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MX2016005302A

Production of recombinant lubricin.

Abstract

New recombinant isoforms of human-type lubricin or PRG4 glycoprotein having excellent lubrication properties and a novel glycosylation pattern, and methods for their manufacture at high levels that allow commercial production are disclosed.

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Expires 22 April 2036.

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31 claims: 26 independent, 5 dependent

  1. 1
    REIVINDICACIONES 1. Un método para fabricar una glicoproteina de 5 lubricina recombinante que comprende los pasos de:cultivar, en un medio, de células de ovario de hámster chino (CHO) tranfectadas con y que expresan el gen PRG4 humano y glicosilar pos-translacionalmente el producto de expresión durante un tiempo y bajo las condiciones de 10 cultivo suficientes para producir una glicoproteina de lubricina que comprende al menos 30% en peso de residuos glicosidicos en una concentración en el medio de al menos 0.4 g/litro, y purificar la glicoproteina de la lubricina de 15 dicho medio.
  2. 2
    El método de conformidad con la reivindicación 1, en donde las células CHO son células CHO-M que comprenden un ácido nucleico que codifica el gen PRG4 humano.
  3. 3
    El método de conformidad con las reivindicaciones 20 1 ó 2, en donde las células CHO son transfectadas con un primer vector que comprende un ácido nucleico que codifica un elemento de la cromatina y un segundo vector que comprende un ácido nucleico que codifica el gen PRG4 humano.
  4. 4
    El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde el elemento de la cromatina es un elemento límite, región de unión de matriz, región de control de locus o un elemento de abertura universal de la cromatina.
  5. 5
    El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde el elemento de la cromatina es una región de unión de matriz.
  6. 6
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde las células están cultivadas durante un tiempo y bajo las condiciones del cultivo suficientes para producir dicha glicoproteína de la lubricina en una concentración en el medio de al menos 0.5 g/litro.
  7. 7
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde las células están cultivadas durante un tiempo y bajo las condiciones del cultivo suficientes para producir dicha glicoproteína de la lubricina en una concentración en el medio de al menos 0.8 g/litro.
  8. 8
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde las células están cultivadas durante un tiempo y bajo las condiciones del cultivo suficientes para producir dicha glicoproteína de la lubricina en una concentración en el medio de al menos 1.0 g/litro.
  9. 9
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde al menos 95% en peso de la glicosilación de la glicoproteina de la lubricina es glicosilación de núcleo 1.
  10. 10
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde al menos 99% en peso de la glicosilación de la glicoproteina de la lubricina es glicosilación de núcleo 1.
  11. 11
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde los residuos glicosidicos se enriquecen en cadenas laterales de sacárido sulfatado en comparación con la lubricina humana nativa.
  12. 12
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la glicoproteina de lubricina comprende una proteina multimérica que produce un coeficiente de fricción estático no mayor de 150% del coeficiente de fricción estático de la lubricina bovina nativa purificada como se midió en una prueba de fricción de cartílago sobre cartílago.
  13. 13
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la glicoproteina de lubricina comprende una proteína multimérica que produce un coeficiente de fricción estático no mayor de 120% del coeficiente de fricción estático de la lubricina bovina -65nativa purificada como se midió en una prueba de fricción de cartílago sobre cartílago.
  14. 14
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde la glicoproteina de lubricina comprende una proteína multimérica que produce un coeficiente de fricción estático no mayor de 110% del coeficiente de fricción estático de la lubricina bovina nativa purificada como se midió en una prueba de fricción de cartílago sobre cartílago.
  15. 15
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde la glicoproteina de la lubricina comprende una especie de lubricina monomérica copurificada de dicho medio de cultivo y en mezcla con una especie de lubricina multimérica.
  16. 16
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde la glicoproteina de la lubricina comprende una especie de lubricina dimérica.
  17. 17
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en donde la glicoproteina de la lubricina comprende por lo menos cinco cadenas de aminoácidos glicosilados individuales asociados de manera no covalente o enlazadas por disulfuro y tiene un peso molecular de al menos 1200 kDa.
  18. 18
    El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde las células se cultivan en al menos 10, 50, o 100 litro de medio.
  19. 19
    El método de conformidad con cualquiera de las 5 reivindicaciones 1-18, en donde glicoproteina de la lubricina comprende por lo menos 35% en peso de residuos glicosidicos.
  20. 20
    La glicoproteina de la lubricina producida por el método de conformidad con cualquiera de las 10 reivindicaciones 1-19.
  21. 21
    Una composición de material que comprende:una glicoproteina de la lubricina multimérica recombinante expresada del gen PRG4 humano en un cultivo de célula huésped, que comprende al menos el 30% en peso de 15 los residuos glicosidicos, y que produce un coeficiente de fricción dinámico no mayor del 150% del coeficiente de fricción dinámico de la lubricina bovina nativa purificada como se midió en una prueba de fricción de cartílago sobre cartílago. 20
  22. 22
    La composición de conformidad con la reivindicación 21, en donde la glicoproteina de la lubricina se caracteriza por producir un coeficiente de fricción dinámico no mayor al 120% del coeficiente de fricción dinámico de la lubricina bovina nativa purificada -67como se midió en una prueba de fricción de cartílago sobre cartílago.
  23. 23
    La composición de conformidad con la reivindicación 21, en donde la glicoproteína de la lubricina se caracteriza por producir un coeficiente de fricción dinámico no mayor al 110% del coeficiente de fricción dinámico de la lubricina bovina nativa purificada como se midió en una prueba de fricción de cartílago sobre cartílago.
  24. 24
    La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-23, en donde la glicoproteína de la lubricina comprende por lo menos 35% en peso de residuos glicosídicos.
  25. 25
    La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-23, en donde la glicoproteína de la lubricina comprende por lo menos 40% en peso de residuos glicosídicos.
  26. 26
    La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-25, en donde al menos 95% en peso de la glicosilación de la glicoproteína de la lubricina es glicosilación de núcleo 1.
  27. 27
    La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-26, en donde los residuos glicosídicos se enriquecen en cadenas laterales de sacárido sulfatado en comparación con la lubricina humana nativa.
  28. 28
    La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-27, que comprende además una especie de lubricina monomérica mezclada con especies de lubricina multimérica. 5
  29. 29
    La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-28, que comprende una especie de lubricina dimérica.
  30. 30
    La composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 21-29, que comprende una especie de 10 lubricina que comprende por lo menos cinco cadenas de aminoácidos glicosilados individuales asociados de manera no covalente o enlazadas por disulfuro que tienen un peso molecular de al menos 1200 kDa.
  31. 31
    La composición de conformidad con cualquiera de 15 las reivindicaciones 21.-30, que comprende además ácido hialurónico o una sal del mismo en mezcla con dicha glicoproteina de la lubricina.
Independent claims31