuperado (CEX-HPLC) % REGN727 básico recuperado (CEX-HPLC) control

-80 °C

-30 °C

-20 °C

0,00

100

96,2

2,7

58,5

29,4

12,2

0,01

100

0,01

104

0,01

101

96,5

2,5

56,2

29,4

14,5 ¹Turbidez = cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida.

96,4

2,6

96,3

2,7

56,6

56,7

29,4

14,0

29,4

13,9

Tabla 11: Estabilidad de mAb-316P 150 mg/ml FDS¹ en condiciones de estrés

Análisis de Estrés

Tiempo de Estrés Aspecto Visual Turbidez³pH % Total recuperado

Sin Estré s²0 min

Pasa

0,00

6,0

100

Agitación °C

Incubación °C

Incubación °C

Incubación min

120 min días días días días días días

Congelación/ descongelación ciclos

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

0,00

6,0

0,00

6,0

0,02

6,0

0,03

6,0

0,00

6,0

0,01

6,0

0,00

6,0

0,00

6,0

0,00

6,0

101

102

100

101 £

IMPI

ΟΊ

K)

Análisis de Estrés

Sin

Estré Agitación

Tiempo de

Estrés s²

Ó

120 % Nativo recuperado % Agregado recuperado % Principal recuperado % Ácido recuperado min min min

97,4

97,5

97,2

1.6

1.7

2,1

53,6

27,2

53,7

54,7

26,1

25,9 °C Incubación °C Incubación °C Incubación

Congelación/ descongelación días días días días días días ciclos

94,2

92,4

95,7

95,1

96,7

96,2

97,1

3,4

4,1

2,4

2.6

2.0

2.2

1.7

38,7

39,5

29,0

48,6

46,3

31,9

39,5

51,5

49,1

53,9

36,9

27,8

28,9

26,5 % Básico recuperado Bioensayo (% de potencia relativa)⁴

19,3

20,2

NP

19,5

21,8

NP

22,5

21,8

NP

23,7

20,7

NP

22,0

19,6 histidina 10 mM, pH 6,0, polisorbato 20 al 0,2%, sacarosa al 10%, mAb-316P anti

PCSK9 150 mg/ml ²Los valores de ‘sin estrés’ corresponden a medias de ambos estudios de estabilidad.

³La turbidez se presenta como el cambio relativo de DO a 405 nm en comparación con el material de partida

Porcentaje de potencia relativa; Criterio de aceptación: 50-200% del estándar de referencia

Tabla 12: Estabilidad de mAb-316P 175 mg/ml FDS¹ en condiciones de estrés

Análisis de Estrés

Sin

Estrés Agitación

45°C

Incubación

37°C

Incubación

25°C

Incubación

Congelación/ descongelación

Tiempo de

Estrés min min

120 min días días días días días días ciclos

Aspecto

Visual

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

ND

Pasa

Pasa

Turbidez³

0,00

0,00

0,01

0,01

0,03

0,00

0,01

ND

0,00

0,01 pH % Total

6,0

6,0

6,0

6,1

6,1

6,0

6,0

ND

6,0

6,0 recuperado

100

101

100

ND

IMPI

ΟΊ

K)

Tabla 12: Estabilidad de mAb-316P 175 mg/ml FDS¹ en condiciones de estrés

Análisis de Estrés

Sin

Estrés Agitación

45°C Incubación

37°C Incubación

25°C

Incubación

Congelación/ descongelación

Tiempo de Estrés min min

120 min días días días días días días ciclos % Nativo recuperado % Agregado recuperado % Principal recuperado % Ácido

96,5

2,5

59,5

96,3

2,5

58,3

96,4

2,5

59,0

94,5

3,6

47,1

91,7

5,2

38,4

95,7

2,8

56,3

94,7

3,0

46,9

ND

ND

ND

ND

96,2

2,6

58,2

96,1

2,3

59,3 recuperado

30,1

29,3

29,4

39,5

47,6

32,3

39,8

30,9

29,5 % Básico

ND recuperado Bioensayo (% de potencia relativa)⁴

10,3

12,4

11,6

13,4

14,1

11,4

13,4

11,0

11,1

0,00

0,00

0,01

0,01

0,03

0,00

0,01

NA

0,00

0,01 histidina 10 mM, pH 6,0, polisorbato 20 al 0,01%, sacarosa al 5%, arginina 50 mM, mAb316P anti-PCSK9 175 mg/ml.

²Los valores de ‘sin estrés’ son medias de ambos estudios de estabilidad.

³Turbidez = cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida.

Porcentaje de potencia relativa; Criterio de aceptación: 50-200% del estándar de referencia κ

m

Tabla 13: Estabilidad del PF mAb-316P 150 mg/ml en PFS

Almacenamiento °C a 6 me. 25 °C a 6 me. 45 °C a 28 días.

IMPI

INSTITUTO MEXICANO DE LA PROPIEDAD INDUSTRIAL κ>

Aspecto

Turbidez pH % Total recuperado % Nativo recuperado % Agregado recuperado % Principal recuperado % Ácido recuperado % Básico recuperado

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

0,00

6,1

100

0,00

6,1

102

0,00

6,1

102

0,02

6,1

96,6

2,4

58,4

31,8

9,8

96,1

2,6

58,5

31,3

10,2

94,2

3,2

45,7

42,1

12,2

92,4

4,3

35,8

50,9

13,4

Turbidez = cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida.

Tabla 14: Estabilidad del PF mAb-316P 175 mg/ml en PFS

Almacenamiento °C a 6 me. 25 °C a 6 me. 45 °C a 28 días.

Aspecto

Turbidez

Pasa

Pasa

Pasa

Pasa

0.00

0.00

0.02

0.04 pH % Total recuperado % Nativo recuperado % Agregado recuperado % Principal recuperado % Ácido recuperado % Básico recuperado

6.1

100

6.1

6.1

6.1

103

101

100

96,7

2,3

59,1

31,2

9,7

96,3

2,4

59,7

30,6

9,7

94,6

3,0

47,1

40,6

12,3

91,6

5,4

37,7

48,2

14,2 turbidez = cambio en DO a 405 nm en relación al material de partida

Tabla 15: Compatibilidad de mAb-316P¹ 150 mg/ml durante 14 Días a 40 °C

Almacenamiento

Turbidez pH % Total recuperado

Sin Almacenamiento Cristal 0,00

6,0

100

Cristal

0,00

6,1

Policarbonato Polipropileno

Poliestireno

Acero inoxidable

0,00

6,0

0,01

6,0

0,01

6,0

0,01

6,0

104

105

104 £

IMPI σι

ΙΌ % Nativo recuperado % Agregado recuperado % Principal recuperado % Ácido recuperado % Básico recuperado

97,4

95,9

95,8

95,7

95,7

95,5

1,7

2,5

2,6

2,7

2,6

2,7

53,3

26,9

19,8

45,8

45,8

44,7

45,6

45,1

33,0

21,3

32,9

21,6

33,8

21,6

33,0

33,5

21,5

21,4

Histidina 10 mM, pH 6,0, polisorbato 20 0,2%, sacarosa al 10% y mAb 150 mg/ml Turbidez = DO a 405 nm en relación al material de partida.

Tabla 16: Compatibilidad de mAb-316P¹ 175 mg/ml durante 14 Días a 40 °C Sin

Almacenamiento Almacenamiento,

Cristal Policarbonato Polipropileno Poliestireno

Turbidez pH % Total

Cristal

0,00

6,1

0,00

6,1

0,00

6,1

0,00

6,0

0,00

6,1

100

104

100

105 recuperado

Nativo recuperado % Agregado recuperado % Principal recuperado % Ácido recuperado % Básico recuperado

96,6

95,3

95,2

95,1

95,2

2,4

3,0

3,1

3,2

3,1

57,7

30,0

12,3

51,3

34,5

14,2

51,0

50,6

51,0

34,5

35,0

34,5

14,5

14,4

14,4

Acero Inoxidable

0,01

6,1

94,9

3,3

50,4

35,2

14,4 histidina 10 mM, pH 6,0, polisorbato 20 al 0,01%, sacarosa 5%, arginina 50 mM y mAb

175 mg/ml

Turbidez = DO a 405 nm en relación al material de partida.

£

IMPI uí

Tabla 17: Heterogeneidad de la carga de mAb-316P por clEF

Lote 1

Lote 2

Lote 1:Lote 2 (1:1 mezcla)

Pico N° pi

7,99 (0,01)

Area de pico, pi

V —

Area de pico, o/ /o pi

Area de pico, %

8,15(0,00)

8,29 (0,00)

8,42 (0,00)

8,54(0,01)

8,65 (0,00)

8,82 (0,00)

0,8(0,1)

2,6(0,1)

6,9(0,1)

18,4(0,2)

66,4 (0,3)

4,0(0,1)

0,9(0,1)

7,99(0,01)

8,15(0,01)

8,29 (0,00)

8,42 (0,00)

8,55 (0,01)

8,65 (0,00)

8,81 (0,00)

Tabla 18: mAb-316P péptidos glucosilados

Masa observada (Da)

0,8(0,0)

2,6 (0,1)

7,0 (0,0)

18,6 (0,2)

68,0 (0,3)

2,8(0,1)

0,3 (0,1)

7,98 (0,01)

8,14(0,01)

8,28 (0,01)

8,42 (0,01)

8,54 (0,00)

8,64 (0,01)

8,81 (0,01)

0,7(0,1)

2,6 (0,1)

6,9(0,1)

18,5(0,1)

67,3 (0,1)

3,4 (0,0)

0,6 (0,1)

Pico N°

Fragmento de cadena pesada Lote 1

294-302

294-302

294-302

15a

294-302

294-302

2957,15

2795,11

2404,94

2592,02

2267,94

15b

17a

17b

294-302

294-302

294-302

294-302

294-302

294-302

290-302

290-302

290-302

290-302

Lote 2

2957,19

2795,11

2404,94

2591,96

2267,92

Comentarios (FucMGIcNAcHManMGIcNAcHGalk (Fuc^GlcÑ^^ (GlcNAc)₂(Man)₅ (l^ucMGIc^

2121,82

2283,91

2429,98

2486,99

2633,05

1188,52

2121,80

3439,44

3278,40

2887,20

2766,24

2283,91

2429,98

2486,97

2633,06 1188^53 3439,44 (FucMGIcNAcMMan^GIcNAc) (GIcNAc^Man^GIcNAc)!

(GlcNAc)₂(Man)₃(GlcNAc)-i (FÜcMGÍcÑAcj^^ (GlcN Ac)₂( Man )₃(GlcN Ac)₂ (FucMGIcNAcMManMGIcNAck sitio NST no glucosilado (Fuc)₁(GlcNAc)₂(Man)₃(GlcNAc)₂(Gal)₂

3277,35

2887,26

2766,21 (FucMGIcNAcMMan^GIcNAc)^^ (GlcNAc)₂(Man)₅ (GIcNAcMMan^GIcNAc)!

£

IMPI σι

ΙΌ

Tabla 18: mAb-316P péptidos glucosilados

Masa observada (Da)

Pico N°

Fragmento de cadena pesada Lote 1

290-302

2969,34

290-302

290-302

Tabla 19:

Area^a de

2912,28

3115,32

Lote 2

2969,25

2912,25

3115,35

Comentarios (GlcNAc)₂(Man)₃(GlcNAc)₂ (FucMGIcNAcMManMGIcNAch (Fuc)₁(GlcNAc)₂(Man)₃(GlcNÁcj₂

Zonas de pico de glucanos integrados identificado por electroforesis capilar pico

Lote 1, %

8,6 (0,2)

1,8(0,0)

0,7 (0,0)

Por debajo del

LDC

Por debajo del

LDC

34,4 (0,1) '1,5 (0,0)

Por debajo del

LDC

Por debajo del

LDC

29,5(0,1)

Area

Lote 2, de θ/ /o pico

Area de pico de

6,8 (0,1)

2,9(0,1)

0,5 (0,0)

Por debajo del

LDC

Por debajo del

LDC

45,8 (0,2)

0,7 (0,0)

0,9 (0,0)

0,7 (0,0)

24,7 (0,0) mezcla lote 1:1, %

7,6 (0,2)

2,3(0,1)

0,6 (0,0)

Por

LDC

Por

LDC debajo del debajo del

40,4 (0,2)

MM*

1,1(0,0)

0,6 (0,0)

0,6 (0,0)

27,0 (0,1)

Identidad glucano¹

GO-Fuc

Man5

Pico de

Estructura glucano de menor no identificado

Pico menor no identificado

Pico menor no identificado

G0

Mr—T jHb·

Pico menor no identificado

Pico menor no identificado

Pico menor no identificado

G1(1-6) £

IMPI σι

ΙΌ

Tabla 19:

Zonas de pico de glucanos integrados identificado por electroforesis capilar

Área^a

Lote 1, de

O/ /0

10,1 (0,1) pico

Area Lote 2, de o/ /0

8,6 (0,0) pico

Area de pico mezcla lote 1:1, 9,3(0,1) de

Identidad glucano¹ de

G1(1-3) y/o G2Fuc

Estructura glucano

<img file="MX375672B_D0001.tif" />

de

Por debajo del

LDC

Por debajo del

LDC

Por debajo del

LDC

Pico menor no identificado

Por debajo del

LDC

Por debajo del

LDC

Por debajo del

LDC

Pico menor no identificado

11,7 (0,0)

7,1 (0,1)

9,4 (0,2)

G2

G#-fuc y G# hacen referencia a glucanos no fucosilados y fucosilados, respectivamente.

El símbolo # se refiere a 0, 1 o 2.

Clave del glucano: ▼ fucosa, N-acetil glucosamina, · mañosa, ♦ galactosa.

LDC = Limite de Cuantíficación.