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IT1127253B

Purified proteins and process therefor

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7 claims: 3 independent, 4 dependent

  1. 1
    RIVENDICAZIONI 1. Interferon come proteina omogenea.
  2. 2
    Interferon omogeneo secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto di essere Interferon umano.
  3. 3
    Interferon umano omogeneo secondo la rivendicazione 2, caratterizzato dal fatto che si tratta di Interferon di leucociti.
  4. 4
    Interferon di leucociti umani omogeneo con la - 38 - Ing. Barzanò Zanardo denominazione α η , il quale è caratterizzato dal fatto ché \...· .·?· · · · · 1 (a) esso viene eluito mediante eluizione a gradienti *.’*·· !.. • · con n-propanolo in un tampone acquoso contenente ·** ·„·*··· ·.. 1 mole di piridina e 2 moli di acido formico per o- ····:.··. ♦ ·· gni litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente»*/ • ... • · · · · * · portata di flusso 0,2 rnl/min), a una concentrazione ....ί ζ·· • · · · tt tttt · · · di 31% di n-propanolo in un unico picco dà- una co***** » · · · * lonna per HPLC di 4,6 x 250 mm a bse di una matrice di Si0 2 modificata con gruppi ottilici;(b) esso non viene disattivato da leucinamminopeptida c si e da amminopeptidasi M;(c) esso viene scisso mediante trattamento con tripsina in frammenti di peptidi, che vengono eluiti mediante eluizione a gradienti della miscela di reazione con n-propanolo in una sostanza-tampone acquosa (pH 3), contenente 0,03 moli di piridina e 0,1 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,
  5. 5
    5 ml/minuto) in picchi in corrispondenza di concentrazioni di 3, 4, 4,2, 11,5, 12,5, 14,5, 16, 18, 20, 21, 22,5 e 29% di n-propanolo da una colonna per HPLC da 4,6 x 250 mm (diametro delle particelle 10 micron) a base di una matrice di SiO^ modificata con gruppi ottilici; e che è inoltre caratterizzato da Zanardo 10 w unite/ - 39 - Ing. Barzanò (d) un amminoacido N-terminale bloccato; (e) una attività specifica di circa 2,6 x /mg su MDBK (cellule di bue); (f) una attività specifica di circa 2,6 x su cellule di Ag 1732 (linea umana) ; .♦·· • « / ** · * (g) un peso molecolare di circa 16.500 + 1000 (elet- φ · 9 « * *·· troforesi su gel su poliacrilammide); ···· • · * « « (h) un contenuto in amminozuccheri inferiore a 1 molò*·*! * z '····* a a a a * per mole; (i) una attività di inibizione della crescita positiva; e (j) la seguente composizione in amminoacidi (+ 15%, calcolato su un peso molecolare di 16.500); • 9 * · · * ··* * _ · ·· 10 unit/mp·;· a* k a · a a a la denominazione a 2 , il quale è caratterizzato dal fatto che esso (a) viene eluito mediante eluizione a gradienti con n-propanolo in una sostanza-tampone acquosa, contenente 1 mole di piridina e 2 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura am- 40 - Ing. Barzanò Zanardo biente, portata di flusso 0,2 ml/minuto, a una concentrazione di 32% di n-propanolo in un unico picco .····. U una colonna HPLC da 4,6 x 250 mm a base di una ma-Λ*.*.. . ··· *··:. trice di SiO^ modificata con gruppi ottilici;• · · · * (b) esso non viene disattivato da leucinammi'nopepti '· • * * * dasi e da amminopeptidasi ’··ί. • · « « (c) esso viene scisso mediante trattamento con trip- ·’··*. • · * sina in frammenti di peptidi, che vengono eluiti me-:.;.. » *···· diante eluizione 1 a gradienti della miscela di rea- ..... zione con n-propanolo in una sostanza-tampone acquosa (pH 3), contenente 0,03 moli di piridina e 0,1 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,5 ml/minuto) in picchi a concentrazioni di 3, 4, 4,2, 11,5, 12,5, 14,5, 16, 18, 27 e 29% di n-propanolo da una colonna-HPLC di 4,6 x 250 mm (diametro delle particelle 10 micron) a base di una matrice di SiO^ modificata con gruppi ottilici;(d) esso viene eluito mediante eluizione a gradienti con n-propanolo in tampone acetato di sodio 1 molare, acquoso (gradiente 72,5-50% v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,25 ml/minuto) con una concentrazione di 68% di n-propanolo in un unico picco da. una colonna HPLC da 4,6 x 250 mm a base di una matrice dì SiO^ modificata con gruppi glicerilici;e - 41 - Ing. Barzanò Zanardo che inoltre è caratterizzato da' (e) un amminoacido N-terminale bloccato;*·.· 8 * *.*·* * (f) una attività specifica di circa 4,0 x 10 unità/ 1 *^;;v * · ··.. su MDBK (cellule di bue);8 / *·’ * * * (g) una attività specifica di circa 3 x 10 unità/mg,··... ··*·* su cellule di Ag 1732 (linea umana);*··*;• · • 4 (h) un peso molecolare di circa 16.200 + 1000 (elet-****· .. · troforesi su gel su poiiacri1ammidé);I.J.. (i) un contenuto in amminozuccheri inferiore a 1 mol*e* ” per mole;(j) una attività di inibizione della crescita positiva e (k) la seguente composizione in amminoacidi (+ 15%, calcolato su un peso molecolare di 16.200): 4 *
  6. 6
    6· Interferon di leucociti umani omogeneo con la denominazione β 2 , il quale è caratterizzato dal fatto che (a) esso viene eluito mediante eluizione a gradienti con n-propanolo in una sostanza-tampone acquosa, con- 42 - Ing e Barzanò Zanardo tenente 1 mole di piridina e 2 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente»·. ·· · · portata di flusso 0,2 ml/minuto), a una concentrazione*· · .:*:* ·· ·. di 32% di n-propanolo in un unico picco da una co* 4 444 lonna-HPLC di 4,6 x 250 mm a base di una matrice di '4 « · · · SiO- modificata con gruppi ottilici;*··:. 2 · 4 4 • · (b) esso non viene disattivato da leucinamminopej) ***** .. · tidasi e da amminopeptidasi M;• 4 4 4 (c) esso viene scisso mediante trattamento con trip-···** sina in frammenti di peptidi, che vengono eluiti mediante eluizione a gradienti della miscela di reazione con n-propanolo in una sostanza-tampone acquosa (pH 3), contenente 0,03 moli di piridina e 0,1 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,5 ml/minuto) in picchi in corrispondenza di concentrazioni di 3, 4, 4,2, 11,5, 12,5, 14,5, 16, 17,5, 18 e 29% di n-propanolo da una colonna-HPLC di 4,6 x 250 mm (diametro delle particelle 10 micron) a base di una matrice di SiO 2 modificata con gruppi ottilici;(d) esso viene eluito mediante eluizione a gradienti con n-propanolo in tampone acetato di sodio acquoso, 1 molare (gradiente 72,5-50% (v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,25 ml/minuto) a una concentrazione di 66,5% in un unico picco da una colonna- 43 - Ing. Barzanò Zanardo HPLC di 4,6 x 250 mm a base di una matrice di SiO^ modificata con gruppi glicerilici;e che inoltre è .... • · • tt · · caratterizzato da . ··* (e) un amminoacido N-terminale bloccato;· (f) una attività specifica di circa 4,0 x 10 unità/W • su MDBK (cellule di bue);·;*·’ • (g) una attività specifica di circa 2 x 10 unitè/mg*····’ su cellule di Ag 1732 (linea umana);f.J.. ' ····* (h) un peso molecolare di circa 16.500 + 1000 (elet—···· troforesi su gel su poliacrilammide);(i) un contenuto in amminozuccheri inferiore a 1 mole per moie;(j) una attività di inibizione di crescita positiva e (k) la seguente composizione in amminoacidi (+ 15%, calcolato su un peso molecolare di 16.500);·· tt tt tt fatto che esso (a) viene eluito mediante eluizione a gradienti con - 44 - Ing* Barzanò Zanardo n-propanólo in una so stanza^- tampone acquosa, contenente 1 «ole di piridina e 2 moli di acido formico .····. • 4 4 · per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambienfcVt·;*“* ·* * ···· ..... portata di flusso 0,2 ml/minuto), a una concentra- ···· ··* · · · 4 ·*···♦ · 4 » zione di 32% di n-propanolo in un unico picco da una.·.*... ,··;* · ·’ * colonna HPLC di 4,6 x 250 mm a base di una matrice ’·♦·· ΐ , I . / · · · · *4 * * * ** di Si0_ modificata mediante gruppi ottilici;£*** ΪΛ. « 4 * * * · (b) non viene disattivato da leucinamminopeptidasi i*i*. I ·«·«, e da amminopeptidasi M;(c) viene scisso mediante trattamento con tripsina in frammenti di peptidi, che vengono eluiti mediante eluizione a gradienti della miscela di reazione con n-propanolo in una sostanza-tampone acquosa (pH 3), contenente 0,03 moli di piridina e 0,1 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,5 ml/minuto) in picchi in corrispondenza di concentrazioni di 3, 4, 4,2, 4,5, 10, 12,5, 14, 14,5, 16, 18, 19,5, 27 e 32% di n-propanolo da una colonna HPLC di 4,6 x 250 mm (diametro delle particelle 10 micron) a base di una matrice di SiO^ modificata -con gruppi ottilici;e che inoltre è caratterizzato da (d) un amminoacido N-terminale bloccato;g (e) una attività specifica di circa 4,0 x 10 unità/mg su MDBK. (cellule di bue);l'ng. Barzanò Zanardo β (£) una attività specifica di circa $ x 10 unità/ms su cellule di Ag 1732 (linea umana);• · · · (g) un peso molecolare di circa 21.000 + 1000 (elet-*·.,·* • · · • » · · · troforesi su gel su poiiacri1ammide);*· ·. (h) un contenuto in amminozuccheri inferiore a 1 mol$;;;· • · * · · :· per mole;···.;.... *··· (ì) un’attività di inibizione di crescita positiva ς .· • · ···· (j) la seguente composizione di ammino'acidi *····. 8· Interferon di leucociti umani omogeneo con la denominazione γ , il quale è caratterizzato dal fatto che esso (a) viene eluito mediante eluizione a gradienti con n-propanolo in una sostanza-tampone acquosa, contenente 1 mole di piridina e 2 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,2 ml/minuto), a una concentrazione di 31% di n-propanolo in un unico picco da una colonna HPLC di 4,6 x 250 mm a base di una matrice di SiO^ modificata con gruppi ottilici;- 46 - Ing· Barzanò Zanardo (b) non viene disattivato da leucinamminopeptidasi e dà amminopeptidasi M;• · · 4 4 4 (c) viene scisso mediante trattamento con tripsina . ···· * t 4 · * in frammenti di peptidi, che vengono eluiti mediante·..;. ;··· • 4 • 4 4 4 4 eluizione a gradienti della miscela di reazione con . ;acquosa ·· n-propanolo in una sostanza-tampone Z(pH 3), conte- . J* * * : · · · nente 0,03 moli di piridina e 0,1 moli di acido for-.· ·. • · 4 * « * * · ♦ · mico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura .·..··. • · 4 4«· ambiente, portata di flusso 0,5 ml/minuto) in picchi...,;» 4 4 4 * in corrispondenza di concentrazioni di 3, 4, 4,2', 4,5, 6,5, 11,5, 12,5, 14,5, 16, 17,5, 18 e 29% di n-propanolo da una colonna-HPLC di 4,6 x 250 mm (diametro delle particelle 10 micron) a base di una matrice dì Si0 2 modificata con gruppi ottilici;e che inoltre è caratterizzato da (d) un aminoacido N-terminale bloccato;β (e) una attività specifica di circa 2,6 x 10 unità/ /mg su MDBK (cellule di bue);g (f) una attività specifica di circa 2 x 10 unitV m 5 su cellule di Ag 1732 (linea umana);(g) un peso molecolare di circa 17*700 + 1000 (elettroforesi su gel su poliacrilammide);(h) un contenuto in animino zuccheri inferiore a 1 mole per mole;(i) una attività di inibizione della crescita posi- 47 ~ Ing. Barzanò Zanardo tiva e (j) la seguente composizione in amminoacidi (+ 15%. calcolato su un peso molecolare di 17*700);• · '· · «tttt - ____ - -____-___________.. -- .. - --___ -ΣΑ tttttttt 4 9· Interferon di leucociti umani omogeneo con la denominazione Y^ , il quale è caratterizzato dal fatto che esso (a) viene eluito mediante eluizione a gradienti con n-propanolo in una sostanza-tampone .acquosa, contenente 1 mole di piridina e 2 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,2 ml/minuto), con una concentrazione di 32% di n-propanolo in un unico picco da una colonna di HPLC di 4,6 x 250 mm a base di una matrice di SiO^ modificata con gruppi ottilici;(b) non viene disattivato da leucinamminopeptidasi e da amminopeptidasi M;(c) viene scisso mediante trattamento con tripsina in frammenti di peptidi, che vengono eluiti mediante eluizione a gradienti della miscela di reazione Ing· Barzémò Zanardo con n-propanolo in una sostanza-tampone acquosa (pH 3), contenente 0,03 moli di piridina e 0,1 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40%(v/v), tempe—ζ.,*· mm una e ratura ambiente, portata di flusso 0,5 ml/minuto) *·· ϊ. • in picchi i/Zv corrispondenza di concentrazioni di ····· • · · ·. 4 :· 3, 4, 4,2, 4,5, 5, 11,5, 12,5, 14,5, 16, 18 e 29% ····: di n-propanolo da una colonna-HPLC di 4,6 x 250 (diametro delle particelle 10 micron) a base di matrice di SiO^ modificata con gruppi ottilici;che inoltre è caratterizzato da ! (d) un amminoacido N-terminale bloccato;(e) una attività specifica di circa 4,0 x 10 unità/ /mg su MDBK (cellule di bue);(f) una attività specifica di circa 1,5 x 10 unitV /mg su cellule di Ag 1732 (linea umana);(g) un peso molecolare di circa 17*700 + 1000 (elettroforesi su gel su poliacrilammide);(h) un contenuto in amminozuccheri inferiore a 1 mole per mole;(i) una attività di inibizione di crescita positiva e (j) la seguente composizione in amminoacidi (+ 15%, calcolato su un peso molecolare di 17*700): ·· · · » • « 4 • _· fc·· • 4 -49 - Ing· Barzanò Zanardo 10. Interferon di leucociti umani omogeneo con la denominazione Yy , il quale è caratterizzata dal fatto che esso (a) viene eluito mediante eluizione a gradienti con .· ·· » 4 ·· · · n-propanolo in una sostanza-tampone acquosa, conte- ;;;;;nente 1 mole di piridina e 2 moli di acido formico ♦ · * · per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,2 ml/minuto), a una concentrazione di 34% di n-propanolo in un unico picco....;da una colonna HPLC di 4,6 x 250 mm a base di una matrice di Si0 2 modificata con gruppi ottilici;(b) non viene disattivato da leucinamminopeptidasi e da awiinopeptidasi M;(c) viene scisso mediante trattamento con tripsina in frammenti di peptidi, che vengono eluiti mediante eluizione a gradienti della miscela di reazione con n-propanolo in una sostanza-tampone acquosi! (pH 3), contenente 0,03 moli di piridina e 0,1 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,5 ml/min.) in picchi a concentrazioni di 3, 4, 4,2, 11,5, 12,5, 13,5, 14,5, 16, 18, 20 e 32% di n-propanolo da una colonna HPLC di 4,6 x 250 mm,( diametro delle particelle 10 micron) a base di una matrice di Sio^ modificata con gruppi ottilici;e che è inoltre ca- 50 - Ing. Barzanò Zanardo ratterizzato da (a) un amminoacido N-terminale bloccató;(e) una attività specifica di circa 3,5 x 10 unità/*·..,.·* SXC ;··· /mg su MDBK (cellule di bue);.;*!* .... • tt 8 t · ··· · (f) una attività specifica di circa 1,5 x 10 unità/····· I . ·.···· · · · 0 · · « · · /mg su cellule di Ag 1732 (linea umana) ;”· **;. ···:. · . ί (g) un peso molecolare di circa 17.200 + 1000 (elet-. .· ··*·* ” tttt·*· •·tt · · *· troforesi su gel su poliacrilammide);***** .... w · tt · (h) un contenuto in amminozuccheri inferiore a 1 mol^.,· tttttttt* per mole;(i) una attività di inibizione di crescita positiva e (j) la seguente composizione in amminoacidi: 11. Interferon di leucociti umani omogeneo con la denominazione Y^ , il quale è caratterizzato dal fatto che esso (a) viene eluito mediante eluizione a gradienti con n-propanolo in una so stanza-tampone acquosa, contenente 1 mole di piridina e 2 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,2 ml/minuto), a una con- 51 - Ing. Barzanò Zanardo centratone di 35% di n-propanolo in un unico picco da una colonna-HPLC di 4,6 x 250 mm a base di una ·· * · a a matrice disio. modificata con gruppi ottilici;.7.7. 2 ··· • · * * (b) non viene disattivato da leucinaiaminopeptidasi * « · · ♦ e da amminopeptidasi M;e che inoltre è caratterizΛ*... a zato da ,·»· a a *· · a (c) un amminoacido N-terminale bloccato;? *, * a a · 8 a a aa a (d) una attività specifica di circa 3,5 x 10 unitVw * » · * aaa aaa **· a a a a a su MDBK (cellule di bue);g (e) una attività specifica di circa 4,0 x 10 unitV /mg su cellule di Ag 1732 (linea umana);(f) un peso molecolare di circa 21.000 + 1000 (elettroforesi su gel su poliacrilammide);(g) un contenuto in amminozuccheri inferiore a 1 mole per mole;(h) una attività di inibizione di crescita positiva e (i) la seguente composizione in amminoacidi (+ 15%, i calcolato su un peso molecolare di 21.000): - 52 - Ing· Barzanò Zanardo 12· Interferon di leucociti umani omogeneo con la denominazione Y c , il quale è caratterizzato dal 2 ·· · · * · • « « · fatto che esso 7.·.·* • · · · • ** (a) viene eluito mediante eluizione a gradienti con ;to · * · * · · · to « n-propanolo in una sostanza-tampone acquosa, conte- , « * * » · ·· · · i · · * nente 1 mole di piridina e 2 moli di acido formico .··;· .·· ··., · * : per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura am- ·*...’· ·., • ♦ · to biente, portata di flusso 0,2 ml/minuto), a una con-.··. · ·*.*·* centrazione di 31% di n-propanolo in un unico picco *'**: da una colonna HPLC di 4,6 x 250 mm a base di una matrice di SiO^ modificata con gruppi ottilici;(b) non viene disattivato da leucinamminopeptidasi e da anminopeptidasi M;(c) viene scisso mediante trattamento con tripsina in frammenti di peptidi, che vengono eluiti mediante eluizione a gradienti della miscela di reazione con n-propanolo in una sostanza-tampone acquosa (pH 3), contenente 0,03 moli di piridina e 0,1 moli di acido formico per litro (gradiente 0-40% (v/v), temperatura ambiente, portata di flusso 0,5 ml/minuto) in picchi a concentrazioni di 3, 4, 4,2, 4,5, 7, 7,5, 10, 11,5, 12,5, 14, 14,5, 16, 18, 24,5, 25,5 e 32% di n-propanolo da una colonna-HPLC di 4,6 x 250 mm (diametro delle particelle 10 micron) a base di una matrice di SiO^ modificata con gruppi ottilici;e - 53 - Ing. Barzanò Zanardo V.-. che inoltre è caratterizzato da (d) un aroninoacido N-terminale bloccato;·· · · 8 *· ·* (e) una attività specifica di circa 0,9 x 10 unitV • · · · · • · ·· /mg su MDBK (cellule di bue);*·*:, • (f) una attività specifica di circa 2 x 10 unità/ m EJ su cellule di Ag 1732 (linea umana);...;· ·· ·. (g) un peso molecolare di circa 16.500 + 1000 (elet-.· ζ » troforesi su gel su poliacrilammide);.... · (h) un contenuto in amminozuccheri inferiore a 1 molè·· per mole;(i) una attività di inibizione di crescita positiva e (j) la seguente composizione in amminoacidi: « • · · ··· * · • · ♦ dicazioni da 1 a 12 come sostanza attiva antivirale. 15. Interferon omogeneo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 12 come sostanza attiva antitumorale - 54 - Ing. Barzanò Zanardo 16. Interferon omogeneo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 12 come sostanza attiva che inibisce la crescita. 17. Interferon omogeneo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 12 come sostanza attiva immunosoppressiva. *44* • 4* * • 4 * · » · ·* 18. Procedimento per la purificazione di protei-.* *44· ne aventi un peso molecolare superiore a circa 12.00Cl F · 4 · caratterizzato dal fatto che si fa passare una so- ····· »«*·· luzione acquosa della proteina non pura attraverso a una colonna equilibrata con una sostanza-tampone, a base di una matrice di SiO^ porosa modificata con gruppi cian-propilici, cicloesilici, fenilici, ottilici, ottadecilici oppure glicerilici in condizioni di HPLC, in cui la proteina dapprima viene adsorbita e, quindi, viene eluita con un gradiente crescente o con un gradiente decrescente di un solvente miscibile con acqua in modo che essa, alla fine, viene ottenuta in determinate frazioni dell'eluato in forma più pura. 19. Procedimento per la purificazione di proteine aventi un peso molecolare superiore a circa 12.000, caratterizzato dal fatto che si fa passare una soluzione acquosa della proteina non pura attraverso a una colonna equilibrata con una sostanza-tampone, 4 4 4 4 4 4 4 • ♦ · 4 4 4 4 «4* 4 4 4 · • 4 4« 4 4 4 4 - 55 - Ing· Barzanò Zanardo a base di una matrice di Si0 2 porosa modificata con gruppi ottilici odiare con gruppi glicerilici in con« · · · • · dizioni di HPLC, in cui la proteina dapprima viene ·*’.*.*. ·*··*· * ·· adsorbita e quindi viene eluita con un gradiente *··:, crescente oppure con un gradiente decrescente di un JUZI 1· to · · · « solvente miscibile con acqua in modo che essa, al- ....· ·· * to * la P-fn*, viene ottenuta in determinate frazioni · · to · dell'eluato in forma più pura· .. · • » » · · to 20.Procedimento per la preparazione di Interferoh**·· come proteina omogenea, caratterizzato dal fatto che A) si fa passare una soluzione acquosa di Interferon, nello stato non puro, in condizioni di HPLC, attraverso a una colonna equilibrata con una sostan za-tai»pone a base di una matrice di SiO^ modificata con gruppi ottilici, in cui 1'Interferon dapprima viene adsorbito e quindi viene eluito con un gradiente crescente di un solvente miscibile con acqua in una sostanza-tampone in modo che esso viene ottenuto in determinate frazioni dell’eluato in forma più pura;B) si fanno passare queste frazioni determinate ottenute nella fase A) attraverso a una colonna equilibrata con una sostanza-tampone a base di una matrice di SiO^ modificata con gruppi glicerilici, in cui 1’Interferon viene dapprima adsorbito e quindi to - 56 - Ing. Barzanò Zanardo viene eluito con un gradiente decrescente di un solvente miscibile con acqua in una sostanza-tampone, ·· ♦ · • · in modo che esso viene ottenuto, in picchi principali·/.·.·· ····« · · · · *·** ?*·* ben marcati, in determinate frazioni dell’eluato in ’···· · * 9 · a a • » · a · · forma più pura;·.·.··· ····;·... C) si fanno passare chieste frazioni ottenute nella ..·;· ***. **;* · · • « 9 9 9 9 fase B), che corrispondono ai picchi principali ben ·,,,.· ,··..· * · a a · marcati, in condizioni di HPLC, attraverso a una co-.··. · f.\;lonna equilibrata con una sostanza-tampone a base .‘**1 di una matrice di Si0 2 modificata con gruppi ottilici, in cui l’Interferon dapprima viene adsorbito e quindi viene eluito con una miscela di un solvente miscibile con acqua e di una so stanza-tampone acquosa, in modo che lo si ottiene in un unico picco ben marcato in determinate frazioni dell’eluato sotto forma di proteina omogenea ed eventualmente si ripete la fase C) allo scopo di raggiungere un grado di purezza estremamente elevato del prodotto. 21. Procedimento secondo la rivendicazione 20, caratterizzato dal fatto che si parte da Interferon umano. 22. Procedimento secondo la rivendicazione 21, caratterizzato dal fatto che si parte da Interferon di leucociti. 23. Procedimento secondo la rivendicazione 22, - 57 - Ing. Barzanò Zanardo caratterizzato dal fatto che, come solvente miscibile con acqua, si impiega un alcanolo oppure un etere ciclico· .7.’.. ···· 24· Procedimento secondo la rivendicazione 23, ·;*·' ;··· • · • toto » · caratterizzato dal fatto che, come solvente miscibile”··’ Z . *····*-.· ···· con acqua, si impiega n-propanolo, nella fase A) si *;· ;· ,. . · · · · impiega una sostanza-tampone avente un pH di circa .· . ···· * · · · ·* * · • · · · ·
  7. 7
    7,5 e nella fase b) si impiega una sostanza-tampone *“*; .. · toto · · to to avente un pH di circa 4,0· ····* • · · * * 25· Procedimento secondo la rivendicazione 24, caratterizzato dal fatto che, nel caso della sostan za-tampone impiegata nella fase A), si tratta di acetato di sodio 1 Vi/acido acetico e il gradiente di n-propanolo sale da 0 a 40% (v/v), caratterizzato dal fatto che, nel caso della sostanza-tampone impiegata nella fase b), si tratta di acetato di sodio 0,1 M e il gradiente di n-propanolo diminuisce da 72,5% a 50% (v/v) e caratterizzato dal fatto che, nel caso della sostanza-tampone impiegata nella fase C), si tratta di piridina 1 M/acido formico 2 M e viene regolato un gradiente di n-propanolo che sale da 20% a 40% (v/v). 26· Procedimento secondo la rivendicazione 25, caratterizzato dal fatto che le frazioni determinate, attribuite ai picchi principali ben marcati, ven- 58 gono raccolte, il n-propanolo viene allontanato mediante estrazione con n-esano e, prima della fase C) tracce di n-esano vengono allontanate dalla fase ac- .... ·· · · quosa· ···· I·.. ··.. · 27· Prodotto medicinale a base di un Interferon ; • ♦ · · · 4 • · ♦ · · · · * . ···♦·· 4« omogeneo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 12. ···· ···:«... ,··· .·· 28« Prodotto antivirale a base di un Interferon · · • * · · . . * · · · t ..... omogeneo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 12. ···, ***** ·*·· •4 * · · · 29. Prodotto antitumorale a base di un Interferoni,;.. ···· ····. omogeneo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 12...... 30. Prodotto che inibisce la crescita a base di un Interferon omogeneo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 12. 31. Prodotto immunosoppressivo a base di un Interferon omogeneo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 12 · 32. Impiego di un Interferon omogeneo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 12 nella terapia oppure nella profilassi di malattie. 33. Impiego di un Interferon omogeneo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 12 nella terapia oppure nella profilassi di infezioni virali, 34. Impiego di un Interferon omogeneo secondo una delle rivendicazioni da 1 a 12 nella terapia oppure nella profilassi di tumori / 4927/COP/vr/ . V'-— ,: «/ Rugante ,essin«oj Ì1Ì2 Ul lS ING. BARZANÒ' ZANARDO S.p.A.
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