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ES2275451T3

Nucleotide sequences derived from the genomes of the retroviruses HIV-1, HIV-2 and SIV, and their application to the amplification of pol sequences in these viral genomes and to the in vitro diagnosis of infections resulting from these viruses

Abstract

Oligonucleotide characterized in that its sequence consists of: i) a specific sequence of the gag or pol gene, and capable of hybridizing at a temperature of 60 ° C to 1 ° C with the genomes of HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli viruses , HIV-2 Rod or VIS Mac, or ii) a complementary sequence of a sequence as defined in i.

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13 claims: 3 independent, 10 dependent

  1. 1
    ES 2 275 451 T3 REIVINDICACIONES 1. Oligonucleótido específico del gen gag elegido entre:- 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' - 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' - 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' - 5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3' - 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3' - 5'-CAT CAA GCA GCC ATGCAA AG-3' - 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3' - 5'-AGG GCT GTT GGA AATGTGG-3' - 5'-AGG GCT GTT GGA AGTGTGG-3' - 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5” - 3'-TGC CCA CACTAT ATG TTT TA-5' - 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' - 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5' - 3'-CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' - 3'-CTC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5' - 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5' - 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5' - 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'
  2. 2
    Oligonucleótido complementario de un oligonucleótido tal como se define en la reivindicación 1.
  3. 3
    Par de cebadores oligonucleotídicos para la puesta en práctica de una amplificación génica del gen gag de virus del tipo VIH-1, VIH-2 y VIS, consistiendo cada uno de los cebadores en:i) una secuencia específica del gen gag, y susceptible de hibridar a una temperatura de 60°C± 1°C con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac, o ii) una secuencia complementaria de una secuencia tal como se define en i).
  4. 4
    Par de cebadores según la reivindicación 3, caracterizado porque la secuencia de al menos un cebador oligonucleotídico está modificada con respecto a la secuencia del gen gag de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod o VIS Mac y mantiene las propiedades de hibridación con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y VIS Mac.
  5. 5
    Par de cebadores según la reivindicación 3 para la puesta en práctica de una amplificación génica del gen gag de virus de tipo VIH-1, VIH-2 y SIV, consistiendo los cebadores en:i. al menos una mezcla elegida del siguiente grupo de mezclas de secuencias con sentido: Mmy1: mezcla constituida por las secuencias 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3', 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' ES 2 275 451 T3 MMy2: mezcla constituida por las secuencias 5’-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3’ 5’-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3’, 5’-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3’, MMy4bis: mezcla constituida por las secuencias 5’-CAT CAA GCA GCC AGT CAA AG-3’, 5’-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3’, MMy28: mezcla constituida por las secuencias 5’-AGG GCT GTT GGA AAT GTG G-3’, 5’-AGG GCT GTT GGA AGT GTG G-3’, y al menos una mezcla elegida del siguiente grupo de mezclas de secuencias antisentido: MMy3: mezcla constituida por las secuencias 3’-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5’, 3’-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5’, MMy4: mezcla constituida por las secuencias 3’-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5’, 3’-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5’, MMy4B: mezcla constituida por las secuencias: 3’-CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5’, 3’-CTC TGC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5’, MMy28bis: mezcla constituida por las secuencias 3’-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5’, 3’-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5’, 3’-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5’.
  6. 6
    Par de cebadores según la reivindicación 5 para la puesta en práctica de una amplificación génica del gen gag de virus de tipo VIH-1, VIH-2 o VIS, consistente en:i) MMy1-MMy3:_ 5’-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3’ 5’-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3’ 3’-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5” 3’-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5’ ES 2 275 451 T3 ii) MMy1-Mmy4:_ 5’-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3’ 5’-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3’ 3’-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5’ 3’-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5’ iii) MMy2-MMy4:_ 5’-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3’ 5’-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3’ 5’-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3’ 3’-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5’ 3’-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5’ iv) MMy4Bbis-Mmy28bis:_ 5’-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3’ 5’-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3’ 3’-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5’ 3’-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5’ 3’-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5’
  7. 7
    Oligonucleótido o par de cebadores según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, susceptible de hibridar con los genomas de los virus VIH-1 Bru, VIH-1 Mal, VIH-1 Eli, VIH-2 Rod y VIS Mac en un tampón de composición Tris-HCl 50 mM, pH 8,9, (NH 4 ) 2 SO 4 15 mM, MgCl 2 5 mM, β-mercaptoetanol 10 mM, gelatina 0,25 mg/ml.
  8. 8
    Procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas del gen gag de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIS, realizado a partir de una muestra biológica, comprendiendo este procedimiento principalmente las siguientes etapas:a) una etapa de extracción del ácido nucleico que se va a detectar perteneciente al genoma del virus de tipo VIH-1, VIH-2 o VIS, eventualmente presente en la muestra biológica anteriormente citada y, en su caso, una etapa de tratamiento con ayuda de una transcriptasa inversa de dicho ácido nucleico si este último está en forma de ARN, b) un ciclo que comprende las siguientes etapas: - desnaturalización del ácido nucleico bicatenario que se va a detectar, lo que conduce a la formación de un ácido nucleico monocatenario, - hibridación de cada una de las cadenas de ácido nucleico obtenidas en la etapa de desnaturalización precedente con al menos un cebador o un par de cebadores según una de las reivindicaciones 1 a 7, mediante la puesta en contacto de las cadenas anteriormente citadas con al menos un par de los cebadores anteriormente citados, - formación a partir de los cebadores de ADN complementarios con las cadenas con las que hibridan en presencia de una ADN polimerasa y de cuatro trifosfatos de nucleósidos (dNTP) diferentes, lo que conduce a la formación de un número mayor de ácidos nucleicos bicatenarios que no se van a detectar más que en la etapa de desnaturalización precedente, repitiéndose este ciclo un número determinado de veces para obtener dicha secuencia nucleica que se va a detectar eventualmente presente en la muestra biológica en una proporción suficiente para permitir su detección, c) una etapa de detección de la eventual presencia del ácido nucleico que pertenece al genoma del virus de tipo VIH-1, VIH-2 y/o VIS en la muestra biológica. ES 2 275 451 T3
  9. 9
    Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la etapa de desnaturalización se realiza en presencia del (o de los) par(es) de cebadores según una de las reivindicaciones 1 a 7.
  10. 10
    Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque se realiza en las siguientes condiciones:a) hibridación: se ponen los cebadores (1 pl de una solución 40 pmolar de cada cebador) en presencia de matriz de ADN (100 a 300 ng) para la primera etapa de desnaturalización-reasociación;se calienta durante 10 minutos a 100°C, después se sumergen los tubos que contienen esta mezcla de matriz de ADN y de cebadores en agua que contiene hielo. Los cebadores se deben utilizar a una concentración final en la siguiente etapa de amplificación de 0,8 pM cada uno;b) amplificación: se añaden al medio precedente los 4 dNTP, utilizándose cada uno a 0,5 pmolar en la solución final (50 pl), y una unidad de Taq polimerasa para un medio de reacción de 50 pl.
  11. 11
    Aplicación del procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 en el diagnóstico in vitro de infección de un individuo por un virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 o de un animal por al menos uno de los tres virus (VIH-1, VIH-2, VIS).
  12. 12
    Kit para la puesta en práctica de un procedimiento de amplificación génica de secuencias nucleicas del gen gag de virus del tipo VIH-1 y/o VIH-2, y/o SIV realizado a partir de una muestra biológica que comprende:i) al menos un cebador o un par de cebadores oligonucleotídicos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a7, ii) reactivos apropiados para la puesta en práctica del ciclo de operaciones de amplificación, especialmente ADN polimerasa, cuatro trifosfatos de nucleótidos diferentes y el tampón 10 x buffer tal como se describe en la reivindicación 10, iii) una (o más) sondas, que puede estar marcada, capaz de hibridar con la(s) secuencia(s) de ácido nucleico amplificada(s) que se van a detectar.
  13. 13
    Utilización de al menos un cebador o de un par de cebadores según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la amplificación génica de secuencias nucleicas del gen gag de virus de tipo VIH-1 y/o VIH-2 y/o VIS.
Independent claims13