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ES2278043T3

Universal multi-variant detection system

Abstract

A primer extension chain reaction method for determining the presence of a target nucleic acid molecule in a sample, the method comprising: (a) hybridizing a reverse primer with the target nucleic acid molecule under conditions suitable for carrying out a primer extension chain reaction; (b) extending the reverse primer using the target nucleic acid molecule as a template to form a reverse primer extension product, wherein the reverse primer attached to the reverse primer extension product constitutes a reverse primer amplification product; (c) denature the inverse primer amplification product from its template; (d) hybridize a direct primer with: (i) a nucleic acid molecule that is complementary to the target nucleic acid molecule, if present; or (ii) the reverse primer amplification product.

ES2278043T3, drawing sheet 1
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  1. 1
    ES 2 278 043 T3 REIVINDICACIONES 1. Un método de reacción de cadena de extensión de cebador para determinar la presencia de una molécula de ácido nucleico objetivo en una muestra, comprendiendo el método:(a) hibridar un cebador inverso con la molécula de ácido nucleico objetivo bajo condiciones adecuadas para llevar a cabo una reacción de cadena de extensión de cebador;(b) extender el cebador inverso utilizando la molécula de ácido nucleico objetivo como plantilla para formar un producto de extensión de cebador inverso, en el que el cebador inverso unido al producto de extensión de cebador inverso constituye un producto de amplificación de cebador inverso;(c) desnaturalizar el producto de amplificación de cebador inverso a partir de su plantilla;(d) hibridar un cebador directo con: (i) una molécula de ácido nucleico que es complementario a la molécula de ácido nucleico objetivo, si se encuentra presente;o (ii) el producto de amplificación de cebador inverso;(e) extender el cebador directo utilizando la molécula de ácido nucleico objetivo complementaria, si está presente, o el producto de amplificación de cebador inverso, como plantilla, en el que el cebador directo unido al producto de extensión de cebador directo constituye un producto de amplificación de cebador directo;(f) desnaturalizar el producto de amplificación de cebador directo a partir de su plantilla;(g) hibridar el cebador inverso con el producto de amplificación del cebador directo;(h) extender el cebador inverso utilizando el producto de amplificación de cebador directo como plantilla para formar un producto de extensión de cebador inverso adicional, en el que el cebador inverso unido al producto de extensión de cebador inverso adicional constituye un producto de amplificación de cebador inverso adicional;(i) desnaturalizar el producto de amplificación de cebador inverso adicional a partir de su plantilla;(j) hibridar el cebador directo con el producto de amplificación de cebador inverso;(k) extender el cebador directo, utilizando el producto de amplificación de cebador inverso como plantilla para formar un producto de extensión de cebador directo adicional, en el que el cebador directo unido al producto de extensión de cebador directo adicional constituye un producto de amplificación de cebador directo adicional;(l) desnaturalizar el producto de amplificación de cebador directo adicional a partir de su plantilla;(m) repetir las etapas (g) a (l) utilizando el producto de amplificación de cebador inverso adicional y el producto de amplificación de cebador directo adicional como plantillas para el cebador directo y el cebador inverso, respectivamente, un número de veces suficiente para producir una cantidad detectable de producto de amplificación de cebador inverso adicional o de producto de amplificación de cebador directo adicional, y (n) detectar la presencia del producto de amplificación de cebador inverso adicional o del producto de amplificación de cebador directo adicional;en el que el nucleótido presente en el extremo 3' del cebador inverso se híbrida con: (i) el nucleótido del extremo 5' del producto de extensión de cebador directo del producto de extensión de cebador directo adicional, o (ii) un nucleótido separado del nucleótido presente en el extremo 5' del producto de extensión de cebador directo o del producto de extensión de cebador directo adicional, por una distancia de separación de nucleótidos, en el que la distancia de separación comprende una secuencia que se sabe que está altamente conservada, y en el que el espacio de separación comprende desde alrededor de uno hasta alrededor de cinco nucleótidos, y en el que el nucleótido presente en el extremo 3' del cebador directo hibrida con: (i) el nucleótido del extremo 5' del producto de extensión de cebador inverso o del producto de extensión de cebador inverso adicional, o (ii) un nucleótido separado del nucleótido que está en el extremo 5' del producto de extensión de cebador inverso o del producto de extensión de cebador inverso adicional, por un espacio de separación de nucleótidos, en el que el ES 2 278 043 T3 espacio de separación comprende una secuencia que se sabe que está altamente conservada, y en el que el espacio de separación comprende desde alrededor de uno hasta alrededor de cinco nucleótidos.
  2. 2
    El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las moléculas de ácido nucleico objetivo se sabe que tienen secuencias variables.
  3. 3
    El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la reacción de cadena de extensión de cebador es una reacción de cadena de polimerasa (PCR).
  4. 4
    El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la molécula de ácido nucleico objetivo es un virus.
  5. 5
    El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el virus es el virus de inmunodeficiencia humana (VIH).
  6. 6
    El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el virus es del virus de la hepatitis C (HCV) o el virus de la hepatitis B (HBV).
  7. 7
    El método de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el espacio de separación comprende una región altamente conservada del genoma del virus.
  8. 8
    El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el espacio de separación comprende alrededor de dos nucleótidos.
  9. 9
    El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la molécula de ácido nucleico que es complementario a la molécula de ácido nucleico objetivo de la etapa (d)(i), se proporciona por separado como cADN de la molécula de ácido nucleico objetivo.
  10. 10
    El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que detectar la presencia del producto de amplificación de cebador inverso adicional o del producto de amplificación de cebador directo adicional, comprende:(A) proporcionar una sonda generadora de señal auto-alterable, en el que la sonda comprende: (i) una primera secuencia de ácido nucleico unida a una mitad informadora capacitada para generar una señal detectable;(ii) una segunda secuencia de ácido nucleico que: (a) es complementario a la primera secuencia de ácido nucleico, y (b) está unida a una mitad interactiva capacitada para alterar la señal de la mitad informadora cuando la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico se hibridan cada una con la otra, y (iii) una secuencia de sonda que conecta la primera secuencia de ácido nucleico y la segunda secuencia de ácido nucleico;en la que la secuencia de sonda comprende cualquiera de: (a) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo, o (b) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso, y (B) poner en contacto los productos de amplificación con la sonda;en el que, cuando la secuencia de sonda de la sonda hibrida con el producto de amplificación de cebador inverso adicional o con el producto de amplificación de cebador directo adicional, la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico resultan desnaturalizadas, generando con ello una señal por medio de la mitad informadora, y en el que la señal generada por la mitad informadora indica la presencia de la molécula objetivo.
  11. 11
    El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia de sonda comprende una cualquiera de:(a) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo, y no la secuencia de nucleótido de un segmento que es complementario al cebador inverso, o (b) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso, y no la secuencia de nucleótido de un segmento que es complementario al cebador directo.
  12. 12
    El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia de sonda comprende una cualquiera de:ES 2 278 043 T3 (a) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo y la secuencia de nucleótido de un segmento que es complementario al cebador inverso, o (b) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso y la secuencia de nucleótido de un segmento que es complementario al cebador directo.
  13. 13
    El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el nivel de señal detectable generada por la sonda, es proporcional a la cantidad de moléculas de ácido nucleico objetivo que hay en la muestra.
  14. 14
    El método de acuerdo con la reivindicación 12, en el que alrededor del sesenta hasta alrededor del noventa y cinco por ciento de la secuencia de sonda, comprende una cualquiera de:(i) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo, o (ii) la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso.
  15. 15
    El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que:si la secuencia de sonda comprende la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador inverso, la relación molar entre el cebador inverso y el cebador directo está comprendida en la gama de alrededor de 1:5 hasta alrededor de 1:20, o si la secuencia de sonda comprende la secuencia de nucleótido de un segmento del cebador directo, la relación molar del cebador directo con respecto al cebador inverso está comprendida en la gama de alrededor de 1:5 hasta alrededor de 1:20.
  16. 16
    El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la secuencia de sonda comprende entre alrededor de diez y alrededor de treinta residuos de nucleótido.
  17. 17
    El método de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la secuencia de sonda comprende desde alrededor de dieciocho hasta alrededor de veinticuatro residuos de nucleótido.
  18. 18
    El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la señal detectable es una señal luminiscente.
  19. 19
    El método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la señal luminiscente es una señal fluorescente.
  20. 20
    El método de acuerdo con la reivindicación 18, en el que la señal luminiscente es una señal quimiluminiscente.
  21. 21
    El método de la reivindicación 10, en el que la mitad informadora está unida a la terminación 5' o a la terminación 3' de la sonda generadora de señal auto-alterable.
  22. 22
    El método de la reivindicación 10, en el que la mitad interactiva está unida a la terminación 5' o a la terminación 3' de la sonda generadora de señal auto-alterable.
  23. 23
    El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la mitad informadora es un fluoróforo.
  24. 24
    El método de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el fluoróforo es un tinte de xanteno, un tinte de cianina, un derivado de dansil, EDANS, cumarina, lucífero amarillo, BODIPY, Cy3, Cy5, Cy7, Texas red®, eritrosina, naftilamina, Oregón green®, o combinaciones de los mismos.
  25. 25
    El método de acuerdo con la reivindicación 24, en el que el tinte de xanteno es una fluoresceína o una rodamina.
  26. 26
    El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la fluoresceína se elige en el grupo consistente en 5carboxifluoresceína (5-FAM);6-carboxifluoresceína (6-FAM);2',4',1,4-tetraclorofluoresceína (TET);2',4',5',7',1,4hexaclorofluoresceína (HEX);eosina;verde de calcio, y NED.
  27. 27
    El método de acuerdo con la reivindicación 25, en el que la rodamina se elige en el grupo consistente en tetrametil-6-carboxirodamina (TMRA);tetrapropano-6-carboxirodamina (ROX);2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxirodamina (JOE), y tetrametilrodamina.
  28. 28
    El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la mitad interactiva es un extinguidor.
  29. 29
    El método de acuerdo con la reivindicación 28, en el que el extinguidor es DABCYL, antroquinona, nitrotiazol, nitroimidazol o verde malaquita.
  30. 30
    El método de acuerdo con la reivindicación 29, en el que el DABCYL es DABSYL, DABMI o rojo de metilo.
  31. 31
    El método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la mitad interactiva es un fluoróforo. ES 2 278 043 T3
  32. 32
    El método de la reivindicación 1, en el que los productos de amplificación son medidos y cuantificados mediante análisis a punto final.
  33. 33
    El método de la reivindicación 1, en el que los productos de amplificación se miden y se cuantifican mediante análisis en tiempo real.
  34. 34
    El método de la reivindicación 1, en el que los productos de amplificación son medidos con la utilización de una curva estándar derivada de una serie de mediciones de ciclo de umbral.
  35. 35
    Un kit para la detección de moléculas de ácido nucléico objetivo presentes en una muestra, en el que se sabe que las moléculas de ácido nucleico objetivo tienen secuencias variables, que comprende:(i) un conjunto de cebadores útiles para el método de la reivindicación 1;(ii) reactivos para llevar a cabo la reacción de cadena de extensión de cebador, y (iii) una sonda generadora de señal auto-alterable, que detecta la presencia de productos de amplificación de cebador, en el que la sonda comprende una primera secuencia de ácido nucleico unida a una mitad informadora capaz de generar una señal detectable;una segunda secuencia de ácido nucleico unida a una mitad interactiva capaz de alterar la señal de la mitad informadora;y una secuencia de sonda que conecta la primera y la segunda secuencias de ácido nucleico.
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